GB4789.40-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn).pdf

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)G B4 7 8 9 .4 02 0 1 6食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬( 阪崎腸桿菌) 檢驗(yàn)2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó) 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B4 7 8 9.4 02 0 1 6 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替G B4 7 8 9.4 02 0 1 0 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 阪崎腸桿菌檢驗(yàn) 、S N/T1 6 3 2.12 0 1 3 出口奶粉中阪崎腸桿菌( 克羅諾桿菌屬) 檢驗(yàn)方法 第1部分: 分離與計(jì)數(shù) 。本標(biāo)準(zhǔn)與G B4 7 8 9.4 02 0 1 0相比, 主要變化如下: 標(biāo)準(zhǔn)名稱 修改為 “ 食 品安全國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物 學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌 屬 ( 阪崎 腸桿菌) 檢驗(yàn)” ; 修改了可疑菌落的挑取數(shù)量。G B4 7 8 9.4 02 0 1 61 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬( 阪崎腸桿菌) 檢驗(yàn)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中克羅諾桿菌屬(C r o n o b a c t e r) 的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方食品、 乳和乳制品及其原料中克羅諾桿菌屬的檢驗(yàn)。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外, 其他設(shè)備和材料如下:2.1 恒溫培養(yǎng)箱:2 51,3 61,4 40.5。2.2 冰箱:25。2.3 恒溫水浴箱:4 40.5。2.4 天平: 感量0.1g。2.5 均質(zhì)器。2.6 振蕩器。2.7 無(wú)菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸頭。2.8 無(wú)菌錐形瓶: 容量1 0 0m L、2 0 0m L、20 0 0m L。2.9 無(wú)菌培養(yǎng)皿: 直徑9 0mm。2.1 0 p H計(jì)或p H比色管或精密p H試紙。2.1 1 全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。3 培養(yǎng)基和試劑3.1 緩沖蛋白胨水(b u f f e rp e p t o n ew a t e r,B PW) : 見(jiàn)A.1。3.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(m o d i f i e dl a u r y ls u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - Vm) : 見(jiàn)A.2。3.3 阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基。3.4 胰蛋白胨大豆瓊脂(t r y p t i c a s es o ya g a r,T S A) : 見(jiàn)A.3。3.5 生化鑒定試劑盒。3.6 氧化酶試劑: 見(jiàn)A.4。3.7 L -賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基: 見(jiàn)A.5。3.8 L -鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基: 見(jiàn)A.6。3.9 L -精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基: 見(jiàn)A.7。3.1 0 糖類(lèi)發(fā)酵培養(yǎng)基: 見(jiàn)A.8。3.1 1 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基: 見(jiàn)A.9。G B4 7 8 9.4 02 0 1 62 第一法 克羅諾桿菌屬定性檢驗(yàn)4 檢驗(yàn)程序克羅諾桿菌屬檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。圖1 克羅諾桿菌屬檢驗(yàn)程序5 操作步驟5.1 前增菌和增菌取檢樣1 0 0g(m L) 置滅菌錐形瓶中, 加入9 0 0m L已預(yù)熱至4 4的緩沖蛋白胨水, 用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解,3 61培養(yǎng)1 8h2h。移取1m L轉(zhuǎn)種于1 0m Lm L S T - Vm肉湯,4 40.5培養(yǎng)2 4h2h。5.2 分離5.2.1 輕輕混勻m L S T - Vm肉湯培養(yǎng)物, 各取增菌培養(yǎng)物1環(huán), 分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板, 顯色培養(yǎng)基須符合G B4 7 8 9.2 8的要求,3 61培養(yǎng)2 4h2h, 或按培養(yǎng)基要求條件G B4 7 8 9.4 02 0 1 63 培養(yǎng)。5.2.2 挑取至少5個(gè)可疑菌落, 不足5個(gè)時(shí)挑取全部可疑菌落, 劃線接種于T S A平板。2 51培養(yǎng)4 8h4h。5.3 鑒定自T S A平板上直接挑取黃色可疑菌落, 進(jìn)行生化鑒定?？