解毒與活血配伍干預高脂血癥與動脈粥樣硬化的臨床及機理研究.ppt

解毒與活血配伍干預 高脂血癥與動脈粥樣硬化 的臨床及機理研究,張文高 吳 敏 劉美霞 劉龍濤 殷鏡海 孟紅艷 山東中醫(yī)藥大學及附屬醫(yī)院 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院、西苑醫(yī)院 廣州中醫(yī)藥大學，山東省立醫(yī)院 2009-09-05,基金項目資助,高等學校博士學科點專項科研基金（No.20060441002） 中國博士后科學基金 （20070410622） 國家中醫(yī)藥管理局科技計劃項目 （04-05LP30） 山東省中醫(yī)管理局科技計劃項目,研究背景與研究思路,高脂血癥是動脈粥樣硬化（As）主要的病理基礎 As導致的心腦血管疾病是當今人類死亡的首位原因 As易損斑塊（即“不穩(wěn)定斑塊”）的潰破、出血，隨后血栓形成，是引起急性冠脈綜合征（ACS）、急性腦梗死等心腦血管病急癥的主要內因,研究背景與研究思路,如何調脂、抗As、抑制As斑塊形成和穩(wěn)定斑塊，對于防治心腦血管疾病、改善其預后有著極重要的價值 多種活血化瘀藥有調脂作用，活血化瘀防治As性疾病的療效已得到公認 如何進一步提高活血化瘀藥對于此類疾病的療效、尋求更有效的中醫(yī)藥治法？值得我們深思。,研究背景與研究思路,Ross教授1999年提出的“As是一種炎癥性疾病”已得到學術界共識。炎癥介質在As斑塊的起始、進展以及斑塊的易損性（不穩(wěn)定性）和最終破裂過程中，都起著重要作用。,研究背景與研究思路,將這一現(xiàn)代醫(yī)學新進展聯(lián)系中醫(yī)藥理論和臨床，進行中西醫(yī)結合創(chuàng)新性思考，我們認為單純的活血化瘀對炎癥病理環(huán)節(jié)作用顯得不足，提出從毒邪致病理論對心血管病急重癥中醫(yī)病機與治則進行創(chuàng)新探討的思路,研究背景與研究思路,7年前提出，不穩(wěn)定型心絞痛作為心絞痛的特殊類型具有毒邪致病的特點，毒損心絡為不穩(wěn)定型心絞痛的重要病機，解毒為其重要治法； 5年前提出毒邪損心是充血性心力衰竭的重要病機，通過臨床研究驗證了益氣活血解毒的療效優(yōu)勢； 后來又提出“毒、瘀致易損斑塊”和“解毒活血法穩(wěn)定易損斑塊”的假說。,研究背景與研究思路,相應提出清熱解毒與活血化瘀配伍可望進一步提高對相關疾病的療效。 沿著這一思路，進行了解毒與活血配伍，以及解毒與益氣活血配伍，防治高脂血癥、頸動脈粥樣硬化、不穩(wěn)定型心絞痛等臨床研究和干預As斑塊、穩(wěn)定斑塊相關的實驗研究。,C57BL株系,Jackson 實驗室,美國緬因州，世界上最重要的老鼠遺傳學研究中心之一,1986-1989年培育出第一只基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功,基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠,美國科學家于1992年培育成功的載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠，在正常飲食下即可形成明顯的高脂血癥及彌漫纖維增殖性As損傷病灶。成為研究As發(fā)病機理、干預措施、篩選抗As藥物及機理研究較理想的動物模型。,研究背景與研究思路,本課題組從2000年開始，在國內外率先應用ApoE基因敲除小鼠開展心血管病中醫(yī)、中西醫(yī)結合基礎研究，得到多項基金資助 山東省自然科學基金（Y2001C14） 國家自然科學基金（30472275） 山東省科技項目（200571-6） 高校博士點科研基金（20060441002）,研究背景與研究思路,進行血脂康、脂欣康、脈心康和多種單味活血化瘀、清熱解毒中藥以及多種解毒活血配伍藥對對ApoE基因敲除小鼠降脂、抗As及穩(wěn)定As易損斑塊作用與機理研究，為中醫(yī)藥防治高脂血癥、As及穩(wěn)定易損斑塊提供了科學依據(jù)，也為解毒與活血配伍抗As研究奠定了基礎。,研究背景與研究思路,在此實驗研究基礎上，結合長期臨床經驗，重點研究了若干解毒與活血配伍的創(chuàng)新藥對: 虎杖與山楂配伍 大黃與紅曲配伍 虎杖與芎芍膠囊配伍,虎杖與山楂,虎杖具有解毒消腫、利濕等功效 山楂擅長活血行滯而消積 兩者配伍不僅有前期實驗論證的基礎，而且已經應用于臨床科研，療效顯著。