浙江大學(xué)王鏡巖生物化學(xué)(甲)上第03章氨基酸.ppt

Chapter 3 氨基酸,蛋白質(zhì)是生物功能的體現(xiàn)者，而構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸。蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下，可逐步降解為氨基酸。組成蛋白質(zhì)的氨基酸常見的有20種。成千上萬的不同蛋白質(zhì)實(shí)際上就是氨基酸的種類、數(shù)目及排列順序不同。,Section 1 蛋白質(zhì)水解,用H+，OH-或酶將蛋白質(zhì)徹底水解，可以得到許多種氨基酸的混合物，說明氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。 蛋白質(zhì) 蛋白胨 多肽 二肽 氨基酸 Mr： 大于 104 2x103 1000500 200 100,1、酸水解,條件：510倍的20%的鹽酸煮沸回流1624小時(shí)，或加壓于120水 解2小時(shí)。 優(yōu)點(diǎn)：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為L氨基酸，產(chǎn)物單一，無消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：色氨酸破壞，并產(chǎn)生一種黑色的物質(zhì)：腐黑質(zhì)，水解液呈黑色。 2、 堿水解 條件：4mol/L Ba(OH)2 或6mol/L NaOH煮沸6小時(shí)。 優(yōu)點(diǎn)：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解液清亮。 缺點(diǎn)：產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，破壞的氨基酸多，一般很少使用。 3、 蛋白酶水解 條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫3740，pH值58 優(yōu)點(diǎn)：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現(xiàn)象。 缺點(diǎn)：水解不完全，中間產(chǎn)物多。 蛋白質(zhì)酸堿水解常用于蛋白質(zhì)的組成分析，而酶水解用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。,Section 2 氨基酸的結(jié)構(gòu)通式,2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都為不對稱碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。目前已知的天然蛋白質(zhì)中氨基酸都為L-型。,1、氨基酸的結(jié)構(gòu) 氨基酸是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物，是組成蛋白質(zhì)的基本單位。從蛋白質(zhì)水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上的共同特點(diǎn)為：,1). 與羧基相鄰的-碳原子上都有一個(gè)氨基，因而稱為-氨基酸,COOH H2N C H R R基團(tuán),-氨基酸基本結(jié)構(gòu)通式,2、構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的結(jié)構(gòu)特征,（1）除Pro外，都屬-氨基酸，Pro 為-亞氨基酸： （2）都屬L-氨基酸； （3）除Gly外，都具有旋光性； （4）為兩性電解質(zhì)。 由于R基團(tuán)不同，各種氨基酸在性質(zhì)上的差異很大，如吸收光譜、等電點(diǎn)（pI）、解離常數(shù)（Ka）、顏色反應(yīng)、穩(wěn)定性、對金屬的絡(luò)合能力等。因此，不同氨基酸組成的蛋白質(zhì)，性質(zhì)和功能千差萬別。,中性aa （1）按R基團(tuán)的酸堿性分 酸性aa 堿性aa （2）按R基團(tuán)的 非極性aa（9種） 電性質(zhì)分 極性不帶電荷aa（6種） 極性aa 帶正電荷aa(3種） 帶負(fù)電荷aa（2種）,脂肪族aa（3）按R基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分 芳香族aa 雜環(huán)族aa,Section 3 氨基酸的分類,1.構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸,2.人體所需的八種必需氨基酸,賴氨酸(Lys) 纈氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Try) 亮氨酸(Leu) 異亮氨酸(Ile) 酪氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 嬰兒時(shí)期所需: 精氨酸(Arg)、組氨酸(His) 早產(chǎn)兒所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys),3.幾種重要的不常見氨基酸 在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)如下,Section 4 氨基酸的重要理化性質(zhì),1.一般物理性質(zhì) 常見氨基酸均為無色結(jié)晶,其形狀因構(gòu)型而異,溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機(jī)溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。 (2) 熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)極高，一般在200以上。 (3) 味感：其味隨不同氨基酸有所不同，有的無味、有的為甜、有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋轉(zhuǎn)，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。 (5)光吸收：構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，257=2.0x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,2.氨基酸的兩性解離性質(zhì),氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。 在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化,pH 1 7 10 凈電荷 +1 0 -1 正離子 兩性離子 負(fù)離子 等電點(diǎn)PI,氨基酸既含有氨基，能像堿一樣接受H+，又含有羧基，像酸一樣可電離出H+，所以氨基酸具有酸堿兩性性質(zhì)，是一類兩性電解質(zhì)。 