（有機化學(xué)專業(yè)論文）afm檢測生物分子間作用力及星狀光電分子的合成與表征.pdf

覆算父擎 摘要 摘要 本論文的研究內(nèi)容主要涉及兩方面的內(nèi)容：其一為原子力顯微鏡測量生物分 子間作用力的研究，這是本人作為交流學(xué)生在日本東京農(nóng)工大學(xué)生物技術(shù)與生命 科學(xué)系完成；其二是設(shè)計、合成了可用于表面自組裝研究的一系列端基帶有氫鍵 基團的星狀兀共軛分子。 生物大分子間存在高特異性相互作用力，它們在調(diào)控分子識別過程中起到了 相當(dāng)重要的作用。了解、檢測和分類生物體系問的相互作用力已經(jīng)成為現(xiàn)階段生 物學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點。而原子力顯微鏡作為表征形貌和測量分子間作用 力的手段，能有效地和定量化地計算生物體系中兩類分子之間的特異性作用力。 在本課題中，我們選用的鋅指是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠和特異性的d n a 結(jié)合 起到基因轉(zhuǎn)錄的作用。我們將z i 億6 8 和目標(biāo)d n a 分別化學(xué)修飾在a f m 針尖和 玻璃基板上，利用a f m 測定一系列z 娩6 8 一d n a 體系的力曲線，并計算歸納獲 得z i f 2 6 9 - - d n a 復(fù)合物的解離力大小。同時由于z i 岔6 8 和非特異性作用的d n a 之問存在一定的作用力，所以課題設(shè)計了有效的對比試驗用以證實z 舵6 8 和目 標(biāo)d n a 分子之間的特異性作用力，得出了z i f 2 6 8 和目標(biāo)d n a 之間特異性作用 力的數(shù)值，并將其和已有文獻的相關(guān)報道進行對比用以證明其可信性。另外，也 計算出非特異性作用力的大小，并且對其產(chǎn)生的原因進行了分析和闡述。 把結(jié)構(gòu)明確的兀共軛寡聚物進行超分子組裝將會對分子電子器件的發(fā)展產(chǎn) 生決定性的影響；因為寡聚物分子確定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)有助于實現(xiàn)特定的 功能以及便于實現(xiàn)超分子結(jié)構(gòu)的調(diào)控。同時，這些分子器件的性能與分子在固體 表面的排布形態(tài)有著密切的相互關(guān)聯(lián)性。因此，更好的理解并調(diào)控兀共軛寡聚物 在自組裝單層膜中的取向與聚集形態(tài)對于發(fā)展未來的納米器件是至關(guān)重要的。在 本課題中，我們設(shè)計、合成了一系列的星狀冗共軛分子，包括分別含有一、二、 三個羧酸端基的星狀芴和以及結(jié)構(gòu)更為剛性的三個端基均為2 ，4 一二胺基三嗪 環(huán)的三聚茚分子，以此形成一個系列的分子結(jié)構(gòu)，便于進行系統(tǒng)性研究。同時我 們對這些星狀分子的溶液和薄膜分別進行了紫外和熒光光譜的表征。最終這些功 能性分子將有望由氫鍵誘導(dǎo)在石墨或者金屬表面形成有序的自組裝結(jié)構(gòu)。我們期 望通過不同類型氫鍵的引入，實現(xiàn)共軛光電分子在納米尺度的可控構(gòu)筑，并為未 來的分子光電器件的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：原予力顯微鏡，生物分子作用力，力曲線，星狀共軛分子，表面自組裝 槎星父擎 a b s t r a c t 1 1 把r e s e a r c ho ft h i st h e s i sa r ef o c u s e do nt w oa s p e c t s ：o n ei st h er e s e a r c ho n b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o nf o r c e sa n a l y z e db ya t o mf o r c em i c r o s c o p e ( a f m ) ，w h i c h w a sp r o c e s s e di nd e p a r t m e n to fb i o t e c h n o l o g ya n db i o s c i e n c e ，t o k y ou n i v e r s i t yo f a 掣i c u l t u r ea n dt e c h n o l o g y 1 1 艙s e c o n dw o r ki sd e s i g na n ds y n t h e s e so fas e r i e so f s t a r - s h a p ec o n j u g a t e dm o l e c u l e se n d - c a p p e dw i t hh y d r o g e nb o n d i n gg r o u p s h i g h l ys p e c i f i ci n t e r a c t i o n s e x i s ti nb i o m o l e c u l a rs y s t e m t h e y p l a ynv e r y i m p o r t a n t r o l e i nm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n 1 1 ”k n o w l e d g e c h a r a c t e r i z a t i o na n d c l a s s i f i c a t i o no fb i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sb e c o m et h er e s e a r c hh o t s p o tf o rb i o l o g y a n ds o m er e l a t e ds c i e n c e a f mc a nb ee