,虎杖與山楂,虎杖,解毒消腫,利 濕,虎杖苷,抗炎作用,保護血管內皮,抑制血小板聚集,抑制內皮細胞增殖,抑制血管平滑肌細胞增殖,抗 As,山楂,活血行滯,消 積,山楂提取物,調節(jié)血脂作用,抗氧化作用,降壓作用,抑制血小板聚集,為了深入研究解毒（虎杖）與活血（山楂）配伍的調脂、抗As、穩(wěn)定斑塊作用及其作用機制 臨床研究高脂血癥 頸動脈粥樣硬化斑塊 實驗研究ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞源性泡沫細胞試驗,第一部分 解毒與活血配伍干預高脂血癥與動脈粥樣硬化的臨床研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）治療中老年高脂血癥合并脂肪肝的臨床研究 二、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）對頸動脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性干預作用研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）治療中老年高脂血癥合并脂肪肝的臨床研究,研究方法與內容,參照血脂異常防治建議標準、非酒精性脂肪性肝病診斷標準及腹部疾病超聲診斷制定。,本研究納入病例來自濟南市機床二廠集團職工及家屬。,符合上述高脂血癥及脂肪肝診斷標準者。年齡在4069歲之間者。,診斷標準,病例來源,納入標準,空白對照組 20例,山楂虎杖配伍組 （活血解毒配伍組）,虎杖組（解毒組） 20例,山楂組（活血組） 20例,洛伐他汀組 20例,分 組 及 治 療 方 法,山楂提取物,虎杖提取物,山楂提取物及 虎杖提取物,洛伐他汀,不給予藥物,20例,A,B,C,D,E,空白組,山楂組,觀察項目,安全性觀察,療效性觀察,臨床癥狀總療效,對血脂的影響,降脂療效,對肝功能的影響,對脂肪肝超聲聲像分度改善療效,對炎癥因子的影響,結 論,解毒活血配伍（虎杖山楂配伍）方案治療高脂血癥合并脂肪肝療效可靠， 優(yōu)于單純解毒（虎杖）或活血（山楂）， 其作用機制與降脂、抗炎和保肝等有關。,二、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）對頸動脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性干預作用研究,頸動脈粥樣硬化斑塊檢測意義,頸動脈粥樣硬化的病變程度與心腦血管疾病的發(fā)生有直接的相關性 通過觀察頸動脈粥樣硬化程度，可客觀地估計以As為病理基礎的心腦血管疾病的發(fā)病危險性及治療效果,頸動脈粥樣硬化及斑塊的診斷,頸動脈內中膜厚度（IMT） 是指動脈內膜和中膜平滑肌的厚度，即由管腔內膜面的前緣到中膜平滑肌與外膜交界面前緣的垂直距離。,穩(wěn)定性斑塊,扁平斑,硬斑,軟斑,潰瘍斑,不穩(wěn)定性斑塊,解毒組（虎杖提取物組， A組） 活血組（山楂提取物組 ，B組） 解毒活血配伍組（虎杖提取物與山楂提取物配伍組， C組） 洛伐他汀對照組（D組） 空白對照組（E組） 各30例，療程6個月,各組病例治療后臨床癥狀總療效比較,各組病例治療前后中醫(yī)癥狀積分比較,*,*,*,*,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,*,*,#,#,#,#,#,#,#,#,#,*,*,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,*,#,#,#,*,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,頸動脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標比較,*,*,頸動脈血流動力學檢測比較,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,頸動脈血流動力學檢測比較,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,*,*,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,*,*,*,*,#,#,#,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,第二部分 