As an acid（proton donor）： As a base（proton acceptor）：,不同pH時(shí)氨基酸以不同的離子化形式存在： 氨基酸所帶靜電荷為“零”時(shí)，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectric point），以pI表示。,實(shí)驗(yàn)證明在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數(shù)量相等的正、負(fù)離子形式，還有極少量的中性分子。 當(dāng)溶液的pH=pI時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在。 pHpI時(shí)，氨基酸主要以負(fù)離子形式存在。,3.氨基酸的等電點(diǎn),當(dāng)溶液濃度為某一pH值時(shí)，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡稱pI。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。 側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pKa1和pKa2的算術(shù)平均值：pI = (pKa1 + pKa2 )/2 同樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pKa值的算術(shù)平均值。 酸性氨基酸：pI = (pKa1 + pKaR-COO- )/2 堿性氨基酸：pI = (pKa2 + pKaR-NH2 )/2,各種aa都有各自的等電點(diǎn)。在酸性溶液中（pHpI)帶負(fù)電荷。 例：在pH=6.0的混合溶液中 Ala兼性離子 Lys帶正電荷 Glu帶負(fù)電荷,在溶液的任一條件下： pH=pKa+lg質(zhì)子受體/質(zhì)子供體 對于中性aa，加酸 pKa 取pKa1 加堿 pKa 取pKa2 知道了溶液的pH，即可計(jì)算出在任一pH條件下，一種aa中各種離子的比例。,4.氨基酸的化學(xué)性質(zhì) (1)與茚三酮的反應(yīng),氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。 加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€(gè)碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。 NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍(lán)紫色化合物。,反應(yīng)要點(diǎn) A.該反應(yīng)由NH2與COOH共同參與 B.茚三酮是強(qiáng)氧化劑 C.該反應(yīng)非常靈敏，可在570nm測定吸光值 D. 測定范圍：0.550g/ml E.脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質(zhì)（不釋放NH3） 應(yīng)用： A.氨基酸定量分析（先用層析法分離） B.氨基酸自動(dòng)分析儀： 用陽離子交換樹脂，將樣品中的氨基酸分離，自動(dòng)定性定量，記錄結(jié)果。,(2)與甲醛反應(yīng),反應(yīng)特點(diǎn) A.為- NH2的反應(yīng) B.在常溫，中性條件，甲醛與- NH2很快反應(yīng)，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。 應(yīng)用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（間接滴定） A.直接滴定，終點(diǎn)pH過高（12），沒有適當(dāng)指示劑。 B.與甲醛反應(yīng)，滴定終點(diǎn)在9左右，可用酚酞作指示劑。 C.釋放一個(gè)氫離子，相當(dāng)于一個(gè)氨基（摩爾比1：1） D.簡單快速，一般用于測定蛋白質(zhì)的水解速度。,(3) 與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng),反應(yīng)特點(diǎn) A.為- NH2的反應(yīng) B.氨基酸- NH2的一個(gè)H原子可被烴基取代(鹵代烴) C.在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基苯氨基酸 應(yīng)用：鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸 A.雖然多肽側(cè)鏈上的- NH2、酚羥基也能與DNFB反應(yīng)，但其生成物，容易與- DNP氨基酸區(qū)分和分離,首先由Sanger應(yīng)用，確定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu) A. B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游離氨基酸 C.分離DNP-氨基酸 D. 由Edman于1950年首先提出 為- NH2的反應(yīng) 用于N末端分析，又稱Edman降解法,肽分子與DNFB反應(yīng)，得DNP-肽,層析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的種類、數(shù)目,(4)與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng),Edman （苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。,肽鏈（N端氨基酸）與PITC偶聯(lián)，生成PTC-肽 環(huán)化斷裂：最靠近PTC基的肽鍵斷裂，生成PTC-氨基酸和少 一殘基的肽鏈，同時(shí)PTC-氨基酸環(huán)化生成PTH-氨基酸 分離PTH-氨基酸 層析法鑒定 Edman降解法的改進(jìn)方法- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基萘磺酰氯)測定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定 由于DNS有強(qiáng)烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍 可用于微量氨基酸的定量,用Edman降解法提供逐次減少一個(gè)殘基的肽鏈 靈敏度提高，能連續(xù)測定。 