siRNA對(duì)胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的作用.doc

siRNA對(duì)胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的作用【關(guān)鍵詞】RNA干擾；胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；基因表達(dá)摘要目的研究siRNA對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)的影響。方法利用體外合成帶有T7啟動(dòng)子的VEGF基因DNA片段，轉(zhuǎn)錄針對(duì)VEGFmRNA的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體2000將合成的siRNA轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞，設(shè)置轉(zhuǎn)染VEGF錯(cuò)義序列組、脂質(zhì)體組、空白對(duì)照組作為對(duì)照，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VEGFmRNA表達(dá)水平的變化，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF蛋白分泌量的變化。結(jié)果所設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶位點(diǎn)siRNA均能有效抑制胃腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期；VEGFmRNA的表達(dá)也受到有效抑制，明顯減少；同時(shí)，對(duì)應(yīng)的VEGF蛋白水平也顯著降低，作為陰性對(duì)照的錯(cuò)義序列組siRNA則沒(méi)有出現(xiàn)這種變化。結(jié)論體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)。關(guān)鍵詞RNA干擾；胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；基因表達(dá)ABSTRACTObjectiveToevaluatethegeneexpressionofVEGFbyRNAinterferenceinhumangastriccancer.MethodssiRNAstargetingVEGFmRNAwasobtainedbyinvitrotranscription，whichwastransfectedintohumangastriccancercelllinesSGC-7901withLipofectamine2000.Thenon-transfectedcells，cellstreatedwithLipofectimineandcellstreatedwithSCRweretakenascontrols.MTTwasusedtodetecttheinhibitiverateofcellgrowth.Flowcytometrywasusedtodetectthechangesofcyc-lingofthecell.TheinhibitiveeffectofsiRNAonmRNAlevelwasdetectedbyRT-PCR，thesecretionofVEGFproteininthesu-pernatantbyELISA.ResultsThesmallinterferingRNA（siRNA）targetinghumanVEGFeffectivelyinhibitedtheproliferationofgastriccancerSGC-7901.Itaffectedthedistributionofcellcycle，increasedcellpopulationinG0/G1phaseanddecreaseditinSphase.TheexpressionofVEGFmRNAwassignificantlyinhibitedinSGC-7901；otherwise，VEGFproteinnotablydecreased，buttheeffectsdidnotappearincontrolscramblesiRNA.ConclusionThelevelofVEGFgeneexpressionofSGC-7901cellscanbedeclinedbytransfectedwithsiRNA.KEYWORDSRNAinterference；gastricneoplasms；vascularendothelialgrowthfactor；geneexpression腫瘤血管的形成受多種因子的調(diào)節(jié)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是作用最強(qiáng)、特異性最高的一種能刺激細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤血管生成的因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。將外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞后引起與該段RNA同源的mRNA產(chǎn)生特異性降解，其相應(yīng)的基因受到抑制，這種發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的基因靜寂現(xiàn)象被稱為RNA干擾（RNAi）13。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，2123bp的siRNA（smallinterferenceRNA）可特異性地發(fā)揮RNAi作用4。胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道腫瘤，其病死率居各種惡性腫瘤之首57。探索治療胃腺癌的新方法具有重要臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以VEGF基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)合成siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，研究其靜寂VEGF基因表達(dá)的效應(yīng)，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1材料及其來(lái)源SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000、TRIzolReagent、RPMI1640購(gòu)自Invitrogen公司。T7Ri-boMAXTMExpressRNAiSystem試劑盒、AccessRT-PCRIntroductorySystem購(gòu)自Promega公司。四唑氮藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司。人VEGFELISAKit購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。1.2siRNA的制備從GenBank中獲取已知的人VEGFmRNA序列（ACCESSION:AB021221）。依據(jù)Promega公司提供的設(shè)計(jì)軟件和試劑盒設(shè)計(jì)合成siRNA序列，見(jiàn)表1。