GB5009.25-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中雜色曲霉素的測(cè)定.pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B5 0 0 9 .2 52 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中雜色曲霉素的測(cè)定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.2 52 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B/T5 0 0 9.2 52 0 0 3 植物性食品中雜色曲霉素的測(cè)定 和S N/T2 4 8 32 0 1 0 進(jìn)出口糧谷中柄曲霉素含量檢測(cè)方法 液相色譜法 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B/T5 0 0 9.2 52 0 0 3相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“ 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中雜色曲霉素的測(cè)定” ; 增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法; 增加了液相色譜法。G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中雜色曲霉素的測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜法測(cè)定雜色曲霉素的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大米、 玉米、 小麥、 黃豆及花生中雜色曲霉素的測(cè)定。第一法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法2 原理試樣中的雜色曲霉素乙腈-水溶液提取, 經(jīng)渦旋、 超聲、 離心, 取上清液經(jīng)稀釋, 通過(guò)固相萃取柱或免疫親和柱凈化、 濃縮、 甲醇-水溶液定容、 微孔濾膜過(guò)濾, 液相色譜分離, 電噴霧離子源離子化, 多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)檢測(cè), 同位素內(nèi)標(biāo)法定量。3 試劑和材料除非另有說(shuō)明, 本方法使用的試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 乙腈(CH3C N) : 色譜純。3.1.2 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.3 氯化鈉(N a C l) 。3.1.4 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。3.1.5 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。3.1.6 鹽酸。3.1.7 氯化鉀(K C l) 。3.2 試劑配制3.2.1 乙腈-水溶液(8 0+2 0) : 取8 0 0m L乙腈, 加2 0 0m L水, 混勻。3.2.2 乙腈-水溶液(4 0+6 0) : 取4 0 0m L乙腈, 加6 0 0m L水, 混勻。3.2.3 甲醇-水溶液(4 0+6 0) : 取4 0 0m L甲醇, 加6 0 0m L水, 混勻。3.2.4 甲醇-水溶液(7 0+3 0) : 取7 0 0m L甲醇, 加3 0 0m L水, 混勻。3.2.5 磷酸鹽緩沖溶液( 以下簡(jiǎn)稱P B S) : 稱取8.0g氯化鈉,1.2g磷酸氫二鈉( 或2.9 2g十二水磷酸氫二鈉) ,0. 2g磷 酸 二 氫 鉀,0. 2g氯 化 鉀, 用9 0 0 m L水 溶 解, 用 鹽 酸 調(diào) 節(jié)p H至7. 4, 用 水 定 容至10 0 0m L。G B5 0 0 9.2 52 0 1 62 3.3 標(biāo)準(zhǔn)品3.3.1 雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品(C1 8H1 2O6,C A S號(hào):1 0 0 4 8 - 1 3 - 2) : 純度9 9%, 或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.3.2 1 3C1 8-雜色曲霉素同位素內(nèi)標(biāo):2 5g/m L, 或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 0 0g/m L) : 準(zhǔn)確稱取雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.0 0m g( 準(zhǔn)確至0.0 1m g) , 用甲醇溶解并定容至1 0m L。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后, 密封后-2 0下保存, 保存期6個(gè)月。3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液(1g/m L) : 準(zhǔn)確移取1.0 0m L的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至1 0 0m L容量瓶中, 用甲醇定容。-2 0下保存, 保存期3個(gè)月。