RT-PCR實驗步驟.doc

RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不會出太大問題。3. PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。1）RT和PCR時的引物設(shè)計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須在RT時，引物設(shè)計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產(chǎn)物做PCR 的模板繼續(xù)擴增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？問題：在做RT-PCR遇到一怪現(xiàn)象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結(jié)果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結(jié)果，百思不得其解?。ㄗⅲ阂芽隙ㄔ摶蛟趦煞N組織中都表達，且內(nèi)參照在兩種組織都可擴增出來）從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關(guān)呢？ 請高手指教！解答：1.RT-PCR有兩種做法：條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現(xiàn)象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR應(yīng)具備的條件高質(zhì)量的RNA（保留后可做5，3RACE）；引物的（最好產(chǎn)物短點）；若涉及粗略定量的話還應(yīng)考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內(nèi)標分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實很不容易將RNA的濃度以及內(nèi)標分子的表達量調(diào)整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE我做過RACE（3RACE是寶生物的Kit；5RACE是Gibico），但現(xiàn)在再進行另一個同源基因的3RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經(jīng)獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3UTR太長的緣故，我都快綠了，有無RT-PCR的常用內(nèi)標bactin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。有關(guān)內(nèi)參：RT-PCR內(nèi)參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統(tǒng)一配，拍照后，算目的基因和內(nèi)參的比值，這就是基因表達的相對濃度。問：我曾經(jīng)作過同一管的PCR，內(nèi)有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質(zhì)量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其實沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的-，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應(yīng)該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。關(guān)鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。有關(guān)內(nèi)參的建議：一定要做內(nèi)參的，每一次，我想。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的電泳可以不一起跑，沒有關(guān)系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎(chǔ)的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結(jié)果的，3、半定量RT-PCR應(yīng)該再兩管中進行，除非內(nèi)參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。關(guān)于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數(shù)期，只不過碰巧2的冥和2的倍數(shù)是相同的?？瓷先ト魏我粋€時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學(xué)的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學(xué)的東西。我們學(xué)醫(yī)的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關(guān)系，這種反應(yīng)單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這圖我在 * 帖過。關(guān)于引物設(shè)計，再可能的情況下，除了常規(guī)要求之外，最好兼顧跨內(nèi)含子（不過，根據(jù)要求，還可以專門設(shè)計隔內(nèi)含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp600bp等等。引物當然要設(shè)計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披，也不用查。我反復(fù)說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時候，還沒發(fā)現(xiàn)呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內(nèi)含子的問題呢？18s的引物也和著名的actin一樣是設(shè)計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準多了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看家基因，所以定量更加準確，我想，不知對不對，請幾位主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數(shù)量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務(wù)于整個基因組表達譜什么的。PE有專門的用于實時PCR的內(nèi)參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。有那位高手用過18s的內(nèi)參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉(zhuǎn)錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。我覺得做RT-PCR的方法和條件及應(yīng)注意的事項就是那么幾條,許多專業(yè)書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經(jīng)多次磨難，有時就是得不出結(jié)果。因此，我認為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經(jīng)歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。記得我開始我的PCR時，按常規(guī)方法，提取總后，首先用自己設(shè)計的下游引物進行逆轉(zhuǎn)錄，不斷改變反應(yīng)條件，進行了次均沒有結(jié)果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實驗另一位同學(xué)克隆的片斷當中，而該同學(xué)已經(jīng)用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些產(chǎn)物做模版再進行時也沒辦法重復(fù)出她的產(chǎn)物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然后用她的產(chǎn)物作模板（有點改進，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)換用了mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終于得到我的產(chǎn)物，測序結(jié)果完全正確。盡管我的這個經(jīng)歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的模式，書本的知識和別人的經(jīng)驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經(jīng)驗的限制請問：1 引物的特異退火溫度怎樣設(shè)定？可以根據(jù)gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？2 PCR時20微升體系中cDNA應(yīng)加多少比較合適？MgCl2應(yīng)加多少？各個成分的量有無確定標準？3 PCR結(jié)果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關(guān)嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調(diào)的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.如果內(nèi)參照有,目的沒有,至少證明不是美麗惹的禍.原因書里應(yīng)該都說了.在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6hr或更長時間。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌。5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6. 設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。二、常用的RNA酶抑制劑1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。2. 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分離與純化真核細胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA一、試劑準備13M醋酸鈉（pH 5.2）20.1M NaOH31上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65時，加入經(jīng)65溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。4洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5無水乙醇、70%乙醇6DEPC二、操作步驟1將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2用DEPC處理的1ml注射器或適當?shù)奈?，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。3使用1上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4將RNA溶解于DEPC H2O中，在65中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。5將所有流出液于65加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6用5-10倍柱床體積的1上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。