m p l o y e dt oe f f i c i e n t l ya n d q u a n f i f i c a t i o n a l l y c h a n k ：t i 哦靄t h es p e c i f i cf o r c ei n t e r a c t i o n sb e t w c e mb i o m o l e c u l e s z i n c f i n g e r p m t e i n sa a ni m p o r t a n te f f e c ti nt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o nd u et ot h e i ri n t e r a c t i o n s w i t hd n a t h e r e f o r e ，i nt h i sp r o j e c tw es e l e c t e dz i f 2 6 8 - d n ac o m p l e xa so n r r e s e a r c ht a r g e t z i f 2 6 8w e r eb o u n do l lt h es u r f a c eo fa na f m t i pa n dt h et i pw a s a p p r o a c h e dt o c o n t a c tt a r g e tm o l e c u l e sw h i c hw o r ei m m o b i l i z e do nt h es u b s t r a t e t h e n , t h ef o r c er e q u i r e dt ou n b i n dt h eb i n d e r - t a r g e tc o m p l e xw a se s t i m a t e df r o m f o r c e - d i s t a n c ec n r v e so b s e r v e dd u r i n gt h ew i t h d r a w a lo ft h et i pf r o mt h es u b s t r a t e d u et ot h eo c c u r r e n c eo fn o n - s p e c i f i ci n t e r a c t i o n s 咖嘲z i f 2 6 8a n dd n a p a r a l l e l e x p e r i m e n t sw c r ed e s i g n e da n dp e r f o r m e dt od i s c r i m i n a t es p e c i f i ci n t e r a c t i o n sa m o n g t h ec o m p l e xp r o t e i n - d n ai n t e r a c t i o n s w ea l s oq u a n t i f i e dt h es p e c i f i ci l h c r a c t i o n b e t w c e nz i 億6 8a n dt a r g e td n aa n ds u m m a r i z e dt h ec m i s 錨f o rn o n - s p e c i f i c i n 刪o u s , b a s e do ns t a t i s t i c a la n a l y s i so f t h ef o r c ec u r v 器 硼磚s u p r a m o l e c u l a ro r g a n i z a t i o no f 兀c o n j u g a t e do l i g o m e r sw i t hw e l l - d e f i n e d s t r u c t u r e sw i l lh a v ec r u c i a li n f l u e n c e so l lm o l e c u l a re l e c t r o n i cd e v i c e s o l i g o m e r s h a v ed e f i n e dc h e m i c a ls t r u c t u r e sa n dp h y s i c a lp r o p e r t i e s , w h i c hc o n t r i b u t et or e a l i z e s o m cs p e c i f i cf u n c t i o n a l i t i e sa n dt u n es u p r a m o l e c u l a rs l r l l l ：t u r e s m e a n w h i l e ，t h e m o l e c u l a rp a t t e ms t r n c r i r e so nt h es u r f a c eh a v eg r e a te f f e c t so nt h ep r o p e r t i e so f t h e s em o l e c u l a rd e v i c e s t h u s ，i ti sg r e a te s s e n t i a lt ou n d e r s t a n da n dc o n t r o lt h e o r i e n t a t i o no f t h e s ec o n j u g a t e do l i g o m e r si nt h e i rs e l f - a s s e m b l ym o n o l a y e r s ，f o rb e t t e r d e v e l o p m e n to fn a n o - d e v i c e s i nt h i sp r o j e c t , as e r i e so fs t a r - s h a p e do p t o - e l e c t r o n i c m o l e c u l e se n d - c a p p e dw i t hh y d