3.4.3 同位素內(nèi)標(biāo)工作液(1.0g/m L) : 準(zhǔn)確移取雜色曲霉素同位素內(nèi)標(biāo)(2 5g/m L)0.4 0 m L至1 0m L容量瓶中, 用甲醇定容。-2 0下保存, 保存期3個(gè)月。3.4.4 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液: 準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量至5m L容量瓶中, 加入5 0L1.0g/m L的同位素內(nèi)標(biāo)工作液, 用甲醇-水溶 液 (7 0+3 0) 定 容 至 刻 度 ( 含 雜 色 曲 霉 素 濃 度 為1n g/m L、2n g/m L、5n g/m L、1 0n g/m L、2 0n g/m L、3 0n g/m L、4 0n g/m L、5 0n g/m L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液) , 臨用前配制。3.5 材料3.5.1 免疫親和柱: 柱容量6 0 0n g( 柱容量驗(yàn)證方法參見(jiàn)B.2) 。3.5.2 固相萃取柱:N -乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料柱(2 0 0m g/6m L) , 或相當(dāng)者。使用前分別用5m L甲醇和5m L水活化。3.5.3 微孔濾膜:0.2 2m。4 儀器和設(shè)備4.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀: 配電噴霧離子源。4.2 高速粉碎機(jī)4.3 渦旋混合器。4.4 超聲波發(fā)生器。4.5 天平: 感量為0.0 1g和0.0 0 00 1g。4.6 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速60 0 0r/m i n。4.7 固相萃取裝置( 帶真空泵) 。4.8 氮吹儀。4.9 試驗(yàn)篩:1mm2mm孔徑。5 分析步驟5.1 試樣制備樣品用高速粉碎機(jī)將其粉碎后過(guò)1mm2mm孔徑試驗(yàn)篩, 混合均勻后取試樣1 0 0g用于檢測(cè)。5.2 試樣提取稱取5g均質(zhì)試樣( 精確至0.0 1g) 至5 0m L離心管中( 花生和黃豆樣品: 稱取2g均質(zhì)試樣) , 加入G B5 0 0 9.2 52 0 1 63 1 0 0L同位素內(nèi)標(biāo)工作液, 加入2 0 .0m L乙腈-水溶液(8 0 + 2 0) , 渦旋混勻后超聲1 0m i n, 在60 0 0r/m i n下離心1 0m i n, 取上清液備用。5.3 凈化5.3.1 固相萃取柱凈化準(zhǔn)確移取2.0m L上述上清液用水稀釋至8m L待上樣。將上樣液轉(zhuǎn)移至活化好的固相萃取柱中, 控制樣液以約3m L/m i n的速度穩(wěn)定下滴。上樣完畢后,依次加入5m L的乙腈-水溶液(4 0+6 0) 、5m L的甲醇-水溶液(4 0+6 0) 淋洗。待淋洗結(jié)束后, 用真空泵抽干固相萃取柱, 加入6m L乙腈洗脫, 控制流速為約3m L/m i n, 用真空泵抽干固相萃取柱, 收集洗脫液。在6 0下用氮?dú)饩従彺抵粮? 用甲醇-水溶液(7 0+3 0) 定容至1.0m L, 渦旋3 0s溶解殘留物,0.2 2m濾膜過(guò)濾, 收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。按同一操作方法做空白試驗(yàn)。5.3.2 免疫親和柱凈化準(zhǔn)確移取2m L上述上清液, 加入2 8m LP B S混勻。將5 0m L一次性注射器筒與親和柱的頂部相連。將上述樣液移至注射器筒中, 調(diào)節(jié)下滴速度, 控制樣液以約3m L/m i n的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后, 往注射器筒內(nèi)依次加入1 0m LP B S和1 0m L水, 以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后, 用真空泵抽干親和柱。在親和柱下部放置1 0m L刻度試管, 取下5 0m L的注射器筒, 加入2m L乙腈洗脫親和柱, 控制約3m L/m i n的自然下滴速度, 收集全部洗脫液至刻度試管中, 用真空泵抽干親和柱。在6 0下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵粮? 用甲醇-水溶液(7 0+3 0) 定容至1.0m L, 渦旋3 0s溶解殘留物,0.2 2m濾膜過(guò)濾, 收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。按同一操作方法做空白試驗(yàn)。注:可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況, 選擇上述凈化方法中的一種凈化方法即可。5.4 儀器參考條件5.4.1 色譜參考條件a) 液相色譜柱:C1 8柱, 柱長(zhǎng)1 0 0mm, 內(nèi)徑2.1mm, 粒徑1.8m, 或相當(dāng)色譜柱;b) 流動(dòng)相:A相: 水,B相: 甲醇;c) 梯度洗脫條件:7 0% B(0m i n 5m i n) ,1 0 0% B(5m i n 8m i n) ,7 0% B(8m i n 1 2m i n) ;d) 流速:0.2m L/m i n;e) 色譜柱柱溫:4 0;f) 進(jìn)樣量:1 0L。5.4.2 質(zhì)譜參考條件a) 檢測(cè)方式: 多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) ;b) 質(zhì)譜條件及離子選擇參數(shù)參見(jiàn)表A.1;c) 子離子掃描圖參見(jiàn)圖A.1圖A.2;d) 液相色譜-質(zhì)譜圖見(jiàn)圖A.3。