（材料學專業(yè)論文）plga、plgaβtcp納米纖維支架的制備、體外降解及細胞相容性研究.pdf

摘要 p l g a p l g a 1 3 t c p 納米纖維組織工程支架的制備 體外降 解及細胞相容性研究 摘要 運用靜電紡絲技術制備的組織工程支架 具有類似細胞外基質 e c m 的形態(tài)和結構 是組織工程領域的研究熱點 靜電紡絲支架的 體外降解性能評價對于進一步的體內降解和長期成功移植都是不可或缺 的步驟 本文研究了靜電紡絲法制備的p l g a p l g a b t c p 納米纖維 支架的體外降解及細胞相容性 首先 采用靜電紡絲技術 以銅網 4 0 目 為接受裝置 設計制備 了表面具有巢形花紋結構的p l g a 7 5 2 5 納米纖維支架 并比較了巢 形結構的三個典型區(qū)域 脊形區(qū) 無紡區(qū) 磁力線區(qū) 的微觀拓撲學結構 結果表明 支架的表面由許多巢形結構單元 4 0 0x3 0 0 1 a m 彼此連接而 成 盡管纖維直徑在三個典型區(qū)域中無顯著差異 8 4 9 a 11 8r i m 但纖維 取向和孔徑大小差異很大 其次 在磷酸鹽緩沖溶液 p b s p h7 4 3 7 和加有溶菌酶 1 y s o z y m e 的p b s p h7 4 3 7 c 溶液中對p l g a 納米纖維支架分別 進行體外水解和體外酶解 研究結果表明 p l g a 支架能夠隨降解的進行 而維持最初的拓撲學結構 巢形結構的骨架的存在能夠有效的防止納米纖 維支架變形 另一方面 p l g a 納米纖維支架水解過程和酶解過程都分為 兩個階段 在第一階段 分子量隨降解進行持續(xù)下降而重量損失很小 在 t 北京化工大學碩上學位論文 第二階段 分子量下降到一個低值后隨時間變化不大而重量損失很大 水 解2 0 周以后 納米纖維內部呈現多孔結構 但纖維表面幾乎完整無損 證明納米纖維 9 0 0 n m 在水解過程中 白催化效應仍然存在 而酶解 1 6 周以后的納米纖維 無論內部和表面都呈現多孔結構 溶菌酶的存在 只能加速溶解低分子量的降解產物 對于聚合物鏈的斷裂沒有貢獻 第三 應用靜電紡絲技術制備出具有巢形花紋結構的p l g a 1 3 t c p b t c p 含量1 0 w t 和2 0 w t 納米纖維復合物支架 以純p l g a 納米 纖維支架為參照 在磷酸鹽緩沖溶液 p b s p h7 4 3 7 c 中進行體外降 解實驗 研究結果表明 1 3 t c p 粒子被成功包裹在p l g a 納米纖維的內 部形成p l g a b t c p 復合支架 其拉伸強度和彈性模量分別可以達到 5 0 2 m p a 和1 2 0 m p a 三種支架的樣品重量 p l g a 分子量 拉伸強度和 模量都隨著降解過程的進行而逐漸降低 但復合支架中1 3 t c 含量的增加 有利于降低降解介質的酸度 減緩樣品重量和p l g a 分子量的下降速度 增加降解介質中c a 濃度 采用m t t 法檢測了成骨肉瘤細胞 m g 6 3 在上述三種納米纖維支架上的增殖 發(fā)現1 3 t c p 的引入及其含量的增加 有利于提高材料的細胞相容性 因此 具有巢形花紋結構的p l g a b t c p 復合納米纖維膜具有適中 的力學性能 可控的降解性能和良好的細胞相容性 有望作為骨組織工程 支架材料 關鍵詞 靜電紡絲 巢形花紋結構 自催化 p l g a 1 3 t c p 力學性能 細胞相容性 i i 摘要 p r e p a r a t i o n d e g r a d a t i o na n dc y t o c o m p a t a b i l i t yo fn e s t l i k e p a t t e r n e de l e c t r o s p u np l g a a n dp l g a 1 3 t c ps c a f f o l d s a b s t r a c t s c a f f o l d sf a b r i c a t e dv i a e l e c t r o s p i n n i n gc o u l d m i m i c ke x t r a c e l l u a r m a t r i x w e l la n db e c o m es t u