研究結果,斑塊穩(wěn)定性血清指標檢測,#,*,*,血壓水平比較,*,*,*,*,血脂水平比較,*,*,*,*,小 結,解毒與活血配伍 顯著改善患者癥狀 顯著減小頸動脈IMT、IMTarea、MIMT、斑塊積分，增大管腔內徑，緩解管腔狹窄程度，改善頸動脈斑塊超聲病理分型及頸動脈血流動力學 具有調脂、降壓、抗炎（降低hs-CRP、sICAM-1、sVCAM-1）、減少細胞外基質降解（降低MMP-1及MMP-1/TIMP-1比值）等作用,小 結,解毒與活血配伍具有抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊的作用 解毒與活血配伍療效優(yōu)于單純解毒組、活血組及洛伐他汀組,第二部分 解毒與活血配伍干預 載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈 粥樣硬化泡沫化細胞形成機制研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）干預載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化泡沫化細胞形成的炎癥機制研究 二、從PPAR、ABCA1、CD36途徑探討解毒活血中藥配伍干預載脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬細胞源性泡沫細胞的分子機制,ApoE基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞較普通小鼠更容易攝取ox-LDL而形成泡沫細胞，是進行體外培養(yǎng)巨噬細胞源性泡沫細胞研究的理想選擇。 單核巨噬細胞經外源性致炎物質脂多糖（LPS）激活，攝取ox-LDL，并吞噬大量脂質形成泡沫細胞，是早期As的標志。,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍） 干預載脂蛋白E基因敲除小鼠 動脈粥樣硬化泡沫化細胞形成 的炎癥機制研究,ApoE（-/-）小鼠,腹腔巨噬細胞培養(yǎng),分為B-G組與ox-LDL+LPS 共孵育，并分別加藥干預,B 虎 杖 苷,C 山 楂 提 取 物,D 虎杖 苷山 楂提 取物 組,E 洛 伐 他 汀 組,F 羅 格 列 酮 組,G 模 型 組,A 空 白 對 照,分別觀察0、24、48h 三個不同時相的 以下指標變化,Western blot,ELISA,TLR4 NF-B,TNF- IL-1,數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析,技 術 路 線,這部分工作明天上午將由 劉美霞、劉龍濤博士匯報,IL-1含量,TNF-含量,NF-B蛋白表達,TLR4蛋白表達,結 論,解毒活血中藥配伍能顯著減少ox-LDL、LPS誘導的ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞源性泡沫細胞內TLR4的表達， 抑制NF-B的激活， 進而減弱TLR4/NF-B信號途徑及IL-1、TNF的合成與釋放， 抑制炎癥反應，干預巨噬細胞泡沫化，延緩As的發(fā)生與發(fā)展； 解毒活血配伍的上述作用優(yōu)于羅格列酮，也優(yōu)于單純解毒或活血。,二、從PPAR、ABCA1、CD36途徑 探討解毒活血中藥配伍 干預載脂蛋白E基因敲除小鼠 巨噬細胞源性泡沫細胞的分子機制,PPAR、 CD36與ABCA1,過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）調控體系是目前As研究中的熱點之一。PPAR屬于核受體超家族中PPARs家族的成員，是配體依賴性的轉錄因子，在調節(jié)脂質代謝、脂肪細胞分化和能量代謝中起關鍵性作用。,PPAR、 CD36與ABCA1,B類清道夫受體CD36、三磷酸腺苷結合盒轉運子A1 (ABCA1)都是PPAR轉錄調控的下游靶基因。 PPAR配體調控網(wǎng)絡已被證實具有抗As作用。近年研究表明PPAR可通過其活化后對下游靶基因CD36、ABCA1轉錄水平調控及相關細胞因子的釋放來影響As泡沫細胞的形成。