5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按濃度由低到高注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中, 測(cè)得相應(yīng)色譜峰的峰面積, 以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中雜色曲霉素的濃度為橫坐標(biāo), 雜色曲霉素色譜峰的峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積的比值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。G B5 0 0 9.2 52 0 1 64 5.6 試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中, 測(cè)得相應(yīng)色譜峰的峰面積, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中雜色曲霉素的濃度。如試樣溶液中雜色曲霉素的濃度超出線性范圍, 則需適當(dāng)減少取樣量按5.2、5.3處理試樣后重新測(cè)定。5.7 定性試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較, 變化范圍在2.5%之內(nèi)。待測(cè)化合物定性離子色譜峰的信噪比3, 定量離子色譜峰的信噪比1 0。每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn), 至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子, 而且同一檢測(cè)批次,對(duì)同一化合物, 樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比, 其允許偏差不超過(guò)表1規(guī)定的范圍。表1 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允許相對(duì)偏差2 0%2 5%3 0%5 0%6 分析結(jié)果的表述試樣中雜色曲霉素的含量按式(1) 計(jì)算:X=Vmf(1) 式中:X 試樣中雜色曲霉素的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中雜色曲霉素的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 最終定容體積, 單位毫升(m L) ;m 試樣的稱樣量, 單位克(g) ;f 稀釋倍數(shù)(f=1 0) ;計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的2 0%。8 其他稱取大米、 玉米及小麥試樣5g時(shí), 其檢出限為0.6g/k g, 定量限為2g/k g; 稱取黃豆及花生試樣2g時(shí), 其檢出限為1.5g/k g, 定量限為5g/k g。G B5 0 0 9.2 52 0 1 65 第二法 液相色譜法9 原理樣品中的雜色曲霉素用乙腈-水溶液提取, 經(jīng)均質(zhì)、 渦旋、 超聲、 離心等處理, 取上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋, 免疫親和柱凈化、 洗脫, 氮?dú)獯蹈蓾饪s、 流動(dòng)相定容、 微孔濾膜過(guò)濾, 液相色譜分離紫外檢測(cè)器檢測(cè)。外標(biāo)法定量。1 0 試劑和溶液除非另有說(shuō)明, 本方法使用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。1 0.1 試劑和標(biāo)準(zhǔn)樣品1 0.1.1 乙腈(CH3C N) : 色譜純。1 0.1.2 甲醇(CH3OH) : 色譜純。1 0.1.3 氯化鈉(N a C l) 。1 0.1.4 磷酸氫二鈉(N a2H P O4) 。1 0.1.5 磷酸二氫鉀(KH2P O4) 。1 0.1.6 鹽酸。1 0.1.7 氯化鉀(K C l) 。1 0.2 試劑配制1 0.2.1 乙腈-水溶液(8 0+2 0) : 取8 0 0m L乙腈, 加2 0 0m L水, 混勻。1 0.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0) : 取5 0 0m L乙腈, 加5 0 0m L水, 混勻。1 0.2.3 磷酸鹽緩沖溶液( 以下簡(jiǎn)稱P B S) : 稱取8.0g氯化鈉,1.2g磷酸氫二鈉( 或2.9 2g十二水磷酸氫二鈉) ,0.2g磷酸二氫鉀,0. 2g氯化 鉀, 用9 0 0 m L水溶解, 用鹽 酸調(diào)節(jié)p H至7. 4, 用水 定容至10 0 0m L。1 0.3 標(biāo)準(zhǔn)品雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品(C1 8H1 2O6,C A S號(hào):1 0 0 4 8 - 1 3 - 2) : 純度9 9%, 或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。1 0.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 0.4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 0 0g/m L) : 準(zhǔn)確稱取雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品1.0m g( 準(zhǔn)確至0.0 1m g) , 用乙腈溶解并定容至1 0m L。