d y h o t s p o t s i n t i s s u e e n g i n e e r i n g i n v i t r o e v a l u a t i o no fd e g r a d a t i o np r o p e r t i e so fe l e c t r o s p u ns c a f f o l d si sa l li n e v i t a b l e p r o c e d u r eb e f o r ef u r t h e rb i o d e g r a d a t i o n sa n dl o n g t e r ms u c c e s si nv i v o t h e p r e p a r a t i o n d e g r a d a t i o n a n dc y t o c o m p a t i b i l i t y o fn e s t l i k e p a t t e r n e d e l e c t r o s p u np l g a a n dp l g a b t c ps c a f f o l d sw e r es t u d i e di nt h i st h e s i s f i r s t l y n e s t l i k ep a t t e r n e d e l e c t r o s p u np l g a 7 5 2 5 s c a f f o l dw a s f a b r i c a t e d b ye l e c t r o s p i n n i n gu s i n gg r i dc o p p e rw i r e s a sc o l l e c t o r t h e a s e l e c t r o s p u n n e s t l i k e p a t t e r n e d p l g as c a f f o l d sw e r e c o m p o s e d o f n u m e r o u sn e s t l i k eu n i t s 4 0 0x3 0 0 9 m w h i c hh a dt h r e et y p i c a lr e g i o n sw i t h d i f f e r e n tt o p o g r a p h y r i d g e l i k e r e g i o n n o n w o v e nr e g i o na n dm a g n e t i c l i n e s l i k er e g i o n f i b e rd i a m e t e r si nt h et h r e er e g i o n sw e r ea l m o s tt h es a m e 8 4 9 a 118 n n l b u tf i b e ro r i e n t a t i o na n dp o r es i z ew e r es i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tf r o me a c ho t h e r s e c o n d l y i nv i t r oh y d r o l y t i ca n de n z y m a t i cd e g r a d a t i o no fn e s t l i k e p a t t e r n e dp l g a 7 5 2 5 s c a f f o l d sw e r ec a r r i e d o u ti n p h o s p h a t eb u f f e r i i i 北京化工大學碩一l 學位論文 s o l u t i o n p b s p h7 4 3 7 c a n dp b s 7 4 3 7 c w i t hl y s o z y m e 2 0 0 0 0 u m 1 i ni t r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h er o b u s tf r a m e w o r ko fn e s t 1 i k eu n i t sh a d p r e v e n t e dt