藥品質量研究與質量標準有關物質檢查常見問題討論余立.ppt

藥品質量研究與質量標準 -有關物質檢查常見問題討論,余立 ,第一次飛躍,第二次飛躍,雜質質控理念的變遷,雜質（Impurity）的定義與分類,任何影響藥品純度的物質均稱為雜質。 -中國藥典2010年版附錄對藥品雜質的定義 原料藥中：化學結構和該藥品不一樣的任何物質 制劑中： 除原料藥和輔料外的任何其他成分 - ICH對雜質的定義,雜質按活性分類,雜質按來源分類,雜質來源,已鑒定雜質 Identified Impurity,特定雜質 Specified Impurity,潛在雜質 Potential Impurity,雜質譜 Impurity Profile,已確證了結構特征的雜質,在質量標準中規(guī)定檢查并有自己限度標準的雜質。已鑒定或未鑒定,理論推測在生產或貯藏過程中可能產生的雜質實際產品中不一定存在,存在于藥品中的所有雜質組成或模式,新雜質的研究 藥物雜質的可能來源,1.原料：紅霉素 A、紅霉素 B、紅霉素 C、紅霉素D、紅霉素 E、紅霉素 F、 阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F 2.中間體：紅霉素A肟（Z）、6，9-亞胺醚、氮紅霉素A、紅霉素A肟（E）、紅霉素 C肟（E）、9，11-亞胺醚、紅霉素C 6，9-亞胺醚、紅霉素A內酰胺 3.副產物：紅霉素-N-氧化物、N-去甲基紅霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、 氨基阿奇霉素A、N-甲?；?N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺?；⑵?霉素、阿奇霉素N-氧化物、3-去（二甲氨基）- 3,4-去氫阿奇霉素、 O-甲苯 磺?；t霉素肟、紅霉素Z肟重排物、氮紅霉素11，12-硼酸酯、 N，N-去 二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3-N， N-去二甲基氨基-酮 基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯 4.降解產物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮紅霉素、紅霉素8， 9-脫水-6，9-半縮酮、紅霉素6，9：9，12-螺縮酮,阿奇霉素中可能存在的雜質：37種,附錄 F 藥品雜質分析指導原則 附錄 A 藥品質量標準分析方法驗證 指導原則,2010年版 藥典中的雜質分析,Q3A新原料藥中的雜質 Q3B新制劑中的雜質,ICH中的雜質分析,其他參考資料,化學藥物雜質研究的技術指導原則 化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則 ,有關物質檢查的常用方法,適用多種 雜質 （定性定量）,主要用于沒有紫外吸收的雜質 （定性半定量）,適用不同的 特定雜質 （定性定量）,TLC,HPLC,其他方法,有關物質檢查的其他方法,容量滴定,原子吸收,重量法,比色比濁,物理常數(shù),紫外,其他方法,物理常數(shù)測定法 旋光度- 檢查具有光學活性的雜質 紫外分光光度法 雜質吸光度-在特定波長具有紫外吸收的雜質 容量滴定法 游離脂肪酸、過氧化物、還原糖 重量法 酸中不溶物、水中可溶物 比色比濁法 游離淀粉、碘化物、鐵鹽等；氯化物、硫酸鹽,有關物質檢查的其他方法,有關物質檢查的其他方法,原子吸收分光光度法： 檢查金屬雜質 毛細管電泳法：抑肽酶中檢查去丙氨酸-去甘氨酸-抑 肽酶和去丙氨酸-抑肽酶兩個特定雜質 氣相色譜法：檢查揮發(fā)性雜質 熱分析法：檢查不同晶型的雜質 拉曼光譜法、紅外光譜法、X-射線粉末衍射 生物檢定法、酶聯(lián)免疫試劑盒（抗生素殘留量）,有關物質檢查的其他方法,有關物質檢查的其他方法,HPLC方法的建立與驗證,高效液相色譜法系用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品由流動相帶入柱內，各成分在柱內被分離并依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。