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后, 密封后-2 0下保存, 保存期6個(gè)月。1 0.4.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液(1g/m L) : 準(zhǔn)確移取1 0 0L的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至1 0m L容量瓶中, 用乙腈定容。此溶液濃度為1g/m L。-2 0下保存, 保存期3個(gè)月。1 0.4.3 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液: 準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量至5m L容量瓶中, 用乙腈-水溶液(5 0+5 0) 定容至刻度( 含雜色曲霉素濃度為5n g/m L、1 0n g/m L、2 5n g/m L、5 0n g/m L、7 5n g/m L、1 0 0n g/m L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液) , 臨用前配制。G B5 0 0 9.2 52 0 1 66 1 0.5 材料1 0.5.1 免疫親和柱: 柱容量6 0 0n g( 柱容量驗(yàn)證方法參見(jiàn)B.2) 。1 0.5.2 微孔濾膜:0.2 2m。1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 液相色譜儀: 配紫外檢測(cè)器。1 1.2 高速粉碎機(jī)1 1.3 渦旋混合器。1 1.4 超聲波發(fā)生器。1 1.5 天平: 感量為0.0 1g和0.0 0 00 1g。1 1.6 離心機(jī): 轉(zhuǎn)速60 0 0r/m i n。1 1.7 固相萃取裝置( 帶真空泵) 。1 1.8 氮吹儀。1 1.9 試驗(yàn)篩:1mm2mm孔徑。1 2 分析步驟使用不同廠商的免疫親和柱, 在樣品的上樣、 淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同, 應(yīng)該按照供應(yīng)商所提供的操作說(shuō)明書要求進(jìn)行操作。1 2.1 試樣制備樣品用高速粉碎機(jī)將其粉碎后過(guò)1mm2mm孔徑試驗(yàn)篩, 混合均勻后取試樣1 0 0g用于檢測(cè)。1 2.2 試樣提取稱取5g已均質(zhì)試樣( 精確至0.0 1g) 至5 0m L離心管中, 加入2 0.0m L乙腈-水(8 0+2 0) , 渦旋混勻后超聲1 0m i n, 在60 0 0r/m i n下離心1 0m i n, 取上清液備用。1 2.3 試樣凈化準(zhǔn)確移取2m L上述上清液, 加入2 8m LP B S混勻。將5 0m L一次性注射器筒與親和柱的頂部相連。將上述樣液移至5 0m L注射器筒中, 調(diào)節(jié)下滴速度, 控制樣液以約3m L/m i n的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后, 往注射器筒內(nèi)依次加入1 0m LP B S和1 0m L水, 以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后, 用真空泵抽干親和柱。在親和柱下部放置1 0m L刻度試管, 取下5 0m L的注射器筒, 加入2m L乙腈洗脫親和柱, 控制約3m L/m i n的自然下滴速度, 收集全部洗脫液至刻度試管中, 用真空泵抽干親和柱。在6 0下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵粮? 用乙腈-水(5 0+5 0) 定容至1.0m L, 渦旋3 0s溶解殘留物,0.2 2m濾膜過(guò)濾, 收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。按同一操作方法做空白試驗(yàn)。1 2.4 儀器參考條件a) 液相色譜柱:C1 8柱, 柱長(zhǎng)1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 粒徑3.5m, 或相當(dāng)者;b) 流動(dòng)相:A相: 水,B相: 乙腈;c) 梯度洗脫條件:5 5% B(0 m i n7.5 m i n) ,1 0 0% B(7.5 m i n1 0 m i n) ,5 5% B(1 0 m i nG B5 0 0 9.2 52 0 1 67 1 5m i n) ;d) 流速:0.8m L/m i n;e) 色譜柱柱溫:4 0;f) 進(jìn)樣量:1 0 0L;g) 紫外檢測(cè)器條件: 檢測(cè)波長(zhǎng)為3 2 5n m。1 2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按濃度由低到高注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定, 測(cè)得相應(yīng)色譜峰的峰面積, 以標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中雜色曲霉素的濃度為橫坐標(biāo), 雜色曲霉素色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1 2.6 試樣溶液的測(cè)定將試樣溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定, 測(cè)得相應(yīng)色譜峰的峰面積, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中雜色曲霉素的濃度。