h es c a f f o l d sf r o ms h r i n k i n gd r a s t i c a l l ya n dc o n t r i b u t e dt ot h e m a i n t a i n a n c eo fm e c h a n i c a lp r o p e r t i e sw i t hd e g r a d a t i o n b o t hh y d r o l y t i ca n d e n z y m a t i cd e g r a d a t i o no fp l g an a n o f i b r o u ss c a f f o l d sc o u l db ed i v i d e di n t o t w os t a g e s i nt h ef i r s ts t a g e t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h es a m p l e sd e c r e a s e d c o n t i n u o u s l yw i t hd e g r a d a t i o nt i m e w h e r e a sl i t t l ew e i g h tl o s so c c u r r e da tt h i s s t a g e b u ti nt h es e c o n ds t a g e t h em o l e c u l a rw e i g h td e c r e a s e dt oal o wv a l u e a n dc h a n g e dl i t t l ew i t ht i m e w h i l et h es a m p l e se x p e r i e n c e ds i g n i f c a n tw e i g h t l o s s a f t e rh y d r o l y s i sf o r2 0w e e k s n a n o f i b e r sw i t hp o r o u si n n e rb u ti n t a c t s u r f a c ew e r ed e t e c t e d a l lt h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta na u t o c a t a l y t i ce f f e c t s t i l le x i s t e di nt h e h y d r o l y s i so fp l g an a n o f i b e r s 9 0 0n m t h e d e g r a d a t i o no fp l g a 7 5 2 5 n a n o f i b e r si nt h ep r e s e n c eo fl y s o z y m ew a s p r i m a r i l yah y d r o l y s i sp r o c e s sa n dl y s o z y m eh a dn oa c c e l e r a t i n ge f f e c to nt h e c l e a v a g eo f e s t e rb o n d t h et h i r d p l g a b t c p 9 0 1 0 8 0 2 0 c o m p o s i t es c a f f o l d sw e r e p r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i n g r e s u l t si n d i c a t e dt h a t1 3 t c pp a r t i c l e sw e r e s u c c e s s f u l l ye n w r a p p e di np l g an a n o f i b e r sa n df o r m e dc o m p o s i t es c a f f o l d s t h et e n s i l e s t r e n g t ha n dm o d u l u so fa s s p u np