r o g e nb o n d i n gg r o u p sw e r es y n t h e s i z e dw h i c hw o u l d b eg o o dc a n d i d a t e sf o rh y d r o g e nb o n d i n gi n d u c e ds e l f - a s s e m b l ym a t e r i a l so ng r a p h i t e o rm e t a ls u r f a c e o n e ，t w oa n dt h r e ec a r b o x y lt e r m i n a lg r o u p sw e r ei n t r o d u c e di n t o 覆算戈葶a b s t r a c t s t a r - s h a p e do l i g o f l u o r e n e s r e s p e c t i v e l y ；a n dm o r ep l a n a rc o r es t r u c t u r et r u x e n ew i 出 1 ，3 ，5 - t r i a z i n e - 2 ，4 一d i a m i n e ( 1 ) e n d - g r o u p sw i g _ l - ea l s od e s i g n e da n ds y n t h e s i z e df o r s y s t e m a t i cr e s e a r c ha n dc o m p a r i s o n t h eo p t i c a lp r o p e r t i e so ft h e s em o l e c u l e sw e r e c h a r a c t e r i z e db yu v - v i sa n df l u o r e s c e n c es p e c t r a , w h i c hi m p l i e dt h a tt h es t a r - s h a l 喊! c o r ea n dt h el o n ga l k a n es i d ec h a i n sc o u l ds u b s t a n t i a l l ys u p p r e s si n t e r m o l e c u l a r 兀吼 a g g r e g a t i o n k e y w o r d s ：a f m ，b i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n , f o r c ec u r - v e ，s t a r - s h a p e dc o n j u g a t e d m o l e c u l e ，s u r f a c es e l f - a s s e m b l y 論文獨創(chuàng)性聲明 木論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。論文巾除 了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的 研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻均已在論文中作廣l 月確的聲叫 并表示了謝意。 作者簽名：王送堇盛日期：望：z 墨：夠 論文使用授權(quán)聲明 本人完全了解復(fù)旦大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留 送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi) 容，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此 規(guī)定。 作者簽名：盤重筻遂導(dǎo)師簽名日期：趟7 l 乞1 嶧 在算太擎 第一章緒論 第部分生物體系作用力的原子力顯微鏡研究 1 1 原子力顯微鏡 第一章緒論 1 9 8 6 年，i b m 公司的qb i n n i n g 和斯坦福大學(xué)的c eq u a t e 及c g e r b e r 合 作發(fā)明了原子力顯微鏡( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ，a f m ) i i l 。它是在掃描隧道顯 微鏡( s c a n n i n gt u n n e l i n gm i c r o s c o p y ，s t m ) 基礎(chǔ)上為觀察非導(dǎo)電物質(zhì)經(jīng)改進而 發(fā)展起來的可在分子和原子級進行觀察的顯微工具。原子力顯微鏡自問世以來， 已經(jīng)有多項應(yīng)用擴展。一開始，通過a f m 探針與被測樣品之間存在的微弱的相 互作用力( 原子間相互作用力) 可以使用a f m 來獲得物質(zhì)表面的形貌。之后， 人們利用原子力顯微鏡技術(shù)研究生物體系中單個生物分子的特性或生物分子之 間的相互作用。最近，通過修飾和操控a f m 的探針成功實現(xiàn)了單分子操縱技術(shù)。 原予力顯微鏡的橫空出世和潛在應(yīng)用使得人們在微電子技術(shù)、生物技術(shù)、基因工 程、生命科學(xué)、材料科學(xué)、表面技術(shù)、信息技術(shù)1 2 l 和納米技術(shù)等各種尖端科學(xué)領(lǐng) 域的探索和發(fā)展更進一步。 1 1 1 先進顯微技術(shù)的歷史發(fā)展 掃描探針顯微鏡( s p m ) 是繼光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡之后的第三代顯微鏡， 這是一種以物理學(xué)為基礎(chǔ)，集多種現(xiàn)代科技為一體的新型表面分析儀器。1 9 8 1 年，gb i n n i g 和h r o h r e r 3 j 發(fā)明了掃描隧道顯微鏡( s t m ) ，并因此被授予1 9 8 6 年的諾貝爾物理學(xué)獎。