PCR實驗室檢測技術(shù).ppt

PCR實驗室 檢測技術(shù),寧夏動物疾病預(yù)防控制中心 2011.08.04,PCR檢測技術(shù),一、 PCR技術(shù)原理,DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是個比較復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無機(jī)離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因子等。,PCR是在試管中進(jìn)行DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與體內(nèi)相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱(變性)、冷卻(退火)、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制，反復(fù)進(jìn)行變性、退火、延伸循環(huán)，就可使DNA無限擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下一般都可見到DNA的特異擴(kuò)增條帶。,二、PCR技術(shù)工作流程及注意事項,（一）PCR實驗室的布局 PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴(kuò)增，應(yīng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局應(yīng)重點考慮避免這種污染。因此用于PCR檢測的實驗室要進(jìn)行功能區(qū)域劃分，從對環(huán)境要求的嚴(yán)格程度和功能上可將PCR整個實驗流程劃分為四個區(qū)域： 1.配液區(qū)（準(zhǔn)備區(qū)） 2.模板提取區(qū) 3.PCR擴(kuò)增區(qū) 4.電泳區(qū),（二）各區(qū)操作注意事項,下述操作在該區(qū)進(jìn)行： 儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。 在本區(qū)的實驗操作過程中，必須戴手套并經(jīng)常更換。 操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。 工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。 實驗室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。,1. 配液區(qū)（準(zhǔn)備區(qū)）,2. 模板制備區(qū),下述操作在該區(qū)進(jìn)行： 標(biāo)本保存、核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。 為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。 對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。 樣本處理對核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。,3. 擴(kuò)增區(qū),下述操作在該區(qū)進(jìn)行：DNA或RNA擴(kuò)增。 不能從本區(qū)再進(jìn)入任何“上游”區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。 為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區(qū)的走動。,4.電泳區(qū),下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測定。 本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。 本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應(yīng)注意實驗人員的安全防護(hù)。 本區(qū)如采用負(fù)壓或減壓情況下可減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至前面區(qū)域的可能性。,（三） PCR實驗室設(shè)置的原則,注意： 唯一流向制度問題 ：要求物流、人流均應(yīng)嚴(yán)格遵守1 2 3 4路線，嚴(yán)禁倒流。 物品的專用與移動問題 ：移液器、吸頭和離心管等為PCR專用，各區(qū)之間勿串用,三、PCR操作程序,一是PCR擴(kuò)增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取 二是PCR擴(kuò)增，即目的基因特異擴(kuò)增過程 三是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片段,*PCR模板的提取,（一）樣品的采集及前處理 活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。 組織臟器，取待檢樣品0.05g于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加2ml PBS混勻，取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用。 血清、血漿、乳汁、精液或組織滲出液，則直接取用。,（二）提取模板,提取病原微生物基因組是PCR操作成功關(guān)鍵的一步，特別是病原RNA的提取顯得非常重要。一般分為兩步： 1.裂解病原微生物，使病原基因組從病原體溢出。 2.純化病原基因組，去除蛋白質(zhì)和一些鹽類。,（三）病原微生物基因組提取注意事項,1.RNA提取應(yīng)注意RNA酶（RNase）污染問題，RNase是一種不怕熱和不易降解的蛋白質(zhì)，而且廣泛存在于我們工作環(huán)境中，對于此酶污染的防治辦法主要有兩方面：在提取RAN試劑中加入一些RNase 抑制劑 操作過程中保持環(huán)境干凈、密閉、戴口罩手套操作等。,2.在病原微生物基因組提取時，由于是微量，幾乎看不見。