l g a j1 3 t c pn a n o f i b r o u s s c a f f o l d sr e a c h e d5 3 5 m p aa n d1 2 0 m p ar e s p e c t i v e l ya n dd e c r e a s e dw i t h d e g r a d a t i o nw i t h i n8w e e k s w e i g h t m o l e c u l a rw e i g h to fp l g a d e c r e a s e d c o n t i n u o u s l yw i t hd e g r a d a t i o nf o rt h et h r e ek i n d so fs c a f f o l d s h o w e v e r i v 摘要 i n c r e a s e dc o n t e n to f1 3 一t c pi np l g a b t c pc o m p o s i t es l o w e dd o w nt h e d e g r a d a t i o nr a t eo fp l g ac o m p o n e n t d e c r e a s e dt h ea c i d i t ya n di n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o no fc a 2 i nd e g r a d a t i o nm e d i e u m m t tr e s u l t si n d i c a t e dt h a t c y t o c o m p a t i b i l i t yw e r ea l s oi m p r o v e dw i t hi n c r e a s e dc o n t e n to fb t c p t h e r e f o r e p l g a b t c pc o m p o s i t es c a f f o l d sw i t ha p p r o p r i a t em e c h a n i c a l p r o p e r t i e s a d j u s t a b l ed e g r a d e a t i o nr a t ea n dp r e f e r a b l ec y t o c o m p a t i b i l i t yw i l l b ep o t e n t i a lc a n d i d a t ef o rt i s s u ee n g i n e e r i n g k e y w o r d s e l e c t r o s p i n n i n g n e s t l i k ep a t t e m e ds c a f f o l d d e g r a d a t i o n a u t o c a t a l y t i ce f f e c t p l g a b t c p c y t o c o m p a t i b i l i t y v 北京化工大學位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學位論文 是本人在導師的指導下 獨立 進行研究工作所取得的成果 除文中已經注明引用的內容外 本論文不含 任何其他個人或集體己經發(fā)表或撰寫過的作品成果 對本文的研究做出重 要貢獻的個人和集體 均已在文中以明確方式標明 本人完全意識到本聲 明的法律結果由本人承擔 作者簽名 i 翁墓婦遼 日期 冱呈 蔓 f 關于論文使用授權的說明 學位論文作者完全了解北京化工大學有關保留和使用學位論文的規(guī) 定 即 研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬北京化工大 學 學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤 允 許學位論文被查閱和借閱 學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內容 可 以允許采用影印 縮印或其它復制手段保存 匯編學位論文 保密論文注釋 