藥物分析抗生素.ppt

,抗生素類藥物的分析,進(jìn)入,返回主目錄,思考與練習(xí),第一節(jié) 概 述,第二節(jié) 內(nèi)酰胺類抗生素,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素,第五節(jié) 抗生素類藥物中高分 子雜質(zhì)的檢查,基本要求,基本要求,一、掌握抗生素類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分析方法之間的關(guān)系。 二、掌握抗生素類藥物的鑒別原理與方法。 三、掌握抗生素類藥物法定含量測(cè)定方法的原理、測(cè)定方法與計(jì)算。 四、熟悉抗生素類藥物雜質(zhì)檢查的方法。 五、了解抗生素類藥物中高分子聚合物檢查。,返 回,第一節(jié) 概述,1. 抗生素藥物的特點(diǎn),化學(xué)純度較低,活性組分易發(fā)生變異,穩(wěn)定性差,2. 微生物學(xué)法與理化法的比較,微生物檢定法,理化法,以抗生素對(duì)微生物的殺傷或抑制程 度為指標(biāo)衡量抗生素的生物效價(jià),根據(jù)抗生素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用其 特有的理化性質(zhì)測(cè)定其含量,已知或新發(fā)現(xiàn)的抗生素、精致品或 粗制品均能測(cè)定,測(cè)定化學(xué)結(jié)構(gòu)已知、已提純的 抗生素,靈敏度高、樣品需用量小、反映抗 生素的醫(yī)療價(jià)值，但操作步驟多、 費(fèi)時(shí)、誤差大,迅速、準(zhǔn)確、專屬性高、樣品 需用量小、操作簡(jiǎn)單、省時(shí),3.抗生素的活性以效價(jià)單位來表示：,每ml或每mg中含有某種抗生素的有效成分的多少，用單位（u）或g 表示。 1mg青霉素G鈉鹽定為1667單位 1mg青霉素G鉀鹽的單位（u） =1667356.4/372.5=1595u/mg,分類（按結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）： 內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、 四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、 氯霉素類、多肽類、抗腫瘤類 林可霉素類、其他抗生素類,返 回,第二節(jié) 內(nèi)酰胺類抗生素,青霉素類,頭孢菌素類,青霉素,（青霉素鉀、鈉）,氨芐西林 （氨芐青霉素）,阿莫西林 （羥氨芐青霉素）,普魯卡因青霉素,頭孢氨芐,頭孢拉啶,頭孢羥氨芐,頭孢噻吩鈉,酸性,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì),一、,與堿金屬(Na+、K+)成鹽,（一）羧基,易溶于水,與有機(jī)堿(普魯卡因)成鹽,難溶于水,普魯卡因青霉素,（二）手性C,頭孢菌素類 C6 C7,青霉素類 C3 C5 C6,旋光性,（三）共軛體系,青霉素類 母核無(wú)明顯UV 多數(shù)有苯環(huán)取代基,UV,（四）內(nèi)酰胺環(huán),水溶液 不穩(wěn)定,干燥純凈 穩(wěn)定,不穩(wěn)定性因素,四元環(huán)張力大,酰胺鍵易水解,例,青霉素的降解反應(yīng),（一）呈色反應(yīng),1. 羥肟酸鐵反應(yīng),-內(nèi)酰胺類,呈色,羥肟酸衍生物,（紅、棕、褐）,2. 茚三酮反應(yīng),-氨基,藍(lán)紫色,3. 雙縮脲反應(yīng),似肽鍵,紫,4. 與重氮苯磺酸反應(yīng),橙黃色,重氮苯磺酸,-,-,5,6,OH,H,C,（偶合）,酚羥基,頭孢哌酮,5. 與變色酸-硫酸反應(yīng),活潑“-CH2-”,青霉素 阿莫西林 氨芐西林,（分解）,變色酸,顯色,1. K+、Na+的火焰反應(yīng),（二）各種鹽的反應(yīng),2. 沉淀反應(yīng)（青霉素鹽）,遇酸,在過量HCl或 有機(jī)溶劑中溶解,3. 重氮化 - 偶合反應(yīng),重氮化-偶合反應(yīng),芳伯氨基,4. 與三硝基苯酚反應(yīng),二芐基乙二胺,mp,三硝基苯酚,樣品、分解產(chǎn)物,Cu2+,pH3.8,分子重排,2、,IR法,3180cm-1 N-H,內(nèi)酰胺 C=O,1780cm-1,3470cm-1 O-H,1690cm-1 仲酰胺C=O,1250cm-1 C-O,以阿莫西林為例,對(duì)照品對(duì)照法,三、雜質(zhì)檢查,藥物 檢查項(xiàng)目 檢查方法 頭孢他啶 聚合物 HPLC法 頭孢曲松鈉 頭孢哌酮鈉 頭孢噻肟鈉 頭孢呋辛酯 有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體 HPLC法 頭孢氨芐 有關(guān)物質(zhì) 反相TLC法 青霉素鉀（鈉） 吸收度 紫外分光光度法,1.