s t m 是基于量子力學(xué)的隧道效應(yīng)，通過一個由壓電陶瓷驅(qū) 動的探針在物體表面作精確的二維掃描，其掃描精度達(dá)到納米級別。該探針尖端 可以制成只有一個原子大小的粗細(xì)，并且位于距樣品表面足夠近的距離內(nèi)，以使 探針尖端與樣品表面之處的電子云有些微重疊。這時若在探針與樣品表面之間加 一上定的偏壓，就會有一種被稱作為隧道電流的電子流流過探針。這種隧道電流 對探針與物體表面的間距十分靈敏，從而在探針掃描時通過感知這種隧道電流的 變化就可以記錄下物體表面的起伏情況。這些信息再經(jīng)計算機重建后就可以計算 機屏幕上獲得反映物體表面形貌的直觀圖象。但由于s t m 要求使用導(dǎo)電基底，通 常是高定向裂解石墨( h o p g ) 、金屬等，而月這些基底用來觀測生物樣品時，非 常易于產(chǎn)生同螺旋d n a 和其他生物大分子相像的假象。另外，由于不清楚隧道 電子是如何同非導(dǎo)電吸附材料相作用的，很難判斷生物大分子s ，r m 圖像的真實 性。這些限制了s t m 在生物大分子研究中的廣泛應(yīng)用。而隨著生物技術(shù)的進步， 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 特別是基因工程和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，在分子尺度觀察、測量生物分子結(jié)構(gòu)和相 互作用變得越來越重要和迫切。 在s t m 的基礎(chǔ)上，gb i n n i n g 、c eq u a t e 及c g e r b e r 合作發(fā)明了原子力顯微 鏡( 越m ) ，將觀察對象由導(dǎo)體、半導(dǎo)體擴展到絕緣體。i v a na m a t o 將a f m 比作 為“納米世界的選拍照相機”1 4 1 ，彌補了s t m 在生物研究領(lǐng)域的不足，同時它又 成為觀察物質(zhì)表面、對原子和分子進行操縱的一個有效工具1 5 1 。a f m 可直接對脫 氧核糖核酸( d n a ) 、核糖核酸( r n a ) 和它們的蛋白或其他配合體、復(fù)合物結(jié) 構(gòu)進行研究。同時，樣品制備上避免了電子顯微鏡成像過程中所需要的噴鍍、染 色和標(biāo)記等用來增加圖像反差的復(fù)雜處理步驟。a f m 也能夠像在空氣中一樣在 液體中操作，因此能在接近生理條件的緩沖溶液中成像生物分子。a f m 的水平 分辨率一般是5 1 0 n l n ( 和針尖的曲率半徑有關(guān)) ，因此a f m 是第一個，目前也 是唯一能在近似生理條件下對生物樣品成像達(dá)到納米分辨率的檢測技術(shù)。 近年來，在s t m 和a f m 的理論基礎(chǔ)上，各種掃描力顯微術(shù)發(fā)展很快，相 繼發(fā)明了力調(diào)制顯微鏡( f o r c em o d u l a t i o nm i c r o s c o p y ，f m m ) 、相位檢測顯微鏡 ( p h a s ed e t e c t i o nm i c r o s c o p y ，p d m ) 、靜電力顯微鏡( e l e c t r i cf o r c em i c r o s c o p y ， e f m ) 、電容掃描顯微鏡( s c a n n i n gc a p a c i t a n c em i c r o s c o p y ，s c m ) 、熱掃描顯微 鏡( s c a n n i n gt h e r m a lm i c r o s c o p y ，s t h m ) 和近場光學(xué)掃描顯微鏡( s c a n n i n g n e a r - f i e l do p t i c a lm i c r o s c o p y ，n s o m ) 等各種系列顯微鏡。由于以上顯微鏡均 是基于探針在被測試樣表面上進行二維掃描引起相關(guān)檢測量變化的原理而研制 的設(shè)備，因此國際上稱以上各系列顯微鏡為掃描探針顯微鏡( s c a n n i n gp r o b e m i c r o s c o p y , s p m ) 。 1 1 2 原子力顯微鏡的工作原理 a f m 主要由為反饋光路提供光源的激光系統(tǒng)( l a s e r ) 、實現(xiàn)力一距離反饋的 微懸臂系統(tǒng)( c a n t i l e v e r ) 、執(zhí)行光柵掃描和z 軸定位的壓電掃描器( x ，y z p i e z o - s c a n n e r ) 、接收光反饋信號的光電探測器( d e w e t o r ) 、反饋電子線路( c u r r e n t c i r c l e ) 、粗略定位系統(tǒng)、防震防噪聲系統(tǒng)、計算機控制系統(tǒng)與數(shù)據(jù)處理軟件、樣 品探測環(huán)境控制系統(tǒng)( 濕控、溫控、氣環(huán)境控制等) 、監(jiān)控激光一懸臂一樣品相 對位置的顯微及c c d 攝像系統(tǒng)等構(gòu)成。其中，前四大系統(tǒng)是該儀器的核心部件。 圖1 1 為原子力顯微鏡主要部件和工作原理圖。 a f m 是使用一個一端固定而另一端裝有針尖的彈性微懸臂來檢測樣品表面 形貌的。當(dāng)樣品在針尖下面掃描時，同距離有關(guān)的針尖一樣品相互作用( 即可能 是吸引的，也可能是排斥的) 和其他相互作用力，就會引起微懸臂的形變。也就 是說，微懸臂的形變是對樣品一針尖相互作用的直接測量【6 】?？刂漆樇饣驑悠返?2 覆算天擎 第一章緒論 匝刨隧世h暑愛ii匭 霉-o譬。盆j-!ii曼臼弓置矗墨昌。盤。盤_篁ou_舞io疊00 e遼斗g基b葚8_fp：哨莛怠弋 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 z 軸位置，利用激光束的反射來檢測微懸臂的形變。即使小于0 0 1i l l l l 的微懸臂 形變，只要用激光束將它反射到光電檢測器后，變成了3 1 0 n m 的激光點位移， 由此在光電倍增管上產(chǎn)生一定的電壓變化。