本學位論文屬于保密范圍 在必解密后適用本授 權書 非保密論文注釋 本學位論文不屬于保密范圍 適用本授權書 作者簽名 圈窆塑 1日期 迎孕 笠 三 導師簽名 二b 碰車一 日期 型駕 玉華牛l 第一章緒論 1 1 組織工程 第一章緒論 人體組織和器官的衰竭 損傷是最主要的臨床醫(yī)學問題 對人體的健康和生命構 成了嚴重的威脅 治療組織 器宮損傷的方法有以下幾種 一是自體器官移植 是以犧牲健康組織為代價的 以傷治傷 的方法 雖然臨床 效果不錯 但是供區(qū)非常有限 二是同種異體器官移植 但是存在供體器官嚴重不足 的問題 三是人工替代物 則存在生物相容性的問題 四是采用醫(yī)療器械 但是不能 代替器官的所有功能 不能很好地修復組織或器官的損傷 為了解決人體組織和器官 缺損的修復難題 不少臨床醫(yī)生和其他相關領域的專家合作 探索新的治療途徑 其 中 美國麻省理工學院的化學工程師r l a n g e r 和哈佛大學醫(yī)學院的醫(yī)生j p v a c n a t i 在 8 0 年代中期提出了一種想法 即在支架材料上種植人體活細胞 在生長因子的作用下 生成組織 并提出了組織工程這一概念 t i s s u ee n g i n e e r i n g 組織工程這一學科立刻引 起了各個領域的專家學者們的關注 取得了許多突破性進展 i 5 目前更是成為了繼器 官移植和外科重建手術這兩大臨床治療手段后的第三大醫(yī)學治療技術 6 關于組織工程的定義 大部分文獻都遵循了r l a n g e r 和j e v a c n a t i 于1 9 9 3 年發(fā) 表在 科學 上的文章 j 7 中的表述 即 組織工程學是 n 交叉學科 它利用工程學 和生命科學的原理 來研究和發(fā)展具有生物活性的人工替代物 用以維持 恢復或提 高人體受損組織的功能 這是一門新興的交叉學科 高度依賴于材料學 化學 細胞 生物學 分子生物學 基因工程 力學和醫(yī)學等學科的發(fā)展 又獨立于各個學科之外 成為一門獨特的技術 它的目的是 利用人體活細胞在適宜的支架材料上生長成天然 的組織和器官以替代人體內受損和缺失的組織和器官 在組織工程概念提出后的十幾年中 組織工程學的內涵不斷地豐富和發(fā)展 8 1 0 1 其思路為將功能相關的活細胞接種于細胞外基質替代物上 這種替代物可為細胞提供 一個空間結構 使細胞在上面生長 體外培養(yǎng)一定時期后形成細胞與替代物的復合物 再將所得復合物移植到體內受損組織處 以修復受損組織 組織工程的另一種方法是 將擴增的細胞與支架前驅體混合后注射到體內 原位形成凝膠狀支架 這類支架提供 新組織形成的空間 控制工程化組織的結構與功能 組織工程中所用的替代物材料一 般為可生物降解的人工合成的高分子支架材料或天然的生物大分子支架材料 植入體 內的支架材料經過一定時間后可完全降解并被人體所吸收 不會在體內留下異物 由 此可見 細胞 支架及其組合方法是組織工程的三要素 l 臨床醫(yī)學 細胞 分子 生物 北京化工大學碩 畢業(yè)論文 學和材料學是組織工程所涉及的三個最主要的學科領域 多年來組織工程的研究內容 主要集中在生物材料的研制 種子細胞的培養(yǎng) 生長因子的使用以及細胞與支架材料 的組合及塑形等方面 組織工程的發(fā)展很快 在皮膚 角膜 肝 胰 軟骨 骨 血 管 尿道 神經系統(tǒng)等領域均取得了一定成績 目前組織工程開始向產業(yè)化發(fā)展 1 2 組織工程用生物材料 組織工程材料按其來源可分為天然的生物大分子材料和人工合成的高分子材料 按其降解性能又可分為可生物降解的材料和不可生物降解的材料 按其形態(tài)可分為水 凝膠類材料和多孔支架材料 11 也 1 2 1 天然類組織工程用生物材料 天然生物材料一般生物相容性良好 工程 但是天然生物材料因其來源不同 限性 1 2 1 1 膠原和明膠 不易產生排異反應 已廣泛應用于組織 結構與性能存在批次間的差異 故有其局 膠原 c o l l a g e n 被廣泛地應用于組織工程 它是細胞外基質 e c m 的主要成分 膠 原是人體中含量最豐富的一種結構蛋白 約占機體總蛋白的2 5 目前己發(fā)現的膠 原蛋白類型不少于1 9 種 1 3 常用作組織工程材料的主要是i i i 以及i i i 型膠原 其 中又以i 型膠原應用最為廣泛 