多肽順序自動(dòng)分析儀 樣品最低用量可在5pmol,（5）與熒光胺的反應(yīng) - NH2的反應(yīng) 氨基酸定量,（6）與5,5-雙硫基-雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng) -SH的反應(yīng) 測定細(xì)胞游離- SH的含量,（7）其他反應(yīng) 成鹽、成酯、成肽、脫羧反應(yīng),Section 5 氨基酸的分析分離,常用的方法有： 濾紙層析法(filter-paper chromatography: FPC) 薄層層析法(thin-layer chromatography: TLC) 離子交換層析法(Ion-exchange column chromatography: IEC) 氣液色譜法(gas-liquid chromatography : GLC) 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography: HPLC) 電泳技術(shù),一、濾紙層析法（FPC),以濾紙作為支持物。 濾紙吸附的水為固定相（S) 用水飽和的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相（L) 在互不相溶的兩相溶劑中，根據(jù)分配系數(shù)不同而分離物質(zhì)的方法稱為分配系數(shù)法。（主要與物質(zhì)的極性有關(guān)） 分配系數(shù)（Ka)= 溶劑在流動(dòng)相中的濃度/溶劑在固定相中的濃度 遷移率（Rf) = 原點(diǎn)到層析中心點(diǎn)的距離/原點(diǎn)到層析前沿的距離 即在一定條件下，被分離物質(zhì)在紙上移動(dòng)的距離與溶劑移動(dòng)的距離之比。 在一定條件下，某種aa的Rf 值是一定的， 不同aa的Rf 值是不同的。 可利用兩種不同的展層劑，進(jìn)行雙相層析（詳見 P151圖3-25）。,二、離子交換層析（IEC),離子交換劑是一種不溶于水、不溶于有機(jī)溶劑、不溶于酸堿的高分子化合物。根據(jù)所帶基團(tuán)又可分為： 1、陽離子交換劑 含-SO3H （強(qiáng)酸型） H型 -COOH（弱酸型） 若以Na+置換H+: -SO3Na Na型 -COONa,2、陰離子交換劑： 含-N+(CH3)3OH（強(qiáng)堿型） OH型 -N+H3OH （弱堿型） 若以Cl-置換OH-, -N+(CH3)3Cl Cl型 -N+H3Cl 如：732型陽離子交換樹脂（pH1-2)分離aa: (1)轉(zhuǎn)型：由H型Na型 （2）上樣：混合aa （3）洗脫：提高洗脫液的pH或離子強(qiáng)度 aa的洗脫順序：先酸性aa、再中性aa、后堿性aa。 若用陰離子交換樹脂分離aa，洗脫順序則相反。,蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。,Chapter 4 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu),Section 1 概 述,一、蛋白質(zhì)的定義 蛋白質(zhì)：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過肽鍵連接而成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質(zhì)量，復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能；是表達(dá)生物遺傳性狀的一類主要物質(zhì)。 二、蛋白質(zhì)在生命中的重要性 早在1878年，思格斯就在反杜林論中指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新?！?可以看出，第一，蛋白體是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；第二，生命是物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的特殊形式，是蛋白體的存在方式；第三，這種存在方式的本質(zhì)就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝?，F(xiàn)代生物化學(xué)的實(shí)踐完全證實(shí)并發(fā)展了恩格斯的論斷,1.蛋白質(zhì)是生命機(jī)體的重要組成成分,蛋白質(zhì)占干重 人體中（中年人） 人體 45% 水55% 細(xì)菌 50%80% 蛋白質(zhì)19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌 14%50% 糖類1% 白地菌50% 無機(jī)鹽7%,2.蛋白質(zhì)是一種生物功能的主要體現(xiàn)者,（1）酶的催化作用 （2）調(diào)節(jié)作用(多肽類激素) （3）運(yùn)輸功能 （4）運(yùn)動(dòng)功能 （5）免疫保護(hù)作用(干擾素) （6）接受、傳遞信息的受體 （7）毒蛋白,3.外源蛋白質(zhì)有營養(yǎng)功能，可作為生產(chǎn)加工的對象.,三、蛋白質(zhì)的組成,1.元素組成 蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為： 碳 50 氫 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量,氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計(jì)算蛋白質(zhì)的大概含量,蛋白質(zhì)含量的測定： 凱氏定氮法 (測定氮的經(jīng)典方法) 優(yōu)點(diǎn)：對原料無選擇性，儀器簡單， 方法也簡單； 缺點(diǎn)：易將無機(jī)氮(如核酸中的氮) 都?xì)w入蛋白質(zhì)中,不精確。 一般，樣品含氮量平均在16%，取其倒數(shù)100/16=6.25，即為蛋白質(zhì)換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說明含有6.25g 蛋白質(zhì)）；故： 蛋白質(zhì)含量=氮的量100/166.25,除了上述法方外，還有 紫外比色法 雙縮脲法 Folin酚 考馬斯亮蘭G250比色法 （條件：蛋白質(zhì)必須是可溶的）,2.化學(xué)組成（兩種類型） 單純蛋白質(zhì)：水解為 -氨基酸 結(jié)合蛋白質(zhì)=單純蛋白質(zhì)+輔基,四、 蛋白質(zhì)的分類,一. 依據(jù)蛋白質(zhì)的外形分類 按照蛋白質(zhì)的外形可分為球狀蛋白質(zhì)和纖維狀蛋白質(zhì)。 1.球狀蛋白質(zhì)：（globular protein）外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。 2.纖維狀蛋白質(zhì)(fibrous protein)分子類似纖維或細(xì)棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。 二.依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類 按照蛋白質(zhì)的組成，可以分為 1.簡單蛋白(simple protein) ：又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只含由-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。 （1）清蛋白和球蛋白：albumin and globulin廣泛存在于動(dòng)物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 （2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于7080乙醇中。 （3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細(xì)胞核中。 （4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。,2.結(jié)合蛋白(conjugated protein)：由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成 （1）色蛋白：由簡單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細(xì)胞色素等。 （2）糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細(xì)胞膜中的糖蛋白等。 （3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。 如血清-，-脂蛋白等。 （4）核蛋白：由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。 （5）色蛋白：由簡單蛋白與色素結(jié)合而成。如血紅素、過氧化氫酶、細(xì)胞色素c等。 （6）磷蛋白：由簡單蛋白質(zhì)和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。,Section 2 肽(peptide),蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。 蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大, 從大約6000到1000000道爾頓甚至更大,一. 肽 一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。 由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。 1.肽鏈,在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序 通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,2.肽鍵,肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。 組成肽鍵的原子處于同一平面。 肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。 在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。,3.天然存在的重要多肽,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。 但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。 如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽,二.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),1. 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Primary structure)包括： (1)組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目. (2)多肽鏈的氨基酸順序， (3)多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。,2.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定,蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測定。 (1) 測定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求,A.樣品必需純（97%以上）； B.知道蛋白質(zhì)的分子量； C.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成； D.測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。 E.測定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。,(2)測定步驟 多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).,測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目：通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。 二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力；應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。,巰基的保護(hù),測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比； 分析多肽鏈的N-末端和C-末端 末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定的主要方法有：,二硝基氟苯（DNFB）法 丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。,肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。,氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根基不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。 羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根基不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。,多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽的選擇性降解的方法有：,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 化學(xué)法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。,測定每個(gè)肽段的氨基酸順序。 