通過測量檢測器電壓對應(yīng)樣品掃描位 置的變化，就可得到樣品的表面形貌圖像。商業(yè)用的微懸臂具有的彈簧常數(shù)( k ) 一般為o 0 0 4 - - 1 1 8 5n m ，針尖曲率半徑大約為3 0n m 。 1 1 3 原予力顯微鏡的操作模式 a f m 有三種不同的常用操作模式：接觸模式( c o n t a c tm o d e ) ，輕敲模式 ( t a p p i n gm o d e ) 和非接觸模式( n o n - c o n t a c tm o d e ) 。其中，最常用的是接觸式 和輕敲模式。圖1 2 給出了a f m 不同操作模式在針尖和樣品相互作用力曲線中的 工作區(qū)間。 一|，排斥力區(qū) 吸引力區(qū) 接觸 一l l t 一- l 一 - 非接觸 l 針尖一樣品間距 圖1 2 針尖一樣品相互作用力隨距離的變化曲線 1 1 3 1 接觸模式 在接觸模式中，針尖始終同樣品接觸。樣品掃描時，針尖在樣品表面上滑動。 接觸模式通常產(chǎn)生穩(wěn)定的高分辨圖像。當(dāng)激光束照射到微懸臂的背面，再反射到 位置靈敏的光電檢測器時，檢測器不同象限會接收到同懸臂形變量成一定比例關(guān) 系的激光強度差值。反饋回路根據(jù)檢測器的信號與預(yù)置值的差值，不斷調(diào)整針尖 一樣品距離，并且保持針尖一樣品作用力不變，就可以得到表面形貌像。這種測 量模式稱為恒力模式i “。當(dāng)已知樣品表面非常平滑時，可以讓針尖一樣品距離保 持恒定，這時針尖一樣品作用力大小直接反映了表面的高低，這種方法稱恒高模 式1 1 1 。但接觸模式下研究低彈性模量的樣品( 例如生物樣品) 時也存在些缺陷。 這是由于這類分子和基底間的吸附接觸很弱，探針在樣品表面上的移動會產(chǎn)生壓 縮力和剪切力，容易使得樣品發(fā)生變形，并會損壞探針，從而影響到圖像的質(zhì)量 4 梗旦戈擎 第一章緒論 和真實性。 1 1 3 2 輕敲模式 在輕敲模式中，微懸臂是振蕩的并具有較大的振幅( 2 0r i m ) ，針尖在振蕩 的底部間斷地同樣品接觸，是介于接觸模式和非接觸模式之間的一種操作模式 研。當(dāng)針尖沒有接觸到表面時，微懸臂以一定的大振幅振動，當(dāng)針尖接近表面直 至輕輕接觸表面時，其振幅將減??；而當(dāng)針尖反向遠(yuǎn)離表面時，振幅又恢復(fù)到原 先的大小。反饋系統(tǒng)根據(jù)檢測該振幅，不斷調(diào)整針尖一樣品之間的距離來控制微 懸臂的振幅，使得作用在樣品上的力保持恒定。由于針尖同樣品接觸，分辨率通 常幾乎同接觸模式一樣好：但因為接觸是非常短暫的，剪切力引起的破壞幾乎完 全消失，所以輕敲模式適合于分析研究柔軟、粘性和脆性的樣品p l 。在輕敲模式 中，針尖在振蕩周期是間斷地與樣品接觸；因為這種接觸是短暫的，就大大降低 了對樣品的損傷，所以很適合用于生物分子的成像。 1 1 3 3 非接觸模式 在非接觸模式中，針尖在樣品表面的上方幾到幾十納米處振動，始終不與樣 品表面接觸。以略大于微懸臂自由共振頻率的頻率驅(qū)動微懸臂，當(dāng)針尖接近樣品 表面時，微懸臂的振幅顯著減小。振幅的變化量對應(yīng)于作用在微懸臂上的力梯度， 因此對應(yīng)于針尖一樣品間距。由于針尖探測器檢測的是范德華吸引力和靜電力等 對成像樣品沒有破壞的長程作用力，一般比接觸式的作用力小幾個數(shù)量級，因此 適合研究柔軟的或有彈性的表面。同時非接觸模式有另外一個優(yōu)點就是針尖始終 不與樣品表面接觸，因而針尖不會對樣品造成污染。盡管這種模式雖然增加了顯 微鏡的靈敏度，但相對較長的針尖一樣品間距使得分辨率要比接觸模式的低。實 際上，由于針尖很容易被表面的粘附力所捕獲，非接觸模式的操作是很難的。到 目前為止，非接觸模式的應(yīng)用通常不適合在液體中成像，而且在生物中的應(yīng)用也 是很少的1 9 】。 ， 1 1 4 原予力顯微鏡的應(yīng)用 原子力顯微鏡具有很高的空間分辨率，不僅能直接觀察到物質(zhì)表面的原子結(jié) 構(gòu)，而且還能對原子和分子進行操縱。事實證明a f m 已經(jīng)成功的應(yīng)用于物理、 化學(xué)、金屬、半導(dǎo)體、微電子、納米材料、生物、生命科學(xué)、生物醫(yī)藥等眾多領(lǐng) 域中，特別在推動材料科學(xué)和生命科學(xué)的深入發(fā)展上起到了非常重要的作用。 5 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 4 1 在材料科學(xué)中的應(yīng)用 在材料科學(xué)中，無論無機材料還是有機材料，人們對于材料是晶態(tài)還是非晶 態(tài)、分子或原子的存在狀態(tài)、中間化合物及各種相的變化進行探索，以便找出結(jié) 構(gòu)與性能之間的規(guī)律【1 0 u 】。在這些研究中a f m 可以使研究者，從分子或原子水 平直接觀察晶體或非晶體的形貌、缺陷，測量空位能、聚集能及各種力的相互作 用，從而了解和掌握材料微觀結(jié)構(gòu)與宏觀性能之間的關(guān)系，并將在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā) 揮巨大作用。 當(dāng)今納米材料是材料領(lǐng)域最受關(guān)注的課題，而a f m 在對納米材料的微觀研 究中也是最重要的分析測試工具之一。n e f f a t i 等人用高分辨a f m 觀察不同濃度 下的硅氧烷橡膠黑煙末( c b ) 納米復(fù)合材料樣品的表面形貌和性質(zhì)，證實樣品 的粗糙度和表面c b 的晶粒數(shù)目有關(guān)，并得出結(jié)論：c b 的主體濃度和表面的實 際濃度均受到硅氧烷橡膠基體制備速率的影響，并決定其材料的傳導(dǎo)率。由此可 見，在納米級的復(fù)合材料研究中，a f m 是一種強有力的工具1 1 2 】。 工業(yè)上可以利用原子力顯微鏡對鋼材成分進行有效分析，相對于光學(xué)顯微鏡 和掃描電子顯微鏡，a f m 不僅可以在一次掃描下，根據(jù)不同物理參數(shù)同時得到 氧化鐵皮圖片，更可以根據(jù)磁力圖判斷氧化鐵皮的成分。