膠原分子呈棒狀 長約2 8 0 n m 分子量約為3 0 x1 0 5 由三條多肽鏈組成 膠原吸水膨脹 但不溶于水 通過酶消化提取的膠原往往表現出 溫和的免疫原性 1 4 1 而且膠原分子中包含有促進細胞粘附和生長的精氨酸一甘氨酸一 天冬氨酸 r g d 多肽片段 表現出良好的細胞相容性 1 5 2 川 具體優(yōu)缺點見表1 1 因此 膠原是較早通過美國藥品和食品管理委員會 f d a 批準的生物材料之一 被廣泛地應 用于創(chuàng)傷敷料 醫(yī)療器械以及藥物釋放等領域 妊1 9 1 近年來 隨著組織工程的發(fā)展 膠原在構建組織工程支架以及對其他組織工程材料的表面改性發(fā)面發(fā)揮了巨大的作 用 2 第一章緒論 表1 1 膠原作為支架材料的優(yōu)點和缺點 t a b l e1 1t h ea d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so fc o l l a g e n 硒as c a f f o l dm a t e r i a l 優(yōu)點 來源廣泛 容易獲得 免疫原性低 生物安全性及生物相容性好 可降解吸收 且降解速率可控 帶有較多功能基團 利于改性 便于加工成多種形狀 缺點 降解速率過快 機械強度不足 材料質量批次間差別較大 獲得高純度的膠原費用高 膠原作為組織工程材料應用最早和最廣泛的領域是皮膚組織工程 早在1 9 8 0 年 b u r k e 和y a n n a s 就報道了膠原 6 硫酸軟骨素在構建真皮替代物中的應用 2 1 1 b o y c e 等 以膠原 6 硫酸軟骨素凝膠作為基材 成功構建了種植有成纖維細胞和表皮細胞的全層 皮膚替代物 2 2 1 用于構建軟骨組織工程支架的膠原主要為i 型和i i 型膠原 近來 對 于不同類型膠原對組織工程軟骨的結構與功能的影響進行了深入的研究 s p e c t o r 等研 究發(fā)現 2 3 1 半月板軟骨細胞在i 型膠原 糖胺聚糖 g a g 支架中的增殖行為明顯不如在 i i 型膠原 g a g 支架中活躍 而且只有種植于 型膠原 g a g 支架中的半月板軟骨細 胞才能分泌g a g 此外膠原類型還對支架體外培養(yǎng)過程中的支架收縮行為產生影響 i i 型膠原 g a g 支架在整個培養(yǎng)過程中未見發(fā)生明顯收縮 而i 型膠原 g a g 支架則收 縮了近5 0 楊志明等將人胚胎軟骨細胞種植入膠原支架中 經植入裸鼠體內一段時 間后可形成透明的軟骨組織 矧 以膠原作為主要材料構建的支架還廣泛地應用于組織工程骨 血管 角膜等多種 組織或器官 r e d d i 通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 r h b m p 2 與膠原支架復合 構建有良好 修復效果的組織工程骨 2 5 1 k u z u y a 等采用i 型膠原作為主要原料構建了組織工程化人 工血管 2 6 1 明膠是膠原的部分變性衍生物 它由膠原的三重螺旋結構解體為單分子而形成 是天然多肽的聚合物 明膠中含量最多的氨基酸是脯氨酸 羥脯氨酸和甘氨酸 很少 量的蛋氨酸 分子量為1 5 1 0 4 2 5 1 0 4 明膠有兩種類型 即明膠a 和明膠b 明膠a 是在熱變性前用酸預處理的明膠 而明膠b 則是用堿預處理 使其谷氨酞胺 與天冬酞胺的酞胺殘基轉變?yōu)楣劝彼岷吞於彼?因此明膠b 的氨基含量比明膠a 的氨基含量至少高2 5 明膠水溶液的溫度降至3 5 以下時形成熱可逆性凝膠 此時 大分子鏈從線團狀構象轉變成螺旋狀 這個過程中它們容易恢復到膠原的三重螺旋結 構 物理凝膠明膠的轉化溫度和凝膠濃度 陳化時間 p h 等參數有關 2 7 1 明膠水溶 液中分子存在兩種可逆變化的構型 溶膠形式a 一一凝膠形式b 溶膠a 存在于較高溫度 3 5 c 以上 在1 5 3 5 兩種形式的明膠分子成平衡態(tài) 3 北京化工大學碩f 畢業(yè)論文 共存 明膠溶液形成凝膠的濃度最低極限值約為o 5 凝膠存在的最高溫度為3 5 明膠凝膠的物理網絡在較高溫度下解體 不適于3 7 下長期使用 同時明膠水凝 膠熱穩(wěn)定性和力學穩(wěn)定性也不高 因此有待通過化學交聯改善 明膠凝膠可用戊二醛 化學交聯 形成化學交聯明膠凝膠 也可用n