頭孢他啶聚合物的測(cè)定 固定相：葡聚糖凝膠G-10（ 40120m ） 流動(dòng)相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液 流動(dòng)相B：0.01%十二烷基硫酸鈉 對(duì)照品溶液：頭孢他啶對(duì)照品 100g/ml,1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000、流動(dòng)相A測(cè)定；重復(fù)性用對(duì)照品溶液、流動(dòng)相B測(cè)定。 N不低于900，拖尾因子0.751.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%。 2）測(cè)定方法 進(jìn)樣供試液，用流動(dòng)相A；進(jìn)樣對(duì)照液，用流動(dòng)相B。以外標(biāo)法計(jì)算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得超過0.3%。,2.頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查 固定相：ODS 流動(dòng)相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38） 1）頭孢呋辛酯2-異構(gòu)體的制備：頭孢呋辛酯對(duì) 照品+流動(dòng)相 頭孢呋辛酯2-異構(gòu)體。 2）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：各異構(gòu)體之間的R1.5，以 頭孢呋辛酯A異構(gòu)體計(jì)算n1500。,3）異構(gòu)體： tR1 相對(duì)保留時(shí)間 r12=- 1-被測(cè)物 tR2 2-標(biāo)準(zhǔn)物 異構(gòu)體 相對(duì)保留時(shí)間 判斷 B異構(gòu)體 0.85 供試液譜圖中A異構(gòu)體的峰面積 A異構(gòu)體 1.0 與A、B異構(gòu)體峰面積和之比應(yīng) 為0.480.55。,3.頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查-反相TLC法 固定相：活化后的硅膠G板置5%（V/V）正十四 烷的正己烷溶液中，展至頂部，涼干 展開劑：0.1mol/L枸櫞酸-0.2mol/L磷酸氫二 鈉-丙酮（120：80：3） 供試液：本品 50mg/ml 對(duì)照液（1）：本品 0.5 mg/ml 對(duì)照液（2）：-苯甘氨酸 0.5 mg/ml 對(duì)照液（3）：7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸 0.5 mg/ml,結(jié)果判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對(duì)照液（2）（3）位置相同上所的斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深；如顯其他雜質(zhì)斑 點(diǎn)，與對(duì)照液（1）所顯的主斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深。,4.青霉素鈉（鉀）的吸收度檢查： 供試液 1.80mg/ml， 結(jié)果判斷：A280不得大于0.10,水解產(chǎn)物,定量過量,剩余,ChP,四、含量測(cè)定,反應(yīng)分兩步進(jìn)行： 1. 水解反應(yīng)(按化學(xué)計(jì)算量進(jìn)行) 2. 氧化-還原反應(yīng)(無(wú)固定的量關(guān)系，受溫度、PH值和時(shí)間等因素影響，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件并采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定),第一步,第二步,V樣空,V樣,V對(duì)空,V對(duì),空白試驗(yàn),A、消除樣品已降解產(chǎn)物的干擾 B、消除樣品中其他消耗碘的雜 質(zhì)的干擾 C、消除碘揮發(fā)造成的誤差,以未經(jīng)水解的樣品作空白測(cè)定,空白,樣品,Na2S2O3,采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定,A、可消除溫度、pH、操作、環(huán) 境等條件的影響 B、使本法測(cè)定結(jié)果與微生物檢定 法一致,（1）弱酸性 pH4.5,堿 I2 IO3- + I-,酸 普魯卡因與碘在酸性條件 下會(huì)產(chǎn)生復(fù)鹽沉淀,（2）溫度 2426,溫度38 未水解的供試品亦消耗碘,（3）水解時(shí)間,以水解20分鐘后的耗碘量最大,（4）反應(yīng)時(shí)間,反應(yīng)20分鐘后，耗碘量隨時(shí)間的 變化較小，可減小含量測(cè)定的誤 差。