用原子力顯微鏡的磁力 針尖以敲擊模式作精細(xì)掃描，可同時得到低碳鋼熱軋板樣品的形貌圖、相圖和磁 力圖。證實低碳鋼熱軋板表面氧化鐵皮結(jié)構(gòu)主要是四氧化三鐵和游離鐵的混合物 1 3 l 。 1 1 4 2 在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 在生命科學(xué)中，因a f m 有著很高的三維圖形分辯能力，因此用a f m 對生 物大分子成像的意義，不僅是在分子水平上認(rèn)識大分子的形態(tài)，而且可以通過對 生物分子結(jié)構(gòu)的研究及生物分子在相互作用前后構(gòu)型的變化，對揭示生命過程起 到至關(guān)重要的作用。例如，在生命科學(xué)中，a f m 對染色體、蛋白質(zhì)、多糖、微 生物、細(xì)胞等的研究都發(fā)揮了非常重要的作用。 在對鳥嘌呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 分帶中期染色體的三維結(jié)構(gòu)的觀察i l ”、染色 單體型畸變識別【l5 】以及核型分析等方面研究的應(yīng)用證實，與光學(xué)顯微鏡、掃描及 透射電鏡等成像工具相比，a f m 具備獨特的優(yōu)勢。它不僅能夠識別染色體畸變， 同時可以對結(jié)構(gòu)變化進行細(xì)微的觀察。除正常染色體的結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)的研究， 利用a f m 還可對g 分帶染色體形態(tài)發(fā)生的一系列變化進行觀察。研究發(fā)現(xiàn)，隨 著胰蛋白酶作用時間的延長，染色體除周邊之外的其余結(jié)構(gòu)將逐漸發(fā)生崩解i ”j 。 中期染色體經(jīng)g 、c 分帶會出現(xiàn)縱向高度的差異l l ”，各條帶中染色質(zhì)纖維排列的 6 覆旦，t 擎 第一章緒論 松緊度也有所不剛1 8 】。這些都有助于染色體分帶機制的闡明。對重離子射線誘發(fā) 染色體畸變的分析發(fā)現(xiàn)，通過a f m 不但能識別出染色單體裂隙和單體斷裂，還 清楚地觀察到單體型畸變斷裂點的纖維狀結(jié)構(gòu)【l9 1 。這證實了a f m 是輻射誘發(fā)染 色體畸變的結(jié)構(gòu)研究中十分有用的工具。 利用a f m 觀察，生物膜可以在其固有的狀態(tài)下獲得水平方向分辨率達(dá)o 5 1 l i r a 、垂直方向分辨率達(dá)0 1 - - 0 2a m 的高分辨圖像，甚至可以觀察到分子內(nèi)的結(jié) 構(gòu)細(xì)節(jié)1 2 0 i 。d n a 的復(fù)制、蛋白質(zhì)的合成、遺傳信息的傳遞等都是由分子間力控 制的，而a f m 對微小相互作用力的靈敏度使其成為測量這些相互作用的有效工 具。單分子力譜和高分辨成像的結(jié)合使得分析生物分子內(nèi)和分子間的相互作用力 成為可能。譬如，p a n g 在a f m 下直接觀察抗腫瘤藥順鉑及其異構(gòu)體反鉑與d n a 的相互作用，發(fā)現(xiàn)順鉑抑制d n a 復(fù)制的作用較反鉑強，順鉑的抗腫瘤活性與 d n a 分子中鳥嘌呤( g ) 和胞嘧啶( c ) 含量有關(guān)j 隨著儀器和生物樣品制備方法的改進以及成像條件的優(yōu)化使得a f m 不僅可 以對生物分子進行高分辨成像，而且可以對生物分子進行操縱對被觀察標(biāo)本 直接進行切割、鉆孔、打磨等操作。因此可利用舡m 進行生物制藥和基因治療。 同時，a f m 操作簡便，樣品處理要求不高，可檢測的樣品范圍很廣，配套設(shè)備 很少，安裝條件也比較簡單等優(yōu)點足以證明a f m 將成為現(xiàn)代、未來生物醫(yī)學(xué)研 究的主要手段。 1 1 4 3 在聚合物研究中的應(yīng)用 a f m 在聚合物研究中的應(yīng)用非常廣泛，除對聚合物表面幾何形貌進行觀測 外，目前更常用于對聚合物納米級結(jié)構(gòu)和表面性能的研究。例如a f m 對嵌段共 聚物膜表面形貌與相分離進行觀察，有研究小組 2 2 1 就報道了聚苯乙烯一聚乙烯， 聚丁烯一聚苯乙烯三嵌段共聚物( s e b s ) 在相同澆鑄條件下不同溶劑澆鑄成膜 的微相分離形態(tài)。 而通過對聚合物在原子級別上的觀察、分析、歸納、總結(jié)，可以獲得更深層 次的信息。例如觀察聚氧化乙烯( p e o ) 的晶體結(jié)構(gòu)田l 。由a f m 圖像可確定p e o 片晶表面幾何形狀接近正方形，厚度約為1 2 5n m ，在空氣中隨時間的延長晶片 逐漸形成不規(guī)則的樹枝狀結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)問的縫隙深度較p e o 晶體厚度大，說 明在這個過程中高分子鏈進行重新折疊。 運用a f m 技術(shù)可以順利解析聚合物的各種性質(zhì)，例如導(dǎo)電性能、單鏈聚合 物的力學(xué)性能1 2 4 j 等。研究聚合物結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系，操縱和修飾聚合物鏈， 設(shè)計和創(chuàng)造新的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)，從根本上評價和控制聚合物可能的性能和過程，將 成為a f m 的發(fā)展趨勢以及聚合物科學(xué)的重要研究領(lǐng)域。 7 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 1 4 4 在信息技術(shù)中的應(yīng)用 半導(dǎo)體芯片技術(shù)是當(dāng)今高科技的核心。盡管元件尺寸越來越小，但是芯片的 功能卻越來越強。當(dāng)尺寸縮小到納米級，傳統(tǒng)的觀測手段( 如電子顯微鏡) 已不 能滿足需要，必須采用掃描探針顯微鏡。