肆_諾桿菌屬的主要生化特征見(jiàn)表1。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。表1 克羅諾桿菌屬的主要生化特征生化試驗(yàn)特 征黃色素產(chǎn)生+氧化酶-L -賴氨酸脫羧酶-L -鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(+)L -精氨酸雙水解酶+檸檬酸水解(+)發(fā)酵D -山梨醇L -鼠李糖D -蔗糖D -蜜二糖苦杏仁甙(-)+ 注:+9 9%陽(yáng)性;-9 9%陰性; (+)9 0%9 9%陽(yáng)性; (-)9 0%9 9%陰性。6 結(jié)果與報(bào)告綜合菌落形態(tài)和生化特征, 報(bào)告每1 0 0g(m L) 樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。第二法 克羅諾桿菌屬的計(jì)數(shù)7 操作步驟7.1 樣品的稀釋7.1.1 固體和半固體樣品: 無(wú)菌稱取樣品1 0 0g、1 0g、1g各三份, 分別加入9 0 0m L、9 0m L、9m L已預(yù)熱至4 4的B PW, 輕輕振搖使充分溶解, 制成11 0樣品勻液, 置3 61培養(yǎng)1 8h2h。分別移取1m L轉(zhuǎn)種于1 0m Lm L S T - Vm肉湯,4 40.5培養(yǎng)2 4h2h。7.1.2 液體樣品: 以無(wú)菌吸管分別取樣品1 0 0m L、1 0m L、1m L各三份, 分別加入9 0 0m L、9 0m L、9m L已預(yù)熱至4 4的B PW, 輕輕振搖使充分混勻, 制成11 0樣品勻液, 置3 61培養(yǎng)1 8h2h。分別移取1m L轉(zhuǎn)種于1 0m Lm L S T - Vm肉湯,4 40.5培養(yǎng)2 4h2h。G B4 7 8 9.4 02 0 1 64 7.2 分離、 鑒定同5.2和5.3。8 結(jié)果與報(bào)告綜合菌落形態(tài)、 生化特征, 根據(jù)證實(shí)為克羅諾桿菌屬的陽(yáng)性管數(shù), 查MP N檢索表, 報(bào)告每1 0 0g(m L) 樣品中克羅諾桿菌屬的MP N值( 見(jiàn)表B.1) 。G B4 7 8 9.4 02 0 1 65 附 錄 A培養(yǎng)基和試劑A.1 緩沖蛋白胨水(B PW)A.1.1 成分蛋白胨1 0.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉(N a2H P O41 2 H2O)9.0g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水10 0 0m LA.1.2 制法加熱攪拌至溶解, 調(diào)節(jié)p H至7.20.2,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(M o d i f i e d l a u r y l s u l f a t e t r y p t o s e b r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - V m)A.2.1 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(m L S T) 肉湯A.2.1.1 成分氯化鈉3 4.0g胰蛋白胨2 0.0g乳糖5.0g磷酸二氫鉀2.7 5g磷酸氫二鉀2.7 5g十二烷基硫酸鈉0.1g蒸餾水10 0 0m LA.2.1.2 制法加熱攪拌至溶解, 調(diào)節(jié)p H至6.80.2。分裝每管1 0m L,1 2 1高壓滅菌1 5m i n。A.2.2 萬(wàn)古霉素溶液A.2.2.1 成分萬(wàn)古霉素1 0.0m g蒸餾水1 0.0m LA.2.2.2 制法1 0.0m g萬(wàn)古霉素溶解于1 0.0m L蒸餾水, 過(guò)濾除菌。萬(wàn)古霉素溶液可以在05保存1 5d。G B4 7 8 9.4 02 0 1 66 A.2.3 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(M o d i f i e dl a u r y l s u l f a t et r y p t o s eb r o t h - v a n c o m y c i nm e d i u m,m L S T - V m) 每1 0m Lm L S T加入萬(wàn)古霉素溶液0.1m L, 混合液中萬(wàn)古霉素的終濃度為1 0g/m L。注:m L S T - Vm必須在2 4h之內(nèi)使用。A.3 胰蛋白胨大豆瓊脂(T S A)A.3.1 成分胰蛋白胨1 5.0g植物蛋白胨5.0g氯化鈉5.0g瓊脂1 5.0g蒸餾水10 0 0m LA.3.2 制法加熱攪拌至溶解, 煮沸1m i n, 調(diào)節(jié)p H至7.30.2,1 2 1高壓1 5m i n。A.4 氧化酶試劑A.4.1 成分N,N,N ,N -四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.0g蒸餾水1 0 0m LA.4.2 制法少量新鮮配制, 于冰箱內(nèi)避光保存, 在7d之內(nèi)使用。A.4.3 試驗(yàn)方法用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落, 涂布在氧化酶試劑濕潤(rùn)的濾紙平板上。如果濾紙?jiān)? 0s中之內(nèi)未變?yōu)樽霞t色、 紫色或深藍(lán)色, 則為氧化酶試驗(yàn)陰性, 否則即為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。注:實(shí)驗(yàn)中切勿使用鎳/鉻材料。A.5 L -賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基A.5.1 成分L -賴氨酸鹽酸鹽(L - l y s i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸餾水10 0 0m LA.5.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L,1 2 1高壓1 5m i n。