,（1）靈敏度高,樣品 : 碘 = 1 : 8,（2）反應(yīng)條件、實(shí)驗(yàn)操作要求高,加試劑次序、反應(yīng)時(shí)間、滴定速度相同,4I28I-,原料,制劑,SH,R,OH,-,-,青霉素族,（水解）,青霉素族,ChP,滴定,水解,(降),空,醋酸鹽緩沖液,V,(NO3)2,Hg,pH4.6,滴定,樣 品,以未經(jīng)水解的樣品作空白測(cè)定,（1）水解必須完全,（2）汞鹽滴定液用EDTA標(biāo)定,（3）空白試驗(yàn) 消除已降解產(chǎn)物干擾,（4）優(yōu)點(diǎn) 不需標(biāo)準(zhǔn)品,可見-紫外分光光度法,（三）,穩(wěn)定劑,（1）原理,青霉烯酸硫醇汞鹽,青霉素族,HgCl2,（咪唑）,（2）方法,對(duì)照品法,計(jì)算,pH 9,（3）注意,側(cè)鏈有-NH2時(shí)，需加醋酐先 將其乙酰化后才能發(fā)生上述 反應(yīng),紅色,NaOH,羥肟酸衍生物,ChP,特點(diǎn) 快速、高效、靈敏 專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好 一法多用（鑒別、檢查、含測(cè)）,返 回,第三節(jié) 氨基糖苷類抗生素,鏈霉素 雙氫鏈霉素 新霉素 卡那霉素 慶大霉素 巴龍霉素,鏈霉胍 + 鏈霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,鏈霉胍,鏈霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,鏈霉胍,鏈霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,D-葡萄糖胺+脫氧鏈霉胺+D-核糖+巴龍霉糖,巴龍胺,巴龍二糖胺,D-葡萄糖胺,脫氧鏈霉胺,D-核糖,巴龍霉糖,絳紅糖胺 + 脫氧鏈霉胺 + 加洛糖胺,絳紅糖胺,紫素胺,2-脫氧鏈霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3- 去氧-4-甲 基戊糖胺,慶大霉素C復(fù)合物 慶大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 慶大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 慶大霉素C1a R、R1、R2=H 慶大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 慶大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,多與硫酸成鹽,堿性,（一）,鏈霉素 pH57.5 慶大霉素 pH212,羥基胺結(jié)構(gòu),氨基糖苷類,H+,糠醛,羥甲基糠醛,-萘酚 蒽酮,呈色,紅紫色,甲基葡萄糖胺,巴龍霉素,鏈霉素,水解,-,N,吡咯衍生物,紅色,（Elson-Morgan反應(yīng)）,慶大霉素,紅色,鏈霉素特征反應(yīng),紫紅,麥芽酚,鏈霉胍特有反應(yīng),8-羥基喹啉,-萘酚,H+,慶大霉素?zé)oUV吸收,（八）色譜法,（1）TLC法：硫酸慶大霉素的鑒別 點(diǎn)樣：供試液：展開、涼干、碘蒸氣中顯色 對(duì)照液 判斷：供試液與對(duì)照液所顯斑點(diǎn)的顏色與位 置應(yīng)一致。 點(diǎn)樣：供試液 對(duì)照液：硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品 對(duì)照液：硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品 + 硫酸 新霉素標(biāo)準(zhǔn)品+ 硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品,判定法：供試液中主斑點(diǎn)的位置、顏色、大小 應(yīng)與對(duì)照液 相同， 對(duì)照液應(yīng)顯示分離清晰的3個(gè)斑點(diǎn) 否則試驗(yàn)無(wú)效。 （2）HPLC法：硫酸慶大霉素的鑒別 比較供試液與對(duì)照液各組分的保留時(shí)間。,鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）,方法 TLC中的對(duì)照品法（BP）,1. 來源 反應(yīng)中間體,發(fā)酵菌種不同 工藝差別,規(guī)定控制各組分的相對(duì)百分含量,ChP USP BP JP,+,+,4,10,.,pH,吲哚衍生物,巰基醋酸,鄰苯二醛,氨基,max = 330nm,衍生化原理,1.,1-烷基硫代-2-烷基 異吲哚衍生物,RPHPLC,規(guī)定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面積歸一化法,微生物檢定法 各國(guó)藥典主要采用,HPLC法 常用于體內(nèi)藥分,返 回,第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四環(huán)素（TC）tetracycline,金霉素 (CTC) chlortetracycline,氯四環(huán)素,土霉素 (OTC) oxytetracycline,氧四環(huán)素,多西環(huán)素 (DOXC) doxycycline,脫氧土霉素,美他環(huán)素（METC） metacycline,pH3 7.5 熒光,（二）旋光性,1.,差向異構(gòu)化,差向金霉素,差向四環(huán)素,金霉素,四環(huán)素,-,4,-,4,6,2,pH,淡黃黑,藍(lán)色熒光,差向四環(huán)素,（土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）,（1）酸性下降解,max = 445nm,max = 435nm,橙黃色,脫水四環(huán)素,TC,ETC,ATC,EATC,（2）堿性下降解,異四環(huán)素,四環(huán)素,鹽酸土霉素的鑒別,EDTA 克服痕量金屬造成的 拖尾現(xiàn)象,比較保留時(shí)間,三、,特殊雜質(zhì)檢查, 4-差向四環(huán)素（ETC） 脫水四環(huán)素（ATC） 差向脫水四環(huán)素（EATC） 鹽酸金霉素（CTC）,HPLC法（2000版）,鹽酸四環(huán)素,四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)TLC圖,4,0.5,0.5,2,nm,max,355,268,l,、,鹽酸四環(huán)素,雜質(zhì)吸收度,取供試品配成每毫升10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm處測(cè)定，其吸收度不得超過0.12。,應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間,HPLC法,鹽酸四環(huán)素的測(cè)定 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：鹽酸四環(huán)素、有關(guān) 物質(zhì)及ATC峰間的 分離度均應(yīng)符合要 求。 定量方法：外標(biāo)法以峰面積計(jì)。,返 回,第五節(jié) 抗生素類藥物中高分子 雜質(zhì)的檢查,1.高分子雜質(zhì) 分子量大于藥物本身的雜質(zhì)總稱。,蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物。主要來自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。 藥物的自身聚合物，來自于生產(chǎn)、貯存過程?？梢l(fā)過敏。,外源性雜質(zhì),內(nèi)源性雜質(zhì),3.高分子雜質(zhì)的質(zhì)控方法 （1）凝膠色譜法測(cè)定高分子雜質(zhì)：使高分子雜質(zhì) 與藥物分離。 （2）高分子雜質(zhì)的控制方法-自身對(duì)照外標(biāo)法 原理：測(cè)定在Kav=0處 藥物締合物的峰響應(yīng) 指標(biāo) 樣品中高分子雜質(zhì)的響應(yīng)指標(biāo) 按外標(biāo)法計(jì)算，得樣品中高分子雜質(zhì) 相當(dāng)于藥物本身的相對(duì)含量。,（3）高分子雜質(zhì)的分析方法 簡(jiǎn)單測(cè)定系統(tǒng)：葡聚糖凝膠G-10（40 120m）柱. HPLC系統(tǒng):葡聚糖凝膠G-10柱.,返 回,練習(xí)與思考,A型題,1. 硫酸鏈霉素、硫酸青大霉素的鑒別方法是 A.三氯化鐵反應(yīng) B. 硫色素反應(yīng) C. 茚三酮反應(yīng) D.與堿性酒石酸銅試液反應(yīng) E. 雙縮脲反應(yīng),2. 青霉素鈉中