確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過甲酸處理后，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。,Chapter 5 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),Section 1 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)容及研 究方法 Protein分子中的原子或基團(tuán)在三維空間的分布、排列及肽鏈主鏈在空間的走向。蛋白質(zhì)的這種天然結(jié)構(gòu)決定于3個(gè)因素： （1）與溶劑分子相互作用 （2）溶劑的pH與離子組成 （3）蛋白質(zhì)的aa序列（重要因素）,一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)水平,一級(jí)結(jié)構(gòu)(primary structure)：蛋白質(zhì)分子中的肽鍵、肽鏈、aa序列和二硫鍵的位置。 二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure):蛋白質(zhì)主鏈在空間的走向。 三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structuer):由多個(gè)三維實(shí)體（結(jié)構(gòu)域）構(gòu)成的近似球狀的構(gòu)象。 四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternary structure):寡聚蛋白的構(gòu)象。,在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還可細(xì)分為： 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。 超二級(jí)結(jié)構(gòu)(super secondary structure )：若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互作用，形成有規(guī)則的組合體。 結(jié)構(gòu)域(structure domain)：多肽鏈中相對獨(dú)立的三維實(shí)體。,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究方法,旋光色散法 重氫交換法 紫外差示光譜法 核磁共振光譜 激光拉曼光譜 X-晶體衍射 質(zhì)子光譜 色質(zhì)聯(lián)用 圓二色散 熒光偏振光譜,X-射線衍射法,Section 2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的二級(jí)(Secondary)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角。 不同蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是不同的。,肽平面（酰胺平面）,多肽鏈的主鏈由許多酰胺平面組成，平面之間以碳原子相隔。而C-C鍵和C-N鍵是單鍵，可以自由旋轉(zhuǎn)，其中C-C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱，C-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱。和這一對兩面角決定了相鄰兩個(gè)酰胺平面的相對位置，也就決定了肽鏈的構(gòu)象。,早在20世紀(jì)30年代，Pauling和Corey就開始有X-射線衍射方法研究了氨基酸和肽的結(jié)構(gòu)，他們得到了重要的結(jié)論: (1) 肽鍵的鍵長介于C-N單鍵和雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)， 不能自由旋轉(zhuǎn)。 (2) 參與肽鍵形成的兩個(gè)原子及相鄰的四個(gè)原子處于同一平 面，形成了酰胺平面，也稱肽鍵平面，又稱一個(gè)肽單位。 (3) 酰胺平面中的鍵長、鍵角是一定的 （4）在酰胺平面中C=0與N-H呈反式。 （5）相鄰肽平面構(gòu)成二面角,在-螺旋中肽平面的鍵長和鍵角一定,肽鍵的原子排列呈反式構(gòu)型,相鄰的肽平面構(gòu)成兩面角. 多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離0.15nm. 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺基團(tuán)的-CO基與第四個(gè)氨基酸殘基酰胺基團(tuán)的-NH基形成氫鍵。 蛋白質(zhì)分子為右手-螺旋。,左手和右手螺旋,1. -螺旋,-螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)如下：, 蛋白質(zhì)多肽鏈像螺旋一樣盤曲上升，每3.6個(gè)氨基酸殘基螺旋上升 一圈，每圈螺旋的高度為0.54nm，每個(gè)氨基酸殘基沿軸上升0.15nm， 螺旋上升時(shí)，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100。 維系這種螺旋結(jié)構(gòu)的作用力是氫鍵，多肽主鏈上第n個(gè)殘基的羰基和第n+4個(gè)殘基的酰氨基形成氫鍵。 -螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白質(zhì)絕大部分是右手螺旋，到目前為止僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了一段左手螺旋。 -螺旋的穩(wěn)定性主要靠氫鍵來維持。,除了上面這種典型的-螺旋外，還有一些不典型的-螺旋，所以規(guī)定了有關(guān)螺旋的寫法，用“nS”來表示，n為螺旋上升一圈氨基酸的殘基數(shù)，S為氫鍵封閉環(huán)內(nèi)的原子數(shù)，典型的-螺旋用3.613表示，非典型的-螺旋有3.010， 4.416（螺旋）等。,一些側(cè)鏈基團(tuán)雖然不參與螺旋，但他們可影響-螺旋,(1)、在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，-螺旋就不穩(wěn)定。 在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro，-螺旋就被中斷，產(chǎn)生一個(gè)彎（bend）或結(jié)節(jié)（kink）（不能形成氫鍵，側(cè)鏈占據(jù)相鄰殘基空間）， Pro常出現(xiàn)在-螺旋末端； (2)、Gly的R基太小，難以形成-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者。 (3)、肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成-螺旋。