,檢測器的種類,新方法,分析方法的有效性（氨芐西林鈉/舒巴坦鈉）,原方法,中國抗生素雜志，2009，34：734,在對已有方法比較的基礎上確定最佳分析方法,典型的HPLC方法測定有關物質,有關物質 照高效液相色譜法（附錄 D）測定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液（pH6.3）取磷酸二氫鉀9.07g，加水1000ml使溶解，用無水磷酸氫二鈉溶液（9.46g1000ml）調節(jié)pH值至6.3，臨用前稀釋10倍-乙腈-甲醇（36：11：3）為流動相，流速每分鐘1.5ml；檢測波長為200nm；柱溫40。分別取前列地爾對照品溶液、前列腺素A1和前列腺素B1雜質對照品溶液各適量，按（1：1：1）比例混合，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗用溶液。取該溶液25l注入液相色譜儀，調節(jié)色譜系統(tǒng)，使前列地爾峰的保留時間約為1113分鐘，前列腺素A1峰與前列腺素B1峰的分離度應符合要求；同時調節(jié)檢測靈敏度，使前列腺素B1峰的高度約為滿量程的10%。,測定法 精密稱取本品適量，用乙腈-水（9：1）溶解并定量稀釋制成每1ml中約含1mg的溶液作為供試品溶液；精密量取含量測定項下的對照品溶液適量，用乙腈-水（9：1）稀釋制成每1ml中約含10g的溶液，作為前列地爾對照品溶液；另精密稱取前列腺素A1和前列腺素B1雜質對照品各適量，用乙腈-水（9：1）分別溶解并定量稀釋制成每1ml中約含15g和5g的溶液作為前列腺素A1和前列腺素B1的雜質對照品溶液。精密量取供試品溶液、前列腺素A1、前列腺素B1雜質對照品溶液和前列地爾對照品溶液各25l,分別注入液相色譜儀，記錄供試品溶液的色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。前列腺素A1和前列腺素B1均按外標法計算，分別不得過1.5%和0.5%；其他雜質按主成分自身對照法計算，單個最大雜質的峰面積不得過前列地爾對照品溶液的主峰面積（1.0%）；雜質總量不得過2.0%（小于0.01%的色譜峰不計）。,HPLC方法的建立與驗證,溶劑的選擇：溶液穩(wěn)定性考察 - 溶解度高且穩(wěn)定 8小時不需提示 4小時提示臨用現(xiàn)配或立即進樣 2小時改換溶劑 - 無背景干擾或小 溶劑峰、倒峰 - 低毒價廉,檢測波長的選擇,檢測波長的選擇,主波長、低波長、雜質波長、權衡波長,檢出雜質的數(shù)與量 干擾因素 操作的便捷性,檢測波長的選擇,色譜柱的選擇,反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑 C18、 C8；氰基柱、氨基柱 正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑 硅膠柱 離子交換填充劑； 凝膠或高分子多孔微球； 手性鍵合填充劑,色譜柱的選擇-常見問題,色譜柱與流動相性質不匹配 100%的水或Buffer最好選水相柱（AQ柱 ） 普通C18柱流動相中用到離子對試劑，用后應好好沖 最好專用！ 因色譜柱填料性質已與原來有所不同 在該柱上所摸索的色譜條件，可能在其它同類柱子上得不到重現(xiàn)！,流動相的選擇,-分離能力強 （各種有關物質基本分離） -溫和穩(wěn)定 （pH、比例適中對柱傷害小，性質穩(wěn)定） -配制簡單、易得價廉 -無毒環(huán)保,頭孢曲松鈉的流動相原來0.8%四庚基溴化銨乙腈溶液-水-磷酸鹽緩沖液-枸櫞酸緩沖液（500：440：55：5），由4種成分組成，需配制3種緩沖液； 后改為0.02mol/L正辛胺溶液-乙腈（73：27），用磷酸調節(jié)pH值為6.5，僅由2種成分組成,流動相的選擇,分離能力的考察,-粗產品溶液或配制各種雜質混合物 （起始原料，中間體，副產物） - 強制降解 （酸、堿、光、熱、氧化）,二、HPLC方法的建立與驗證,強制降解的考察方法誤區(qū)： （酸、堿、光、熱、氧化） - 破壞條件過于強烈 （控制在主成分降低10%20%為宜） - 中和方法 - 目的不明確，結論不正確,分離能力的考察,二、HPLC方法的建立與驗證,- 不規(guī)定柱溫 （不需加溫且對溫度不敏感） - 25或30 （不需加溫但對溫度敏感，需保持恒溫） - 35 70 （需加溫且對溫度敏感，需保持恒溫） 作為耐用性試驗之一 且可與溶液穩(wěn)定性同時進行,柱溫的確定,溶液的配制,需要注意的幾點： - 需否避光？ - 可否超聲、加熱、多久？過濾？濾材？ - 濃度與線性范圍和檢測限是否匹配？ 棄20ml初濾液？用xx膜過濾？ 用聚四氟酰胺小瓶？ 機械振搖xx分鐘等等？,二、HPLC方法的建立與驗證,- 常用10l100l -過低誤差大，影響重現(xiàn)性 -太多過載，影響峰形與分離 - 配合溶液濃度保證檢測靈敏度,進樣體積的確定,色譜系統(tǒng)的適用性試驗,- 指標的應用 -分離度的保證 -靈敏度的測試 - 精密度的要求,,Company Logo,系統(tǒng)適用性試驗要求,重復性,理論板數(shù),分離度,保留時間,拖尾因子,常用指標,分離度指標性物質的選擇,- 難分離物質對 - 最常出現(xiàn)的雜質 - 單獨規(guī)定限度的特定雜質 - 結構性質相近且 不干擾測定的物質,二、HPLC方法的建立與驗證,-準確定量分析時通常兩峰間R1.5 -峰高峰谷比,分離度的要求,拖尾因子（T）的要求與應用,為保證分離效果和測量精度用于評價色譜峰對稱性 的指標 T=W0.05h/2d1 式中W0.05h 為5峰高處的峰寬； d1 為5峰高出峰頂點至峰前沿 之間的距離 除另有規(guī)定外，峰高法定量時 T 應在0.951.05 之間。 峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將 影響峰面積的準確測量。峰前峰后有 緊鄰雜質峰時，對拖尾因子作出規(guī)定。,重復性（RSD）的要求,用于評價連續(xù)進樣后，色譜系統(tǒng)響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5 次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%；采用內標法時，通常配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成3 種不同濃度的溶液，分別至少進樣2 次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大于2.0% 在質量標準中如果沒有明確規(guī)定，就是2.0%,,Company Logo,特定雜質峰定位的方法,雜質對照品,混合對照品,臨時降解,相對保留時間+參考圖,峰定位,方法的驗證,驗證 定量 限度 - 準確度 + - -精密度 + - 重復性 + - 中間精密度 （+ ） - -專屬性 + + - 檢測限 （+ ） + - 定量限 + - - 線性范圍 + - -耐用性 + +,,Company Logo,雜質含量的計算,對照品 外標法,主成分自 身對照法,加校正因 子的自身 對照法,面積歸一化法,對照品外標法,優(yōu)點,缺點,50%,定位 方便,定量準確,要求嚴,費用 高,70%,有條件時首選的方法,主成分自身對照法,優(yōu)點,缺點,50%,不需 定位,費用低,定量 粗,70%,沒條件時首選的方法,加校正因子的主成分自身對照法,優(yōu)點,缺點,50%,定位 方便,定量較 準確,需測定因子,定位難,70%,雜質與主成分響應因子差異大（超過0.91.1 ） 且對照品昂貴時選用的方法,面積歸一化法,優(yōu)點,缺點,50%,不需 定位,費用低,定量粗,70%,不提倡使用的方法,影響多 重復性差,,Company Logo,特定雜質 非特定雜質,有效雜質寬管,毒性雜質嚴控,雜質限度的規(guī)定,單個不得過 0.10%,根據(jù)生產現(xiàn)狀,雜質限度的規(guī)定,毒性雜質嚴控： -遵守公認標準 -不超越前期標準 -以相關安全實驗數(shù)據(jù)為科學依據(jù) -以保證臨床安全為根本目的,雜質限度的規(guī)定,有效雜質寬管： -不能不管（三磷酸腺苷二鈉、頭孢拉定） -不超越前期標準 -以投入產出比等利弊平衡為科學依據(jù),雜質限度的規(guī)定,非特定雜質： -不超越前期標準 -一般不得過0.10%（2010年版） - 以安全實驗和投入產出比等利弊平衡為科 學依據(jù),輔料影響的排除-有關物質檢查,前沿色譜峰，易排除 少峰，可定位，能排除 