n 一 3 二甲胺丙基 n 乙基碳二亞胺 e d c 和n 羥基丁二亞胺 n h s 化學交聯 形成交聯凝膠 此時明膠上的羥基和氨基在e d c 和n h s 的存在下 相互反應形成肽胺交聯鍵 g e l a t i n c o o h n h g e l a t i n 一一一g e l a t i n c o n h g e l a t i n h 2 0 1 2 1 2 透明質酸 透明質酸 h y a l u r o n i ca c i d 是e c m 中g a g s 的重要組成物 尤其在結締組織中含 量豐富 透明質酸具有高度水化的性能 在對組織內部的水分平衡 關節(jié)的潤滑以及 穩(wěn)定軟骨基質等方面發(fā)揮了重要的作用 2 8 其分子量為5 0 1 0 4 8 0 1 0 6 它在創(chuàng) 傷愈合中起著重要的作用 高純度的透明質酸免疫原性低 生物相容性好 而且透明質酸在體內可被血清中 的透明質酸酶所降解 其降解物對創(chuàng)面愈合具有促進作用 目前 透明質酸在藥物佐 劑 骨固定物以及皮膚覆蓋物等方面都已有應用 但由于透明質酸的力學強度不夠 無法單獨應用于構建組織工程支架 多數情況下需要與其他種類的組織工程支架復合 使用 l i n s h ul i u 等應用碘酸鈉氧化法獲得含醛基透明質酸 與膠原交聯后 構建了 膠原一透明質酸多孔支架 該支架在小鼠體內表現出良好的生物相容性 能夠有效促 進小鼠骨組織的再生 2 9 1 近年來 意大利f i d i a 先進生物材料公司開發(fā)的透明質酸芐 酯無紡布h y a f f i i 被廣泛地應用于骨和軟骨組織工程的研究 通過調節(jié)酯化度的高低 可以獲得一系列具有不同降解速率的h y a f f i i 3 0 1 s o l c h a g a 等 3 l 的研究證明成骨細胞 在h y a f f 1 1 支架中的數量要遠遠高于磷酸鈣陶瓷支架 其在骨組織工程中具有巨大的 發(fā)展?jié)摿?1 2 1 3 血纖蛋白 血纖蛋i 芻 f i b r i n 通常用做外科密封膠和粘合劑 是實現創(chuàng)傷愈合的主要生物基 質 血纖蛋白能夠促進成纖維細胞的滲透與增殖 從而加速創(chuàng)傷的修復過程 血纖蛋 白凝膠可以用患者的自體血液制備 因此它是自體組織工程支架 血纖蛋白原在凝血 酶的存在下于室溫酶促聚合形成凝膠 3 2 血纖蛋白是體內天然組成成分 具有很好的 細胞相容性 血纖蛋白構建的組織工程支架能促進細胞的黏附 生長以及遷移 進而 引導組織再生 而且血纖蛋白能促進移植支架的血管化 血纖蛋白的降解速率可由蛋 白酶控制劑 例如抑蛋白酶肽 調控 3 3 4 第一章緒論 血纖蛋白凝膠負載的血小板衍生生長因子 p d g f 和轉化生長因子b t g f 一1 3 可 促進細胞遷移 增殖和基質合成 分別將轉谷氨酰胺糖因子 a 底物和含r g d 序列 的生物活性膚功能域引入到血纖蛋白凝膠中 制備出可望用于神經系統(tǒng)的生物材料 血纖蛋白凝膠還可種植骨骼肌肉細胞 平滑肌細胞和軟骨細胞形成細胞 支架結構物并 最終形成工程化組織 但血纖蛋白凝膠力學性能較差 影響了其應用 h o m m i n g a 等將不同濃度的軟骨細胞種植于血纖蛋白凝膠中 結果顯示血纖蛋白 對軟骨細胞無細胞毒性 而且能保持軟骨細胞的表型瞰 s i m s 將種植了小牛軟骨細 胞的血纖蛋白凝膠植入裸鼠背部 種植1 2 周后發(fā)現 所構建的組織在宏觀形貌以及 物理性能上都與軟骨組織接近 組織學分析顯示所構建組織中含有較多新生的軟骨組 織類細胞外基質 而且其g a g 和d n a 的量僅略低于天然小牛軟骨 3 引 1 2 1 4 殼聚糖 殼聚糖 c h i t o s a n 是一種帶有多氨基的多糖類物質 是甲殼素脫乙酰化的產物 其平均分子量一般在3 0 萬 1 0 0 萬 脫乙?