,-螺旋在不同蛋白質(zhì)中的情況,-角蛋白：全部由-螺旋構(gòu)成 肌紅蛋白： 大部分由-螺旋構(gòu)成 溶菌酶：僅含一部分-螺旋 鐵氧還蛋白：完全不具有-螺旋,-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。 在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm. -折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。 -折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。,2. -折疊,-折疊有平行和反平行的兩種形式: 平行：兩條肽鏈或肽段的走向相同； 反平行：走向相反,在-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成.四個(gè)形成轉(zhuǎn)角的殘基中，第三個(gè)一般均為甘氨酸殘基彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的 -C=O 和第四個(gè)殘基的 N-H 之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。,.自由回轉(zhuǎn) 沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)，但仍是緊密有序的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，通過主鏈間及主鏈與側(cè)鏈間氫鍵維持其構(gòu)象不同的蛋白質(zhì)，自由回轉(zhuǎn)的數(shù)量和形式各不相同分兩類： 緊密環(huán) 連接條帶,3. -轉(zhuǎn)角,、超二級(jí)結(jié)構(gòu) 在蛋白質(zhì)分子中，由若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。幾種類型的超二級(jí)結(jié)構(gòu)： ； 超二級(jí)結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域, ,Section 3 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域,對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相對獨(dú)立的三維實(shí)體締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)。這種相對獨(dú)立的三維實(shí)體就稱結(jié)構(gòu)域。 結(jié)構(gòu)域通常是幾個(gè)超二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合，對于較小的蛋白質(zhì)分子，結(jié)構(gòu)域與三級(jí)結(jié)構(gòu)等同，即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域。 結(jié)構(gòu)域一般由100200 個(gè)氨基酸殘基組成，但大小范圍可達(dá) 40400 個(gè)殘基。氨基酸可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的 結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙，比較松散，往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位。酶的活性中心往往位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的界面上 結(jié)構(gòu)域之間由“鉸鏈區(qū)”相連，使分子構(gòu)象有一定的柔性，通過結(jié)構(gòu)域之間的相對運(yùn)動(dòng)，使蛋白質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)一定的生物功能。 在蛋白質(zhì)分子內(nèi)，結(jié)構(gòu)域可作為結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行相對獨(dú)立的運(yùn)動(dòng)，水解出來后仍能維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，甚至保留某些生物活性,、結(jié)構(gòu)域,常見的結(jié)構(gòu)域：,EF-hand(EF-hand Ca2+-binding motif) EF手型鈣結(jié)合性模體（基序） Zinc finger（鋅指結(jié)構(gòu)） Leucin zipper（亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)）,： 有時(shí)一個(gè)結(jié)構(gòu)域就是蛋白質(zhì)的功能域。 包含一個(gè)但通常是多個(gè)結(jié)構(gòu)域。,結(jié)構(gòu)域與功能域的關(guān)系,Section 4 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),1、定義：蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈在多種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤旋、折疊，從而生成特定的空間結(jié)構(gòu)（球狀）。包括主鏈和側(cè)鏈的所有原子的空間排布一般非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核，極性側(cè)鏈在分子表面,2、特點(diǎn)：球狀蛋白質(zhì)溶于水。 親水 R基位于球狀表面， 疏水 R基位于球狀內(nèi)部， 具有兩個(gè)以上相對獨(dú)立的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體 （結(jié)構(gòu)域）。 3、典型代表：肌紅蛋白 是哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)存O2的蛋白質(zhì)，由153個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白，分子量17.8KD（人），16.7KD（鯨）。,結(jié)構(gòu)（1）球型結(jié)構(gòu) 43.5 2.5nm。 （2）肽鏈的75%構(gòu)成-螺旋，具8個(gè)-螺區(qū)。 （3）Pro,Ile,Ser,Thr,Asn都出現(xiàn)在拐彎處。 （4）分子疏水基都聚集在內(nèi)部，整個(gè)分子致密結(jié)實(shí)，分子內(nèi)部只有一個(gè)適于包含4個(gè)水分子的空間。 （5）具有一個(gè)血紅素輔基，垂直伸出表面，卟啉Fe有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與卟啉環(huán)上的N原子相連，1個(gè)與蛋白肽鏈中的His咪唑基相連，另1個(gè)用于結(jié)合氧氣。