,研究方法,ApoE（-/-）小鼠,腹腔巨噬細胞培養(yǎng),分為B-G組與 ox-LDL+LPS 共孵育，并 分別加藥干預,B 虎 杖 苷,C 山 楂 提 取 物,D 虎杖 苷山 楂提 取物,E 洛 伐 他 汀,F 羅 格 列 酮,G 模 型 組,A 空 白 對 照,分別觀察0、24、48h 三個不同時相的以下 指標變化,RT-PCR,PPAR CD36 ABCA1,數(shù)據(jù)整理 統(tǒng)計分析,PPAR上游引物為5-CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT -3， 下游引物為5-AAT CCT TGG CCC TCT GAG AT-3（403bp）； ABCA1上游引物為5-CAG ATG CCC TAC CCC TGT TA-3， 下游引物為5- GGG AGA AGA GCG TGC TAA TG-3（364bp）； CD36 上游引物為5-CCT TAA AGG AAT CCC CGT GT -3，下游引物為5-CCA ATG GTC CCA GTC TCA TT-3（418bp）； -actin上游引物為5- TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA -3，下游引物為5- TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG -3（302bp）。,各引物序列,細胞總RNA提取及RT-PCR反應均采用RT-PCR檢測細胞因子試劑盒（購自上海生工生物工程技術有限公司）。 收集107細胞沉淀提取細胞總RNA，取1ug逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增（所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行）。,RNA提取和RT-PCR反應,擴增條件 94度1分鐘，58度1分鐘，72度 1分鐘，共35個循環(huán)，最后72度延長7分鐘。 取各基因擴增產物10ul，經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，多功能紫外投射反射分析儀下觀察并拍照，采用美國Kodak凝膠分析系統(tǒng)，應用1 D Image Analysis Software進行產物灰度圖像分析，以各基因與-actin的電泳條帶光密度值的比值作為各基因的相對表達量。,研究結果1,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞PPARmRNA表達的影響,研究結果 1,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞PPARmRNA表達的影響,#,#,#,#,與模型組比較,與解毒活血配伍組比較,研究結果2,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞ABCA1mRNA表達的影響,研究結果2,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞ABCA1mRNA表達的影響,#,#,#,與解毒活血配伍組比較,與模型組比較,#,研究結果3,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞CD36mRNA表達的影響,研究結果3,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細胞CD36mRNA表達的影響,#,#,#,#,與解毒活血配伍組比較,#,小 結,用ox-LDL、LPS刺激ApoE(-/-)小鼠腹腔巨噬細胞，可以誘導泡沫細胞的形成， 細胞內PPAR、ABCA1、CD36的mRNA表達均顯著增高。,小 結,與模型組比較， 以洛伐他汀、羅格列酮作為對照， 以解毒中藥虎杖、活血中藥山楂及其配伍作為主要研究藥物進行干預48h后， 各用藥組PPAR、ABCA1的mRNA表達均顯著增高， 各用藥組CD36mRNA的表達顯著降低， 解毒活血配伍組優(yōu)于單純解毒組、活血組及洛伐他汀組，相當于或優(yōu)于羅格列酮組。,研究提示,解毒活血中藥配伍具有與羅格列酮相似的PPAR激動作用， 可能通過激活PPAR，從轉錄水平調節(jié)下游靶基因CD36、ABCA1及炎癥因子的表達， 干預ox-LDL-PPAR-CD36與ox-LDL-PPAR-ABCA1兩條信號通路，使ABCA1mRNA表達上調、CD36mRNA表達下調， 從而起到顯著抑制巨噬細胞泡沫化過程，最終達到抗As的作用。 解毒活血中藥配伍有望成為中醫(yī)藥領域抗As泡沫細胞形成的新型藥