表1設(shè)計(jì)合成的siRNA序列（略）1.3細(xì)胞培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37、體積分?jǐn)?shù)為0.05CO2條件下培養(yǎng)。1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，配制6107/L濃度的細(xì)胞懸液，加到96孔板內(nèi)（Corning，美國(guó)），每孔加100L。設(shè)空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、錯(cuò)義序列組（錯(cuò)義序列組SCR序列與siRNA2序列有相同的GC組成，但是和人的mRNA沒(méi)有明顯的同源性，以此作為陰性對(duì)照8）、siRNA各劑量組，每組5孔，接種24h后棄去上清，采用脂質(zhì)體包裹的方式轉(zhuǎn)染siRNA。siRNA1和siRNA2兩組分別設(shè)立4個(gè)濃度，分別為100、200、400、1000nmol/L，分別定義為低、中、高、極高劑量組；siRNASCR組只設(shè)200nmol/L，加含各濃度的siRNAOpti-MEM培養(yǎng)基100L；脂質(zhì)體組只加脂質(zhì)體，空白對(duì)照組只加Opti-MEM培養(yǎng)基100L，置于37、含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2、無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6h，每孔補(bǔ)加新生牛血清10L，繼續(xù)培養(yǎng)。脂質(zhì)體組Lipo-fectamineTM2000用量為每孔0.5L，按Lipo-fectamineTM2000使用說(shuō)明書(shū)操作。于24h后分別加入MTT10L，振蕩15min，酶標(biāo)儀讀出吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞抑制率。1.5流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞的凋亡各組細(xì)胞以1.5105/L密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶，以1.4方法轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h，胰酶消化離心收集并懸于PBS中，4、體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙錠（PI）的染色液染色30min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀（EPICS-ELITE-ESP）進(jìn)行細(xì)胞周期分析，每個(gè)樣本約檢測(cè)11000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各期細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率。1.6RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)水平各組細(xì)胞以1.0105/L密度接種于6孔板，24h后棄去上清，加入siRNA1、siRNA2、siRNASCR200nmol/L，按1.4方法轉(zhuǎn)染24h后胰酶消化，離心收集。TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA，取1g總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。VEGF引物:上游引物:5-TCCGGGCCTCCGAAACC-3，下游引物:5-CCTGGTGAGATCTGG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為421bp；內(nèi)參照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）引物:上游:5-ACTGCCACCCAGAAGACT-3，下游:5-GCT-CAGTGTAGCCCAGGAT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為292bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在20g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳觀察并照相，然后應(yīng)用天能分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行掃描，檢測(cè)各組VEGFmRNA與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參GAPDHmRNART-PCR產(chǎn)物的吸光度（A）值，計(jì)算AVEGF/AGAPDH的比值。1.7VEGF蛋白分泌量分析收取轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞上清用于檢測(cè)VEGF蛋白分泌量。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作，將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品（7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0ng/L）以及不同組細(xì)胞上清液于Rayto2100C酶標(biāo)儀中檢測(cè)450nm吸光度（A）值。讀板后儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各待測(cè)樣本的VEGF含量。2結(jié)果2.1siRNA對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制siRNA1、siRNA2的低、中、高劑量組的吸光度值與空白對(duì)照組比較，差異均有極顯著意義（F=12.264，q=9.82710.260，P<；0.01）；極高劑量組的吸光度值與脂質(zhì)體組比較差異有顯著意義（q=7.231，P<；0.05）。錯(cuò)義序列組、脂質(zhì)體組與正常對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P>；0.05）。不同劑量各組之間比較，中劑量組吸光度值最低，抑制率最高（q=10.19810.260，P<；0.001）。見(jiàn)表2。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)細(xì)胞周期的影響與空白對(duì)照組比較，siRNA作用的細(xì)胞G0/G1期（細(xì)胞靜止期和DNA合成前期）比例升高，S期（DNA合成期）比例降低；錯(cuò)義序列組、脂質(zhì)體組與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)表3。2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后各組VEGFmRNA表達(dá)水平電泳結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、錯(cuò)義序列組421bp處均見(jiàn)清晰條帶，siRNA各組條帶均明顯減弱（見(jiàn)圖1），各組內(nèi)參照GAPDH條帶一致?？