光盤具有存儲量大、成本低、精度高和 信息保存壽命長等特點，現(xiàn)已成為主要的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)之一。它的信息是以凹坑 的形式存儲于盤基上，凹坑的深度和長度是信息位的關(guān)鍵參數(shù)，它們直接影響光 盤讀出信號的質(zhì)量。a f m 可直接對物體表面進行三維檢測，能夠在納米尺度上 對光盤上的信息位凹坑結(jié)構(gòu)進行三維檢測。同時由于a f m 具有高分辨率、形象 直觀的觀測、提供量化的三維信息以及對樣品無特殊要求的特點，使其成為分析 信息存儲介質(zhì)的重要工具，因而也將在未來的數(shù)據(jù)分析和處理中發(fā)揮重要作用。 另外，a f m 還集納米加工與測量于一體，具有較好的實時監(jiān)控和微加工能力， 這對于未來開發(fā)和研制更快的存儲介質(zhì)及海量存儲系統(tǒng)等也有重要的意義i 弭j 。 1 1 5 原子力顯微鏡的展望 原子力顯微鏡以其獨特的成像方式、高分辨率、制樣簡單、操作易行等特點 而備受關(guān)注，并且突出地顯現(xiàn)了顯微觀測技術(shù)作為人類視覺感官功能的延伸與增 強的重要性。a f m 已在生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重大作用，極大地推 動了納米科技的發(fā)展，促進人類加速進入了納米時代；同時，a f m 將帶領(lǐng)人類 進入后基因組，即蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新天地。 2 0 年來，材料科學(xué)、電子技術(shù)、計算機科學(xué)的進步極大地促進了a f m 技術(shù) 的進步。目前a f m 在以下方向有待發(fā)展：( 1 ) 探針針尖的工藝研究。探針針尖 的工藝對a f m 分辨率至關(guān)重要，如何提高針尖尖度、延長探針使用壽命將成為 a f m 長期研究的問題。目前科學(xué)家們正致力于研究碳納米管針尖的制造和應(yīng)用 2 5 , 2 6 。( 2 ) 接觸面處的接觸距離，是a f m 中最關(guān)鍵的因素。合理的接觸距離， 既有利于延長針尖的使用壽命，又有利于提高a f m 的分辨率。在原子操縱中， 接觸距離將起著決定性作用。電場的強弱和原子間力的大小接觸同距離有密切的 關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接觸距離達(dá)到某個值時，接觸面處的原子會發(fā)生“突跳”， “突跳”對原子操縱影響很大。( 3 ) 計算機技術(shù)的進步和數(shù)據(jù)處理軟件的開發(fā)也 是不可忽視的關(guān)鍵因素。 8 摸曼太擎 第一章緒論 1 2 生物體系間作用力的a f m 研究 1 2 1 研究生物體系之間的相互作用力的意義 生物大分子問存在高特異性相互作用力，例如抗體一抗原、配體一受體、互 補d n a d n a 間相互作用力，它們在調(diào)控分子識別過程中起到了相當(dāng)重要的作 用。例如基因的表達(dá)、酶的功能性催化、細(xì)胞的保護這些過程都依賴于生物分子 問的相互作用力。又如，在免疫系統(tǒng)中，抗體能夠高效快速的識別于它們相應(yīng)的 抗原，并與它們結(jié)合，這在生物工藝學(xué)、藥理掣”】和催化學(xué) 2 s l 中都起到了重要 作用。所以，了解、檢測和分類生物體系間的相互作用力已經(jīng)成為現(xiàn)階段生物學(xué) 以及相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點，不僅對細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等基礎(chǔ)研究提 供了廣泛的研究素材，也對于生物傳感器的發(fā)展有不可低估的影響。 隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，對生物分子間的相互作用力的直接檢測( 定性和定量) 已經(jīng)成為現(xiàn)實。目前生物膜力探針( b i o m e m b r a n ef o r c ep r o b e ) 例、表面力測量 儀( s u r f a c ef o r c e sa p p a r a t u s ) p o 、光鑷子( o p t i c a lt w e c z e t s ) 郾j 是應(yīng)用比較普遍 的敏感力轉(zhuǎn)換裝置。盡管這些技術(shù)對于生物分子間的作用力較為敏感，但是它們 缺乏測量離散的分子間相互作用力的空間或者力分辨率。而原子力顯微鏡使用微 小的針尖作為力探針，柔軟的懸臂作為力轉(zhuǎn)換裝置，能夠獲得良好的空間和力分 辨率。同時，能夠在等同于生理學(xué)的條件下進行儀器操作，這些優(yōu)勢使得原子力 顯微鏡在生物分子間相互作用的研究中獨樹一幟。 1 2 2 生物分子問相互作用的a f m 研究簡介 1 9 9 4 年，l e e 小組田】首次報道了利用a f m 測定離散的生物分子復(fù)合物的斷 裂力。他們選用生物素一鏈霉親和素體系，這是因為該復(fù)合物具有很強的非共價 鍵作用力。牛血清白蛋白作為介質(zhì)，可以將生物素修飾于a f m 針尖表面，同時 將鏈霉親和素修飾于玻璃基板表面。鏈霉親和素分子有四個活性位點，盡管某些 位點在基板修飾中被占據(jù)，但仍然能夠保證與生物素的作用。在a f m 針尖和基 板分離的過程中，存在多種斷裂力，但是通過力曲線圖可以獲得最終斷裂力的信 息。經(jīng)過分析歸納，統(tǒng)計顯示了這些最終斷裂力的分布，其中峰值代表了一個或 多個生物素一鏈霉親和素復(fù)合物的斷裂力大小，并得出單個生物素一鏈霉親和素 特異性作用力大小為1 6 0p n 。 除了對于生物素一鏈霉親和索的研究，對于抗體一抗原的作用力研究也有報 道。s t u a r t 和h l a d y l 3 3 j 的研究中發(fā)現(xiàn)抗體一抗原非特異性斷裂力也能被檢測到， 這可能是因為分子運動性不足。