基因工程的基本操作程序 公開課ppt課件.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,1,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,2,一、目的基因的獲取,1.目的基因,符合人們需要，能編碼蛋白質的基因,2.基因文庫P9,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,3,4,種類,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,5,某種生物的全部DNA,限制酶,DNA片段,DNA片段與載體連接,重組DNA,基因組文庫,導入受體菌中儲存,基因組文庫的構建,6,生物某個發(fā)育時期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組DNA,與載體連接,cDNA文庫,反轉錄酶,DNA聚合酶,導入受體菌中儲存,cDNA文庫的構建-逆轉錄法：,7,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,8,3.獲取目的基因的方法,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術擴增,（3）人工合成,9,依據：目的基因的有關信息。如：根據基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉錄產物mRNA基因翻譯產物蛋白質等特性,（1）從基因文庫中獲取目的基因,10,（2）利用PCR技術擴增目的基因,概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復制_的核酸合成技術。,原理：_,多聚酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA復制,11,模板DNA,12,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,13,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,14,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,第1輪結束,第2輪開始,15,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,16,PCR的基本原理,PCR反應條件PCR過程PCR的特點,第2輪結束,17,過程：,a、變性（90-95）：雙鏈DNA在受熱下，_斷裂，形成_,b、復性（55-65）：溫度降低，引物與單鏈DNA結合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,18,方式：以_方式擴增，即_,條件：前提條件:_,結果：,指數(shù),2n,短時間內大量擴增目的基因,已知基因的核苷酸序列,19,PCR技術擴增與DNA復制的比較,高溫,解旋酶,體外復制,主要在細胞核內,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內的DNA聚合酶,20,（3）人工合成法：,在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成,化學合成法、反轉錄法,21,蛋白質,mRNA,DNA,DNA,根據已知的氨基酸序列合成DNA法：,22,二、基因表達載體的構建（核心）,1.目的,A.使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,B.同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用,23,2.基因表達載體的組成：,a、目的基因,b、啟動子,c、終止子,d、標記基因,24,質粒,目的基因,限制酶,3.基因表達載體的構建過程,25,（1）用_切割質粒，使其出現(xiàn)切口露出_。（2）用_切割目的基因，使其產生_。,（3）將目的基因插入質粒的_處，加入_，形成了一個重組DNA分子,限制酶,黏性末端,同種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,26,三、將目的基因導入受體細胞-轉化,目的基因進入_內，并且在受體細胞內維持_和_的過程,穩(wěn)定,表達,受體細胞,27,1、將目的基因導入植物細胞,（1）農桿菌轉化法,特點:,a.能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力,b.Ti質粒的TDNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體上,28,Ti質粒目的基因,構建,表達載體,植物細胞,植物細胞染色體DNA,新性狀,農桿菌,29,（2）基因槍法-單子葉植物,30,（3）花粉通道法,我國轉基因抗蟲棉就是用這種方法獲得,31,2、將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法程序：,目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物,32,3、將目的基因導入微生物細胞,（1）方法：Ca2+處理法（增加細胞壁通透性）,（2）微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少,（3）過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細胞,表達載體與感受態(tài)細胞混合,感受態(tài)細胞吸收DNA,33,四、目的基因的檢測與鑒定,檢測（分子水平）:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:個體生物學水平鑒定,34,（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,首先取出轉基因生物的基因組DNA；,A方法:,DNA分子雜交,B過程:,將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針；,使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。,1.檢測,35,基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。,36,(2)檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,方法:,分子雜交法,過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA。,37,（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,方法:,抗原-抗體雜交,38,提取,方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內,從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質,出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),39,2.鑒定（個體生物學水平）,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,40,目的基因的表達和檢測,抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等,抗原抗體雜交法,DNA-RNA分子雜交法,DNA分子雜交法,41,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),外顯子,內含子,終止子,基因的結構,啟動子,原核,真核,42,原核細胞與真核細胞的基因結構比較,思考,編碼相同數(shù)目氨