瞻讓?duì)照組、脂質(zhì)體組、siRNASCR組、siRNA1組、siRNA2組AVEGF/AGAPDH比值分別為0.8560.009、0.8340.020、0.8150.017、0.4560.030、0.4680.019，siRNA1、siRNA2與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、錯(cuò)義序列組比較，差異均有極顯著意義（F=244.945，q=27.42730.560，P<；0.01），其他各組比較差異無(wú)顯著性。2.4siRNA轉(zhuǎn)染后24h各組VEGF蛋白分泌量的變化siRNA1和siRNA2組的VEGF蛋白分泌量明顯低于其他3組，差異均有顯著性（F=33.131，q=9.03612.154，P<；0.01）。見(jiàn)表4。表2轉(zhuǎn)染siRNA各組SGC-7901細(xì)胞24h抑制率（略）表3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化（略）圖1轉(zhuǎn)染siRNA后SGC-7901細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)水平（略）DNAMarker；siRNA1；siRNA2；脂質(zhì)體組表4各組SGC-7901細(xì)胞上清VEGF蛋白分泌量的比較（略）3討論胃腺癌是人類常見(jiàn)的癌癥之一，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。手術(shù)治療可以使其中一部分病人得到治愈，但更多的病人面臨錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)以及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的局面。在分子生物學(xué)迅速發(fā)展的今天，尋找一條有效的胃腺癌基因水平的治療方法具有重要的臨床價(jià)值。微血管的生成與腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展與轉(zhuǎn)移密不可分，抑制血管生成已成為近年來(lái)抗腫瘤治療研究的重要課題和熱點(diǎn)問(wèn)題。腫瘤血管的形成受多種因子調(diào)節(jié)，其中最重要的一種是VEGF，它不僅促進(jìn)血管生成，還增加血管通透性，促進(jìn)轉(zhuǎn)移，改變宿主免疫功能。VEGF基因位于染色體的6p21.3，全長(zhǎng)28kb，編碼VEGF的基因長(zhǎng)約14kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子交替構(gòu)成。其mRNA的不同剪接可以產(chǎn)生5種異構(gòu)體，即VEGF121、145、165、189及2069。其中VEGF165是最為常見(jiàn)的形式，在包括胃腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中有表達(dá)10，11，在腫瘤微血管生成過(guò)程中扮演重要角色。通過(guò)抑制VEGF的表達(dá)抑制腫瘤微血管形成是當(dāng)前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。RNAi作為生命科學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù)，其應(yīng)用非常廣泛，從單細(xì)胞生物一直到人，作為基因表達(dá)干預(yù)的理想方法，可應(yīng)用于病毒和腫瘤的基因治療12，13。本研究以人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901為對(duì)象，利用分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)、體外轉(zhuǎn)錄針對(duì)VEGF基因的兩組siRNA，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞，遏制VEGF基因的表達(dá)，研究胃腺癌的防治方法。結(jié)果表明，siRNA對(duì)VEGF基因從mRNA轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)表達(dá)均具有明顯的抑制效果，抑制了胃腺癌細(xì)胞SGC-7901的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，改變細(xì)胞周期，降低VEGFmRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平。由此可見(jiàn)，在胃腺癌的抗血管生成基因治療中，VEGF可以成為有效的靶位點(diǎn)。本文實(shí)驗(yàn)所用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒所轉(zhuǎn)錄出來(lái)的siRNA純度高，可直接應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合RNA形成RNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，同時(shí)又吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在短期應(yīng)用的基因治療中具有明顯優(yōu)點(diǎn)。總之，本文為RNAi應(yīng)用于腫瘤的基因治療提供了一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，驗(yàn)證了應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可以有效抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制瘤細(xì)胞的增殖、防治腫瘤的基因治療思路，為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)然，針對(duì)VEGF的RNAi技術(shù)臨床應(yīng)用于胃腺癌治療尚需要進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)1FIREA.RNA-triggeredgenesilencingJ.TIG，1999，15（9）:358-363.2FIREA.Potentandgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegansJ.Nature，1998，391:806-811.3項(xiàng)鋒鋼，馬桂馨.肺癌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體Flt1及KDR的表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系J.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，40（1）:8-10.4楊光，曹國(guó)軍，李潔，等.SiRNA抑制SARS冠狀病毒感染Ve-roE6細(xì)胞J.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2004，1:270-273.5吳漢平，吳開(kāi)春，李玲，等.人環(huán)氧合酶-2（hCOX-2）編碼基因的克隆及其反義核酸轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)