d a m m c r 小組1 3 4 j 利用自組裝單層膜修飾針尖和基 底并獲得定量斷裂力。而h i n t c r d o r f c r 小組1 3 5 ，3 6 l 是第一個確定單個抗體一抗原之 9 復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文 間的相互作用力的。后兩個研究小組在修飾的過程中使用具有移動性的交聯(lián)劑分 別在針尖和基板上連接抗體和抗原，這樣可以克服一系列問題，例如定位失誤、 位阻效應(yīng)和構(gòu)型轉(zhuǎn)化，同時可以降低針尖上抗體密度，保證是單分子作用。 在蛋白質(zhì)一d n a 作用力的測定中，目前主要還是通過a f m 圖像功能定性化 的觀測它們之間相互作用的動力學(xué)過程和機理。例如蛋白質(zhì)分子是怎樣和活細(xì)胞 中d n a 上特定位點相作用的，通常這些特定位點僅僅是幾個特定堿基對，所以 相對于周圍環(huán)境中的大量非特異性d n a ，它們之間的結(jié)合顯得很神奇。利用動 態(tài)a f m 成像便可以清晰的觀測到甚至單個d n a 分子的長度，蛋白質(zhì)分子最優(yōu) 結(jié)合位點等細(xì)節(jié)問題p 7 - 3 9 。另外，基于d n a 本身的特性，也可以通過力曲線獲 得定量數(shù)據(jù)。多個小組【柏，4 l 】都對互補d n a 雙鏈中單個堿基對的相互作用力進行 了定量測定，之間存在一些數(shù)值差異可能源于特異性和非特異性的作用力，以及 不同的力加載速率 4 2 j 。也有研究d n a 分子經(jīng)過a f m 拉伸過程導(dǎo)致堿基堆積作 用消失，d n a 分子失去彈性，導(dǎo)致的b s 轉(zhuǎn)變過程1 4 3 - 4 5 。 1 3 本課題選題背景和意義 生物分子間相互作用力的研究是現(xiàn)在生物學(xué)以及相關(guān)專業(yè)中值得投入精力 進行分析研究的一個方向。這是因為它們在生物體和真實環(huán)境中對識別調(diào)控起到 了不可估量的作用。鋅指是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠和特異性的d n a 結(jié)合起到 基因轉(zhuǎn)錄的作用。所以，對于它們之間的相互作用的研究，一直以來是科學(xué)家們 關(guān)注的重點。十多年來，人們通過各種表征手段了解研究鋅指一d n a 復(fù)合物， 從一開始利用x 射線單晶衍射方法直接觀測它們之間的復(fù)雜多樣的作用方式， 到計算機模擬鋅指一d n a 復(fù)合物之間相互作用力，特定堿基對和鋅指分子的作 用力大小等，已經(jīng)走過了很長的研究之路。隨著原子力顯微鏡在單分子操縱技術(shù) 上的應(yīng)用，使用a f m 獲得的鋅指一d n a 力曲線圖可以定量分析這種特異性作用 力的大小，深刻了解鋅指一d n a 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性，使得科學(xué)家們能夠進一步 理解鋅指的基因轉(zhuǎn)錄作用。 原子力顯微鏡作為表征形貌和測量分子間作用力的手段，能有效地和定量化 地計算生物體系中兩類分子( 例如d n a 和蛋白質(zhì)) 之間的特異性作用力。鋅指 z i 億6 8 和富含g 、c 堿基對的d n a 可以特異性結(jié)合從而起到轉(zhuǎn)錄基因的作用。 我們將z i f 2 6 8 和目標(biāo)d n a 分別化學(xué)修飾在a f m 針尖和玻璃基板上，利用a f m 測定一系列z i f 2 6 8 一d n a 體系的力曲線，并計算歸納獲得z i f 2 6 8 - - d n a 復(fù)合物 的解離力大小。 同時由于z i f 2 6 8 和非特異性作用的d n a 之間存在一定的作用力，稱為非特 異性作用力，所以課題需要設(shè)計有效的對比試驗用以證實z i f 2 6 8 和目標(biāo)d n a 分 i o 援算大擎 第一章緒論 子之間的特異性作用力，并且區(qū)分其和非特異性作用力的大小，同時討論非特異 性作用力的成因。另外，課題設(shè)計不同的試驗條件以最大程度減小非特異性作用 力對z i f 2 6 8 - - d n a 分子間特異性作用力的影響，從而獲得更為精確的z i f 2 6 9 - - d n a 復(fù)合物的解離力大小。 本課題為作者作為交流學(xué)生在東京農(nóng)工大學(xué)生物技術(shù)與生命科學(xué)系三宅一 中村聯(lián)合實驗室完成。 復(fù)旦大學(xué)硬士學(xué)位論文 參考文獻 【1 1b i n n i n ggq u a t ec f , g e r b e rc a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e 明p l a y s r e v l e t t ， 1 9 8 6 ，5 6 ( 9 ) ：9 3 0 - 9 3 3 【2 】劉萬里，孫大許，馬強，閆勇剛原子力顯微鏡在信息存儲介質(zhì)檢測中的應(yīng) 用叨現(xiàn)代科學(xué)儀器，2 0 0 5 ，5 ，5 1 5 3 【3 】b i n n i n gg r o h r e rh ，g e r b e rc ，w e i b e le ，s u r f a c es t u d i e sb ys c a n n i n gt u n n e l i n g m i c r o s c o p y 叨p h y s r e v l e t t ，1 9 8 2 ，4 9 ( 1 ) ：5 7 6 1 【4 】a m a t oi a t o m i ci m a g i n g ：c 鋤d i dc a m e r a sf o r t h en a n o w o r l d 川s c i e n c e ，1 9 9 7 ， 2 7 6 ( 5 3 2 1 ) ：1 9 8 2 - 1 9 8 5 【5 】b u s t