綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)配位化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)部分.ppt

綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)配位化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)部分,氨基酸銅配合物的模板合成 及其對(duì)質(zhì)粒DNA的切割,指導(dǎo)教師：毛宗萬(wàn) 劉文婷 黃華珍 997160366 ,中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 2013年09月,/comlab/,實(shí)驗(yàn)1 氨酸銅配合物的合成和表征 模板合成 IR光譜表征 自由基的UV光譜檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)4 DNA提取及其與氨酸銅配合物的作用 瓊脂糖凝膠電泳 凝膠成像 總學(xué)時(shí)：15 學(xué)時(shí) 地點(diǎn)：豐盛堂212室,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容, 超螺旋DNA 缺刻型DNA 線型DNA,自由基機(jī)理 自由基進(jìn)攻糖環(huán)或堿基，導(dǎo)致氧化破壞,酯水解機(jī)理 親核試劑進(jìn)攻磷原子，發(fā)生親核取代反應(yīng),酯水解機(jī)理優(yōu)于自由基機(jī)理,DNA結(jié)構(gòu)及其斷裂方式,配合物與未受損的DNA表面結(jié)合并誘導(dǎo)其斷裂 進(jìn)一步在新的斷裂處結(jié)合 斷裂反應(yīng) 互補(bǔ)鏈的斷裂,DNA的自由基斷裂,實(shí)驗(yàn)背景模擬博萊霉素,在天然物質(zhì)中，由5 個(gè)氨基酸、2 個(gè)六碳糖和1 個(gè)氨基側(cè)鏈構(gòu)成的博來(lái)霉素（bleomycin）可導(dǎo)致DNA鏈的斷裂,從而作為一族廣譜抗菌抗腫瘤藥物。,導(dǎo)致DNA鏈的斷裂原因是由于博來(lái)霉素分子的一部分是鐵或銅的配合物，這類(lèi)配合物能夠產(chǎn)生導(dǎo)致DNA鏈斷裂的自由基。,CuP-3A的配位結(jié)構(gòu)示意圖,博萊霉素的活性中心,Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292.,博萊霉素的模型化合物,Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + OH,氨基酸銅化合物的合成路線,模板反應(yīng)的化學(xué)機(jī)理,化合物1的紅外光譜,(COO-),(COO-),(NO2),(NO2),化合物2的紅外光譜,(COO-),(COO-),(NH2),氫氧自由基的形成和UV光譜檢測(cè),由于羅丹明B可與HO迅速反應(yīng)，并在553nm有強(qiáng)吸收，因此我們可以利用此反應(yīng)采用分光光度法檢驗(yàn)HO的生成。,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖 低熔點(diǎn)瓊脂糖熔點(diǎn)為6265，溶解后在37下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時(shí)，主要用于DNA片段的回收，質(zhì)粒與外源性DNA的快速連接等,凝膠濃度選擇瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍,電泳緩沖液,常用三種緩沖液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) TBE與TPE：緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀 TAE：緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TAE。緩沖液中的 EDTA 可螯合二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解,核酸電泳的指示劑,指示劑：溴酚蘭、二甲苯青 溴酚蘭：在堿性液體中呈紫蘭色，電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性DNA片段 二甲苯青：水溶液呈蘭色，電泳時(shí)，其遷移速率與雙鏈線性DNA大致相當(dāng),核酸電泳的染色劑溴化乙錠,一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光 可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min 瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般5ng 溴化乙錠太多，凝膠染色過(guò)深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察,ethidium bromide，EB,DNA斷裂的凝膠電泳圖, 超螺旋DNA 缺刻型DNA 線型DNA,電泳實(shí)驗(yàn)裝置,電泳儀（普通） 電泳槽（水平平板） 灌膠模具等,電泳實(shí)驗(yàn)方法,洗凈電泳槽，架好梳子 配制瓊脂糖凝膠及倒膠 上樣與通電 結(jié)果觀察,配制瓊脂糖凝膠及倒膠,0.5TBE電泳緩沖液100ml于三角燒瓶中，稱(chēng)取一定量的瓊脂糖粉放入后沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化，冷卻至60(需要時(shí)可加入EB)，倒入電泳槽中，待凝固。 向電泳槽中倒入0.5 TBE，其量以沒(méi)過(guò)膠面2mm為宜，小心移去梳子（如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)除去）,上樣與通電,在DNA樣品中加入0.2體積的載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi) 接通電源，一般紅色為正極黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)），電壓為1 5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算） 根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳。一般 電泳條件為：電壓 90V，時(shí)間 40min。,結(jié)果觀察和記錄,紫外儀上觀察電泳帶及其位置 拍照 進(jìn)一步使用軟件對(duì)光密度進(jìn)行分析,合成實(shí)驗(yàn)要點(diǎn),檢查回流裝置是否保持干燥 硝酸銅在稱(chēng)量前用濾紙吸干固體表面潮解的溶液 合成實(shí)驗(yàn)中前半個(gè)小時(shí)注意觀察反應(yīng)混合物的顏色變化，亮藍(lán)色或紫藍(lán)色為反應(yīng)正常 實(shí)驗(yàn)中化合物合成與DNA斷裂實(shí)驗(yàn)需交叉進(jìn)行， DNA斷裂所需的配合物由準(zhǔn)備室提供 若硝基還原使用了較多溶劑，需使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去多余溶劑 凝膠電泳照相需戴手套,模板合成大環(huán)化合物的合成方法（212室） 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去多余溶劑（212室） 紅外光譜化合物結(jié)構(gòu)表征 （210室） 紫外可見(jiàn)光譜跟蹤羅丹明B與氫氧自由基的反應(yīng) 凝膠電泳切割DNA （317室） 凝膠成像分析檢測(cè)DNA斷裂狀況（317室）,實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法,實(shí)驗(yàn)要求,做好預(yù)習(xí)（查閱藥品及溶劑的性質(zhì)、羧基和硝基的IR特征峰值、光譜技術(shù)原理及思考題預(yù)習(xí)等） 實(shí)驗(yàn)中做好實(shí)驗(yàn)記錄及相關(guān)計(jì)算（包括實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、產(chǎn)品重量、產(chǎn)率等） 做好每一次測(cè)試，并打印結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)提交最終產(chǎn)品和測(cè)試圖譜供檢查 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作簡(jiǎn)要討論 下一次實(shí)驗(yàn)提交本次實(shí)驗(yàn)報(bào)告 遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)則，嚴(yán)禁違規(guī)操作，做好清潔值日,（配位化學(xué)、生物無(wú)機(jī)化學(xué)、生物技術(shù)） V. V. Gerbeleu, V. B. Arion, J. Burgess, “Template synthesis of macrocyclic compounds”, WILEY-VCH ve