,一、定義： 許多蛋白質(zhì)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)通過非共價(jià)鍵結(jié)合成的多聚體，稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每個(gè)獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)單元稱為亞基。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)是指亞基的種類、數(shù)量以及各個(gè)亞基在寡聚蛋白質(zhì)中的空間排布和亞基間的相互作用。 四級(jí)結(jié)構(gòu)中，肽鏈之間是以非共價(jià)鍵相連。 包括 均一寡聚蛋白：相同亞基構(gòu)成 非均一寡聚蛋白：由不同亞級(jí)構(gòu)成。,Section 5 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),二、實(shí)例：血紅蛋白,血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)的測定由佩魯茨1958年完成，其結(jié)構(gòu)要點(diǎn)為： 球狀蛋白，寡聚蛋白，含四個(gè)亞基 兩條鏈，兩條鏈，22 鏈：141個(gè)殘基； 鏈：146個(gè)殘基 分子量65 000 含四個(gè)血紅素輔基 親水性側(cè)鏈基團(tuán)在分子表面，疏水性基團(tuán)在分子內(nèi)部,血紅蛋白的性質(zhì)： 1、協(xié)同效應(yīng) 2、別構(gòu)效應(yīng) 3、玻爾效應(yīng),一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)亞基四級(jí)結(jié)構(gòu),三蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力,維系蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)：氫鍵 維系蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵 維系蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵,a鹽鍵（離子鍵 ） b氫鍵 c疏水相互作用力 d 范德華力 e二硫鍵 f 酯鍵,氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級(jí)鍵 氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大 疏水相互作用力對維持三級(jí)結(jié)構(gòu)特別重要 鹽鍵數(shù)量小 二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定,離子鍵,氫鍵,范德華力,疏水相互作用力,四、aa順序與空間構(gòu)象的關(guān)系,1、核糖核酸酶復(fù)性實(shí)驗(yàn) 在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理，是4個(gè)二硫鍵斷裂，整個(gè)肽鏈松散無規(guī)則，酶活性散失。 用透析法除去尿素和巰基乙醇，此酶又恢復(fù)活性達(dá)原來95%以上，復(fù)性后酶的理化性質(zhì)與原來也一樣。 在105中組合中，只選擇了其中的一種（天然構(gòu)象）。此實(shí)驗(yàn)證明：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定它的高級(jí)結(jié)構(gòu)。即一維信息決定三維構(gòu)象。,2、aa種類、順序與空間構(gòu)象的關(guān)系： Pro, Hyp不參與-螺旋的形成。 Ile, Asn, Ser, Thr形成的-螺旋不穩(wěn)定。 Gly形成的-螺旋不規(guī)則。 側(cè)鏈R基對-螺旋有影響，帶同種電荷的R基相互排斥。,Chapter 6 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,一.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。 進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。 例1 鐮刀形貧血病 患者血紅細(xì)胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S） 它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化 （Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基 使血紅蛋白細(xì)胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血 這說明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的高度統(tǒng)一性,例2 一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活 體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)分子初合成時(shí)，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質(zhì)原.蛋白質(zhì)原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿? 例：胰島素，在剛合成時(shí)，是一個(gè)比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原 前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號(hào)肽. 信號(hào)肽被切去，剩下的是胰島素原。 胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當(dāng)C肽被切除后才成為有51個(gè)殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.,同源蛋白：是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級(jí)結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近. 例：細(xì)胞色素C 60 個(gè)物種中，有 27 個(gè)位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基. 可變殘基可能隨著進(jìn)化而變異，而且不同種屬的細(xì)胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān)。