7用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。8OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20放置30min。94離心，10000g15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4離心，10000g5min，棄上清，室溫晾干。10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。三、注意事項1整個實驗過程必須防止Rnase的污染。2步驟（4）中將RNA溶液置65中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。3十二烷基肌氨酸鈉鹽在18以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18最好用LiCl替代NaCl。4寡聚（dT）-纖維素柱可在4貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。5一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。RNA酶保護試驗(RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術(shù)。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：1 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺”問題，基于PCR產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。3 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。4 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。5 RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。6 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。一、試劑準備1 GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78l、100mM UTP 0.06l，加DEPC H2O至100l。2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20l、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3. RNase消化液：5M NaCl 120l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20l、0.5M EDTA（pH8.0）20l、RNase A(10mg/ml) 8l、RNase T1(250U/l) 1l，加DEPC H2O至2ml二、操作步驟1反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。（1）設(shè)計含T7啟動子的PCR引物由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5-端要含T7啟動子序列:T7啟動子序列為：5-TAATACGACTCACTATAGGG引物設(shè)計的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計相同。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設(shè)計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：上游引物下游引物 T7 啟動子序列下游引物（2）PCR先用上游引物和下游引物進行PCR，再以PCR 產(chǎn)物為模板,用上游引物和下游引物-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節(jié))。（3）探針合成標記與純化在0.5ml 離心管中加入下列試劑：RNasin （40U/l） 0.5lGACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61M） 2l-32PUTP(10Ci/l) 2.5lDTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1l5轉(zhuǎn)錄 buffer 2l模板（50ng/l） 1lT7 RNA 聚合酶 (15U) 1l混合后，短暫離心，37OC保溫1hr。加入DNase（10U/l）1l, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以滅活DNAse和T7 RNA 聚合酶。加入：飽和酚 50l氯仿 50l酵母tRNA（2g/l） 4lDEPC H2O 100l室溫下充分混勻，離心10000g2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100l氯仿，混勻，離心10000g2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10l、預(yù)冷無水乙醇250l，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100l洗滌，4OC離心13500g2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50l雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用?？捎媚蛩?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質(zhì)量。（參見本節(jié)電泳步驟）。2雜交（1） RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1g/l。（2）取8l RNA加入1-3l探針（根據(jù)探針檢測結(jié)果調(diào)整）于0.5ml 離心管中。（2） 80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。3. 消化(1) 雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。(2) 加入10%SDS 10l、10g/l蛋白酶K 20l，混勻，37 OC保溫10min。(3) 加入65l飽和酚和65l氯仿，混勻，室溫離心，10000g2min。(4) 轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10l酵母tRNA和3M NaAc 15l，再加入200l異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g10min。(5) 棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8l上樣緩沖液溶解沉淀。4、電泳與放射自顯影（1）配制凝膠：(50ml)40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml5TBE 10ml尿素 24g加H2O至50ml溶解后加入25%過硫酸胺50l，TEMED 50l，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。（2）預(yù)電泳以1TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預(yù)電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應(yīng)達2000v以上，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，準備加樣。（3）加樣將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預(yù)電泳）。（3） 電泳結(jié)束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。三、注意事項1本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。2RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。3、 同位素對RNA合成有一定影響，有時會產(chǎn)生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。4、 RNase消化液有時會產(chǎn)生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用?？赡軉栴}出在標本的保存：一般四小時之內(nèi)就應(yīng)處理，分離出細胞說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內(nèi),再設(shè)計一對引物進行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設(shè)計個更長的了第二次的引物設(shè)計要求可以低一點以50l體系為例引物各1l第一次PCR產(chǎn)物5l二次PCR和巢式PCR，即設(shè)計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產(chǎn)物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反應(yīng)，以期增加產(chǎn)物的量我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋后測OD260和OD280,后根據(jù)公式:RNA濃度=OD260*稀釋度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉(zhuǎn)錄及PCR,效果很好.luoyu10 wrote:各位大哥：我有一個問題請教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結(jié)果？最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。問：我是的新手，想請教引物如何設(shè)計？好的引物所具有的令人滿意的特點：* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。* 選擇GC含量為40到60或GC含量反映模板GC含量的引物。* 設(shè)計5端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。* 避免引物對3末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。* 避免3末端富含GC。設(shè)計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。* 避免3末端的錯誤配對。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設(shè)計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3端使用簡并堿基，因為3端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1M到3M），因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。【經(jīng)驗】如何確認RNA的質(zhì)量各位都知道，提取到質(zhì)量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關(guān)于RNA的提取技術(shù)，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關(guān)心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內(nèi)容當然都是一樣的了，所以實驗做的