1 3 分析結(jié)果的表述試樣中雜色曲霉素的含量按式(2) 計(jì)算:X=Vmf(2) 式中:X 試樣中雜色曲霉素的含量, 單位為微克每千克(g/k g) ; 根據(jù)試樣中雜色曲霉素的色譜峰面積, 經(jīng)計(jì)算所得的濃度, 單位為納克每毫升(n g/m L) ;V 最終定容體積, 單位毫升(m L) ;m 試樣的稱樣量, 單位克(g) ;f 稀釋倍數(shù)(f=1 0) 。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。1 4 精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的2 0%。1 5 其他稱取大米、 玉米、 小麥、 黃豆及花生5g時(shí), 其檢出限為6g/k g, 定量限為2 0g/k g。第三法 薄層色譜法1 6 原理試樣中的雜色曲霉素經(jīng)提取、 凈化、 濃縮、 薄層展開(kāi)后, 用三氯化鋁顯色, 再經(jīng)加熱產(chǎn)生一種在紫外光下顯示黃色熒光的物質(zhì), 根據(jù)其在薄層上顯示的熒光最低檢出量來(lái)測(cè)定樣品中雜色曲霉素的含量。G B5 0 0 9.2 52 0 1 68 1 7 試劑和溶液除非另有說(shuō)明, 本方法使用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級(jí)水。1 7.1 試劑和材料1 7.1.1 三氯甲烷(CHC l3) 。1 7.1.2 正己烷(C6H1 4) 。1 7.1.3 甲醇(CH3OH) 。1 7.1.4 苯(C6H6) 。1 7.1.5 冰乙酸(CH3C OOH) 。1 7.1.6 甲酸(HC OOH) 。1 7.2 試劑配制1 7.2.1 乙酸溶液: 取9 5m L乙酸和5m L水混勻。1 7.2.2 氯化鈉濃度(4 0g/L) : 稱取4g氯化鈉(N a C l) 溶于1 0 0m L乙醇中, 混勻。1 7.2.3 三氯化鋁-乙醇溶液(2 0 0g/L) : 稱取2 0g三氯化鋁(A l C l36 H2O) 溶于1 0 0m L乙醇中, 過(guò)濾,備用。1 7.2.4 雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液: 用苯將1 0g/m L的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成每毫升相當(dāng)于1.0g和0.4 0g的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。避光, 放置于4冰箱中保存。1 8 儀器和設(shè)備1 8.1 小型粉碎機(jī)。1 8.2 樣篩( 篩孔尺寸為0.8 5 0mm和2mm) 。1 8.3 電動(dòng)振蕩器。1 8.4 全玻璃濃縮器。1 8.5 玻璃板:1 0c m1 0c m與1 0c m1 8.5c m兩種。1 8.6 展開(kāi)槽: 內(nèi)長(zhǎng)1 0c m、 寬4.5c m、 高1 7c m與內(nèi)長(zhǎng)1 1.5c m、 寬6 0c m、 高1 9c m。1 8.7 玻璃噴霧器。1 8.8 空氣泵或油泵。1 9 分析步驟1 9.1 提取大米、 玉米、 小麥、 黃豆及花生: 稱取2 0.0 0g過(guò)0.8 5mm篩孔的大米、 玉米、 小麥及黃豆粉碎樣品( 花生粉碎樣品過(guò)2 mm的篩孔) , 置于具塞錐形瓶中, 加8 0 m L甲醇-氯化鈉溶液(9 0+1 0) , 振蕩3 0m i n, 過(guò)濾。收集樣品液4 0m L( 黃豆、 花生樣品則取2 0m L, 加入2 0m L提取劑) , 移入2 5 0m L分液漏斗中, 再加入2 5m L氯化鈉溶液( 使甲醇與水之體積比為5 5+4 5) 和2 5m L石油醚, 振搖2m i n, 靜置分層。上層石油醚溶液置錐形瓶中, 下層溶液仍移入原分液漏斗中, 再用2 5m L石油醚提取一次。最后將兩次上層的石油醚溶液合并, 加入2 5m L甲醇-氯化鈉溶液(5 5+4 5) 黃豆、 花生樣品則加入2 5m L甲醇-氯化鈉溶液(7 0+3 0) , 振搖3 0s , 將下層并于原甲醇水層中, 重復(fù)用甲醇-氯化鈉溶液(5 5+4 5) 提G B5 0 0 9.2 52 0 1 69 取兩次 黃豆、 花生樣品重復(fù)用甲醇-氯化鈉溶液(7 0+3 0) 提取1次 , 以提取該層的雜色曲霉素。下層溶液合并后加3 0m L三氯甲烷( 黃豆、 花生樣品除加三氯甲烷外, 再加1 3m L氯化鈉溶液, 使甲醇與水的體積比為5 5+4 5) , 振搖2m i n, 靜置。待上層混濁液有部分澄清時(shí), 即可將下層溶液經(jīng)放有約1 0g無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙過(guò)濾于蒸發(fā)皿中。于分液漏斗中再加1 0m L三氯甲烷, 重復(fù)提取1次, 將該下層溶液和用少量三氯甲烷洗濾器的洗液一并放入蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放置于6 5水浴上揮干, 然后再在冰浴上放置2m i n 3m i n, 加1.0m L苯將殘留物充分混勻, 置入小試管中?；?qū)⒁陨险舭l(fā)皿中殘留物用三氯甲烷移于濃縮管中, 于6 5 用減壓吹氣法濃縮至干, 加入1.0m L苯, 供色譜測(cè)定, 此1m L大米、 玉米及小麥樣液各相當(dāng)于1 0g樣品,1m L黃豆與花生樣液則各相當(dāng)于5g樣品。