多峰，難定位，不能排除,輔料對測定的干擾,輔料對測定的干擾,1、避免使用 （輔料或方法） 2、不排除可以（默認或校正） 3、排除輔料干擾方法要明確、易重現(xiàn)、具 可操作性、配混合液 4、保證特定雜質（最具代表性降解產物） 檢出效果-不得已的最后一招,比較研究的標尺問題 -購買的對照品/標準品,對照品/標準品,權威性,真實性,準確性,-發(fā)票、標簽、批號、分析報告單、鹽基/堿基、水分,詳細精制方法、質量檢驗報告 標定方法與結果,詳細提取精制方法、質量檢驗 報告、標定方法與結果,詳細合成精制方法、質量檢驗報告、標定方法與結果,純化精制,提取精制,合成精制,比較研究的標尺問題 -非購買的對照品/標準品,建立標準時要考慮的問題,Growth,2008 2007 2006,2005 2004 2003,2002 2001 2000,數(shù)據(jù)標定：用正確的方法由至少3位實驗者，不同儀器進行不少于10個數(shù)據(jù)的測定,待標品質量考察：證明不僅是對的而且還是好的,對數(shù)據(jù)進行數(shù)理統(tǒng)計處理,比較研究的標尺問題 -對照品/標準品的標定,標定者 測定結果（%） n 均值（%） RSD（%） 1. 98.82%，99.12%，99.18%，99.25%，99.17% 5 99.11% 0.17% 2. 98.96%，99.04%，99.24%，98.98%，98.98% 5 99.04% 0.12% 3. 99.12%，98.94%，99.04%，99.04%，99.18% 5 99.06% 0.09% 經(jīng)Corchan檢驗，三位標定者的方差沒有差異，均來自同一正態(tài)分布。用Dixon法檢驗15組數(shù)據(jù)中的最大值99.25%，最小值98.82% 均非離群值。 T1-0.05S 置信區(qū)間 = X = 99.080.068 n1/2 標定結果的置信區(qū)間為99.1599.01%，因此，本批對照品的色譜純度總均值為99.08%。,對比研究對比檢驗 研究項目 原執(zhí)行標準 考察方法 原法定標準,比較研究的范圍與方法 -考察項目與方法的選擇原則,物料不同原料、輔料 分析對象 工藝不同路線、中間體 設備不同質材、參數(shù)精度 不全面沒的學（復方無有關物質） 已有標準不完善不應學（地標升國標標準） 不適用不能學（廠送設備）,為什么呢？,產品生產個性 應關注 標準隱性變化 同類最新動態(tài),如何在已有標準基礎上變化拓展,雜質研究技術,柱串聯(lián)技術 適用于溶解度無明顯差異但電荷上有明顯差異的難分離物質，通過將一根SCX（陽離子交換）短柱與一根MG C18長柱串聯(lián)就可以簡單達到將其分離的目的。 原理：有電荷差異的被分離物質進入色譜柱串聯(lián)系統(tǒng)后，帶正電荷的物質（通常是堿性物質）會由于SCX短柱的離子交換作用而被保留在短柱中，而帶負電荷的物質（通常為酸性物質）與中性物質則會毫無阻礙的通過短柱進入C18長柱中，從而成功分離；然后由于MGC18長柱中疏水性基團間的相互作用而對中性物質有強保留作用，但對帶負電荷物質無強保留作用，這樣帶負電荷物質與中性物質也簡單被分開了 如果為了讓峰形更好，各峰間分離更開，還可在陽離子交換短柱與C18長柱前接一根NH2短柱（它可與陰離子發(fā)生交換作用），進行三根串聯(lián)，也可以使帶負電荷的酸性物質與中性物質達到更好的分離效果。,毒性快速評價平臺,斑馬魚毒性快速評價平臺，對雜質的胚胎毒性、神經(jīng)毒性，心臟毒性等進行評價。 優(yōu)點： 雜質用量少 無需知道雜質結構 實驗周期短 （34天一個周期）,藥物耳毒性檢測 利用一種特殊染料對斑馬魚幼體頭部耳蝸區(qū)神經(jīng)丘毛細胞的染色，檢測毛細胞的存活狀態(tài)，來判斷檢測物的耳毒性。 下圖中紅色圈示耳蝸區(qū)域；給藥組中紅色箭頭示給藥后毛細胞減少，黃色圈示給藥后1神經(jīng)丘消失。,給藥后,系統(tǒng)對照組（正常幼體）,藥典采用現(xiàn)代分析技術舉例,由于某些藥物組成的復雜性，特別是一些生物大分子藥物，使用傳統(tǒng)的分析方法已經(jīng)不能滿足當前的質控需要，2010年版藥典逐漸改用現(xiàn)代分析技術。 首次運用毛細管電泳法 注射用抑肽酶：檢查兩個特定雜質 注射用鹽酸頭孢吡肟： 方法1-毛細管電