基因工程的基本操作程序 公開課ppt課件.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,1,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測與鑒定,2,一、目的基因的獲取,1.目的基因,符合人們需要，能編碼蛋白質(zhì)的基因,2.基因文庫P9,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,3,4,種類,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,5,某種生物的全部DNA,限制酶,DNA片段,DNA片段與載體連接,重組DNA,基因組文庫,導(dǎo)入受體菌中儲存,基因組文庫的構(gòu)建,6,生物某個發(fā)育時期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組DNA,與載體連接,cDNA文庫,反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,導(dǎo)入受體菌中儲存,cDNA文庫的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法：,7,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,8,3.獲取目的基因的方法,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,9,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,（1）從基因文庫中獲取目的基因,10,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。,原理：_,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,11,模板DNA,12,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,13,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,14,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,第1輪結(jié)束,第2輪開始,15,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,16,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,第2輪結(jié)束,17,過程：,a、變性（90-95）：雙鏈DNA在受熱下，_斷裂，形成_,b、復(fù)性（55-65）：溫度降低，引物與單鏈DNA結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,18,方式：以_方式擴(kuò)增，即_,條件：前提條件:_,結(jié)果：,指數(shù),2n,短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因,已知基因的核苷酸序列,19,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,高溫,解旋酶,體外復(fù)制,主要在細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,20,（3）人工合成法：,在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成,化學(xué)合成法、反轉(zhuǎn)錄法,21,蛋白質(zhì),mRNA,DNA,DNA,根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：,22,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）,1.目的,A.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,B.同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用,23,2.基因表達(dá)載體的組成：,a、目的基因,b、啟動子,c、終止子,d、標(biāo)記基因,24,質(zhì)粒,目的基因,限制酶,3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程,25,（1）用_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口露出_。（2）用_切割目的基因，使其產(chǎn)生_。,（3）將目的基因插入質(zhì)粒的_處，加入_，形成了一個重組DNA分子,限制酶,黏性末端,同種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,26,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-轉(zhuǎn)化,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,穩(wěn)定,表達(dá),受體細(xì)胞,27,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點:,a.能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力,b.Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上,28,Ti質(zhì)粒目的基因,構(gòu)建,表達(dá)載體,植物細(xì)胞,植物細(xì)胞染色體DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,29,（2）基因槍法-單子葉植物,30,（3）花粉通道法,我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得,31,2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞方法：顯微注射法程序：,目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物,32,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,（1）方法：Ca2+處理法（增加細(xì)胞壁通透性）,（2）微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少,（3）過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,33,四、目的基因的檢測與鑒定,檢測（分子水平）:是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:個體生物學(xué)水平鑒定,34,（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；,A方法:,DNA分子雜交,B過程:,將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；,使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。,1.檢測,35,基因探針通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交帶，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。,36,(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,方法:,分子雜交法,過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。,37,（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法:,抗原-抗體雜交,38,提取,方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi),從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質(zhì),出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),39,2.鑒定（個體生物學(xué)水平）,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,40,目的基因的表達(dá)和檢測,抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等,抗原抗體雜交法,DNA-RNA分子雜交法,DNA分子雜交法,41,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),外顯子,內(nèi)含子,終止子,基因的結(jié)構(gòu),啟動子,原核,真核,42,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