1 9.2 測(cè)定1 9.2.1 單向展開(kāi)法1 9.2.1.1 薄層板的制備稱取約5g硅膠G, 加相當(dāng)于硅膠量2倍3倍左右的水, 用力研磨1m i n2m i n至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi), 推成1 0c m1 0c m, 厚度0.3mm的薄層板五塊。在空氣中干燥約1 5m i n后, 在1 0 0活化2h, 取出, 放干燥器中保存。一般可保存2d 3d, 若放置時(shí)間較長(zhǎng), 可再活化后使用。1 9.2.1.2 點(diǎn)樣取兩塊1 0c m1 0c m薄層板, 在距板下端各0.8c m1c m基線上滴加標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液如下: 距左邊緣0.8c m1c m處各滴加1 0L標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.4g/m L) , 在距左邊緣4c m處各滴加8 0L樣液( 黃豆、 花生樣品為4 0L) , 然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴1 0L標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.4g/m L) , 在滴加樣液時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)邊吹邊加。1 9.2.1.3 展開(kāi)1 9.2.1.3.1 橫向展開(kāi): 展開(kāi)劑是乙醚-正己烷-苯-三氯甲烷-甲酸(3+9+1.5+1.5+0.6)1 5.6m L( 由于此混合液不成一相, 每一展開(kāi)槽的用量須單獨(dú)配制) 。用前充分搖勻, 一并倒入槽內(nèi)使用。將靠近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的一邊, 放入槽內(nèi)展至9c m左右取出揮干。1 9.2.1.3.1 縱向展開(kāi): 展開(kāi)劑為苯-甲醇-冰乙酸(9 0+8+2或9 2.5+6+1.5)1 5m L。將靠近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液點(diǎn)的一邊放入槽內(nèi), 展開(kāi)9c m左右取出揮干。1 9.2.1.4 顯熒光在薄層板上噴三氯化鋁-乙醇溶液(2 0 0g/L) , 置8 0加熱1 0m i n, 立即在紫外光燈( 波長(zhǎng)3 6 5n m)下觀察結(jié)果, 待薄層板冷卻后再薄薄的噴第2次( 不需加熱) , 可直接觀察結(jié)果。1 9.2.1.5 觀察與評(píng)定結(jié)果在紫外光燈下觀察, 若第2板的第2點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量, 而在第1板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn), 則樣品中雜色曲霉素含量在5g/k g( 黃豆、 花生樣品為2 0g/k g) ; 若出現(xiàn)熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量的熒光強(qiáng)度相等, 而且此熒光點(diǎn)又同第二板樣液的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相重疊, 則樣品中雜色曲霉素含量為5g/k g( 黃豆、 花生樣品為2 0g/k g) ; 若出現(xiàn)熒光強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量強(qiáng), 則根據(jù)其熒光強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù), 或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù), 直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。在噴三氯化鋁第1、2次后分別進(jìn)行觀察評(píng)定, 兩次結(jié)果應(yīng)一致。若結(jié)果為陽(yáng)性, 則將薄層板放暗處1 0m i n, 再觀察一次, 如樣品仍為陽(yáng)性, 進(jìn)一步作確證試驗(yàn), 即在距薄層板(1 0c m1 8.5c m) 下端3c m的基線上滴加一個(gè)點(diǎn)的1 0L標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.4g/m L) 與3個(gè)點(diǎn)的樣液,G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 0 每點(diǎn)1 6L。在樣液的一個(gè)點(diǎn)上再加滴1 0L標(biāo)準(zhǔn)使用液(0.4g/m L) , 另一點(diǎn)上再加滴1 0L標(biāo)準(zhǔn)使用液(1g/m L) 。于各點(diǎn)上再加一小滴三氟乙酸, 放暗處反應(yīng)1 0m i n, 熱風(fēng)吹5m i n, 使薄層板上的溫度不高于4 0, 用冰乙酸-苯(1 0+9 0) 展開(kāi)1次2次, 直至雜色曲霉素衍生物與雜質(zhì)分開(kāi)為止。展開(kāi)時(shí)要避光, 以下顯熒光步驟同1 9.2.1.4。最后將板在紫外光燈下觀察, 如樣液為陽(yáng)性, 應(yīng)產(chǎn)生與雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)重疊的衍生物。確證法的最低檢出量: 大米、 玉米、 小麥均為2 5g/k g( 黃豆、 花生樣品均為5 0g/k