親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進(jìn)化樹）.,例3 同源蛋白,黃色： 不變殘基（invariable residues） 藍(lán)色 ： 保守氨基酸（conservative residues） 未標(biāo)記：可變殘基（variable residues）,二.蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能的關(guān)系 別構(gòu)效應(yīng)：又稱變構(gòu)效應(yīng)，是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象.它是細(xì)胞內(nèi)最簡單的調(diào)節(jié)方式. 例：血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng) 一個(gè)亞基與氧結(jié)合后，引起該亞基構(gòu)象改變 進(jìn)而引起另三個(gè)亞基的構(gòu)象改變 整個(gè)分子構(gòu)象改變 與氧的結(jié)合能力增加,Chapter 7 蛋白質(zhì)的性質(zhì)及分離純化,一.蛋白質(zhì)的分子大小 蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對分子質(zhì)量大于10 000.最高可達(dá)40 000 000（煙草花葉病毒） 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定方法 1.根據(jù)化學(xué)成分測定最小相對分子質(zhì)量 此法首先利用化學(xué)分析方法測定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個(gè)，據(jù)其百分含量可計(jì)算出最低相對分子質(zhì)量： 最小相對分子質(zhì)量（已知成分的相對分子、原子質(zhì)量）/已知成分的百分含量 如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一個(gè)單位，則真實(shí)相對分子質(zhì)量等于最小相對分子質(zhì)量的倍數(shù)。 2. 超離心法 在60 00080 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質(zhì)分子會(huì)沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動(dòng) 用光學(xué)方法測定界面移動(dòng)的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度 蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān),沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。 一個(gè)S單位，為110-13秒 相對分子質(zhì)量越大，S值越大 蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1200S 由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格Svedberg方程計(jì)算蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量： M=RST/D1v R：氣體常數(shù) T：絕對溫度 D：擴(kuò)散系數(shù) ：溶劑的密度 3.凝膠過濾法 凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 一定型號(hào)的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外 洗脫時(shí)大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大 測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex,測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve 以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 再測出未知樣品洗脫體積Ve 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量 4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動(dòng)速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀） 用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理 蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物 不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少） 不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象 用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖 測出待測樣品的遷移率 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量,影響遷移率的主要因素 凝膠的分子篩效應(yīng)對長短不同的棒形分子會(huì) 產(chǎn) 生不同的阻力主要因素 凝膠的濃度和交聯(lián)度 同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動(dòng)快，遷移率大。相對分子質(zhì)量大者，遷移率小 優(yōu)點(diǎn)：快速，樣品用量少，可同時(shí)測幾個(gè)樣品 缺點(diǎn)：誤差大，約為10（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差） 此方法只能測得 亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量 二. 蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳現(xiàn)象 蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)(Isoelectric point pI)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動(dòng)。 在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis)。,蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，