所以當(dāng)離心機(jī)離心沉淀RNA和DNA時要記住離心管方向，加入乙醇洗沉淀時要緩慢加入，避免沖掉已提取出來的模板。溶解沉淀時要沿著沉淀部位進(jìn)行溶解。 3.在病原微生物基因組提取時，應(yīng)注意實驗室環(huán)境污染和操作人員安全防護(hù)。,（四）實驗器材,必須使用PCR專用吸頭,試劑盒的運輸和貯存,PCR試劑盒在適當(dāng)?shù)馁A存溫度下的有效期一般為6個月 核酸擴(kuò)增部分的試劑一般要貯存于-20產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于28。,*PCR擴(kuò)增,（一）PCR反應(yīng)體系組成 PCR緩沖液(含Mg2) 模板 4種dNTP 引物 Taq酶,（二）PCR擴(kuò)增程序：,擴(kuò)增程序?qū)嶋H上是一個3種不同溫度的熱循環(huán)程序。包括高溫變性：將病原微生物基因模板94 條件下，使得雙鏈DNA分子變成單鏈DNA。有利于下一步的引物結(jié)合。低溫退火：在40至60 條件下，使引物與單鏈DNA結(jié)合的過程。便于下一步新DNA鏈形成 適溫延伸：在72條件下，沿引物合成新的DNA鏈。 在這3個溫度條件下循環(huán)30至35次，可將病原微生物特定的DNA片段放大百萬倍。,（三）PCR擴(kuò)增注意事項,試劑：盡量分裝，不要原瓶多次取用。 加入模板切忌噴霧污染，在吸取液體時，盡量避免用力過快吸取。避免反應(yīng)成分或模板噴到移液器上，污染移液器和環(huán)境。所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板DNA后應(yīng)更換手套。,*瓊脂糖凝膠電泳分析,擴(kuò)增基因片段需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，依據(jù)擴(kuò)增DNA片段在電泳中遷移的距離判定其大小，與已知擴(kuò)增基因片段相比較來判定PCR擴(kuò)增效果。 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析時，一般情況下先在凝膠中加1%溴化乙錠（EB)(每100ml加10ul)然后將已經(jīng)制備好的1%-2%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配制）放入電泳槽內(nèi)，加入待檢樣品，同時用分子量標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)記。待檢樣品進(jìn)入凝膠內(nèi)溴酚藍(lán)遷移2-3cm后，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下觀察結(jié)果。 由于EB可與雙鏈DNA形成結(jié)合物，在紫外燈下能發(fā)射熒光，使EB的熒光強度增強80-100倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。,電泳所需試劑,瓊脂糖 溴化乙錠 電泳緩沖液 上樣緩沖液 Macker,電泳槽,電泳儀,凝膠成像系統(tǒng),PCR結(jié)果。1、對照(無模板)；26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）,瓊脂糖凝膠電泳分析注意事項,電泳上樣時避免PCR產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定。 用電泳緩沖液制備瓊脂糖凝膠。 溴化乙錠（EB）為強致癌物質(zhì)，必須戴手套謹(jǐn)慎操作，搖動時不要外濺。,四、PCR檢測常見問題與解決途徑,利用PCR方法檢測時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴(yán)重后果。為了提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，PCR檢測應(yīng)盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶現(xiàn)象的發(fā)生。一個好的PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、重現(xiàn)性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增。,（一）假陽性：,造成假陽性的原因 1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染； 2. PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。 3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。 4. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。,假陽性問題的試驗控制,在每次PCR檢測時，一定設(shè)立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品進(jìn)行判定。只有設(shè)立試驗全程的對照，才能證明試驗結(jié)果成立。,（二）假陰性,如果實驗中設(shè)置的陽性對照未能擴(kuò)增成陽性結(jié)果，提示本次實驗中可能有假陰性結(jié)果。但這里應(yīng)注意，許多國產(chǎn)PCR試劑盒中陽性對照采用質(zhì)粒DNA，和標(biāo)本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，如果在標(biāo)本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對照均呈陽性，標(biāo)本檢測中還可能有假陰性。,造成假陰性原因：,1.儀器因素 2.試劑質(zhì)量問題 3.核酸模板問題：模板中含有雜蛋白質(zhì)；模板中含有 Taq 酶抑制劑；模板核酸變性不徹底等。 4.操作人員素質(zhì)問題：PCR實驗的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計錯誤等等都能造成結(jié)果的假陰性。,假陰性解決方案 1.檢查PCR試劑是否失效 2.選擇與優(yōu)化樣