G B4 7 8 9.4 02 0 1 67 A.5.3 實(shí)驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于L -賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 01培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結(jié)果。L -賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性者, 培養(yǎng)基呈紫色, 陰性者為黃色, 空白對(duì)照管為紫色。A.6 L -鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基A.6.1 成分L -鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽(L - o r n i t h i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸餾水10 0 0m LA.6.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L。1 2 1高壓1 5m i n。A.6.3 實(shí)驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于L -鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 01培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結(jié)果。L -鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性者, 培養(yǎng)基呈紫色, 陰性者為黃色。A.7 L -精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基A.7.1 成分L -精氨酸鹽酸鹽(L - a r g i n i n em o n o h y d r o c h l o r i d e)5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.0 1 5g蒸餾水10 0 0m LA.7.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L。1 2 1高壓1 5m i n。A.7.3 實(shí)驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于L -精氨酸脫羧酶培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 01培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結(jié)果。L -精氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性者, 培養(yǎng)基呈紫色, 陰性者為黃色。A.8 糖類(lèi)發(fā)酵培養(yǎng)基A.8.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.8.1.1 成分酪蛋白( 酶消化)1 0.0gG B4 7 8 9.4 02 0 1 68 氯化鈉5.0g酚紅0.0 2g蒸餾水10 0 0m LA.8.1.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)p H至6.80.2。每管分裝5m L。1 2 1高壓1 5m i n。A.8.2 糖類(lèi)溶液(D -山梨醇、L -鼠李糖、D -蔗糖、D -蜜二糖、 苦杏仁甙)A.8.2.1 成分糖8.0g蒸餾水1 0 0m LA.8.2.2 制法分別稱取D -山梨醇、L -鼠李糖、D -蔗糖、D -蜜二糖、 苦杏仁甙等糖類(lèi)成分各8g, 溶于1 0 0m L蒸餾水中, 過(guò)濾除菌, 制成8 0m g/m L的糖類(lèi)溶液。A.8.3 完全培養(yǎng)基A.8.3.1 成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基8 7 5m L糖類(lèi)溶液1 2 5m LA.8.3.2 制法無(wú)菌操作, 將每種糖類(lèi)溶液加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 混勻; 分裝到無(wú)菌試管中, 每管1 0m L。A.8.4 實(shí)驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于各種糖類(lèi)發(fā)酵培養(yǎng)基, 剛好在液體培養(yǎng)基的液面下。3 0 1 培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結(jié)果。糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性者, 培養(yǎng)基呈黃色, 陰性者為紅色。A.9 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基A.9.1 成分檸檬酸鈉2.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀1.0g磷酸二氫銨1.0g硫酸鎂0.2g溴麝香草酚藍(lán)0.0 8g瓊脂8.0g 1 8.0g蒸餾水10 0 0m LA.9.2 制法將各成分加熱溶解, 必要時(shí)調(diào)節(jié)p H至6.80.2。每管分裝1 0m L,1 2 1高壓1 5m i n, 制成斜面。G B4 7 8 9.4 02 0 1 69 A.9.3 實(shí)驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于整個(gè)培養(yǎng)基斜面,3 6 1 培養(yǎng)2 4h2h, 觀察結(jié)果。陽(yáng)性者培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色。G B4 7 8 9.4 02 0 1 61 0 附 錄 B克羅諾桿菌屬最可能數(shù)(MP N) 檢索表每1 0 0g(m L) 檢樣中克羅諾桿菌屬最可能數(shù)(MP N) 的檢