；韧ǔ４笥? 0 甲殼素則是一種存 在于節(jié)足動物的外殼以及真菌類細胞壁中的天然多糖類物質 其來源非常廣泛 殼聚 糖雖然不是人體中e c m s 的構成物 但其結構和一些性質與細胞外基質的主要成分氨 基葡聚糖非常類似 3 6 1 殼聚糖具有良好的生物相容性和可降解性 無刺激性 無免疫 原性 無熱源反應 并具有促進創(chuàng)面愈合的功能 而且易于加工成多孔支架 管材 棒材以及微球等型材 3 7 訓 殼聚糖分子鏈上富含氨基與羥基 非常便于對殼聚糖進行 改性 以改變其溶解性和加工性能 4 2 早期 殼聚糖主要應用于醫(yī)用縫合線 防粘連 材料以及創(chuàng)面敷料等方面 近年來 殼聚糖作為一種新型的組織工程材料越來越得到 人們的重視 3 8 4 3 1 馬建標 3 6 等 以殼聚糖為原料 構建了具有雙層結構的殼聚糖多孔 支架 體外培養(yǎng)結果證明 成纖維細胞在該支架中能獲得良好的生長 姚康德等則實 現了在具有雙層結構的殼聚糖一明膠多孔支架中同時構建具有表皮和真皮結構的組 織工程皮膚 4 5 朱惠光和計劍等通過表面截留的方法 將氨基酸改性過的殼聚糖固 定到聚乳酸的表面 獲得了對軟骨細胞具有良好相容性的雜化表面 4 6 1 l e e 等采用三 聚磷酸鈉交聯磷酸三鈣增強的殼聚糖支架 體外培養(yǎng)的成骨細胞在支架中呈現多層結 構 并且能表現出很高的堿性磷酸酶活性 說明這種殼聚糖支架能有效地促進成骨細 胞的粘附與增殖 并保持細胞表型不變f 7 1 1 2 1 5 海藻酸鹽 海藻酸 a l g i n a t e 是由褐藻提取的多糖 常用作止血材料和創(chuàng)傷敷料 其分子 中的羧基能轉變成鈉鹽和鈣鹽 從而變成很粘稠的溶液 可作為增稠劑 穩(wěn)定劑和凝 5 北京化丁大學碩卜畢業(yè)論文 膠劑使用 向海藻酸的酸性溶液中添n 價陽離子如c a m 孑 a a 2 s r 2 則它們 與海藻酸的古洛糖醛酸上的羧基發(fā)生靜電相互作用 形成乳白色的凝膠 利用凝膠化 特性 可用海藻酸鹽對細胞進行微包囊 作為酸性粘多糖的海藻酸 此時類似于細胞 外基質的主要成分g a g s 由于海藻酸生物材料不能降解 使其應用受到一定的限制 利用過碘酸鈉可使海 藻酸鹽輕度氧化 而氧化海藻酸鹽可通過水解途徑降解 氧化5 的海藻酸鹽仍能由 c a 2 交聯形成凝膠 該交聯凝膠在磷酸緩沖溶液中9 天內基本降解完全 降解型海藻 酸水凝膠與一般海藻酸水凝膠相比能明顯的促進軟骨組織在動物體內的形成 4 引 海藻 酸鹽凝膠用于組織工程時的另一個問題是缺乏和細胞的結合位點 海藻酸鹽有強親水 性妨礙蛋白質的吸附 不能和哺乳動物的細胞相互作用 4 9 1 用糖特異結合蛋白凝集素 修飾海藻酸鹽可增強與細胞的結合能力 5 0 l 此外 將r g d 序列細胞粘連配體與海藻 酸鹽凝膠偶聯可改善骨骼肌肉細胞的粘連 增殖 分化和細胞的原型表達 5 1 1 1 2 1 6 瓊脂糖 瓊脂糖 a r g r o s e 是另一種海藻多糖 它是1 4 鍵合3 6 0 l 半乳糖和1 3 一鍵合 1 3 d 半乳糖的交替共聚物 瓊脂糖溶于6 5 0 c 以上的熱水中 根據其側鏈上羥乙基取 代度的不同 可在1 7 4 0 范圍內形成凝膠 瓊脂糖凝膠一旦形成 其結構比較穩(wěn)定 溫度恒定時并不溶脹 當加熱到6 5 0 c 以上時再轉變成溶膠 軟骨細胞種植于瓊脂糖凝膠構筑的細胞 瓊脂糖材料結構物可用來研究細胞代謝 包括各種生長因子 細胞形狀 細胞外基質合成 細胞原型表達以及在動物關節(jié)缺 損模型中關節(jié)軟骨形成速率等的影響因素 結果確認向軟骨細胞 瓊脂糖結構物施加壓 縮應變影響其糖氨多糖 d n a 和總蛋白的合成能力 用同種異體軟骨細胞 瓊脂糖 凝膠結構物對兔關節(jié)軟骨的全層缺損進行修復 與對照組相比具有顯著的差異 形成 新軟骨下骨 同時新合成組織和宿主關節(jié)軟骨的整合性良好 5 2 1 2 2 合成類組織工程生物材料 合成類組織工程材料的最大優(yōu)點在于可以根據具體組織或器官的特點進行專門 設計 其表面性能以及生物降解速率都可進行調節(jié) 而且合成組織工程材料的力學性 能和加工性能都較天然組織工程材料優(yōu)良 產品的質量也易標準化 有利于大規(guī)模生 產 總體說來 合成組織工程材料的種類多 選擇范圍廣 是組織工程材料發(fā)展的重 要方向 合成組織工程材料的最大缺點是材料表面缺乏細胞可以識別的位點 不具備 生物活性 而且材料的降解產物可能存在一定的毒性 5 3 6 第一章緒論 1 2 2 1 聚乙醇酸 聚乳酸及其共聚物 聚乙醇酸 p g a 聚乳酸 p l a 及其共聚物 p l g a 在醫(yī)學領域被廣泛應用 該類 聚合物通過酯鍵水解而發(fā)生降解 其降解產物無毒 最終能夠被機體代謝排出體外 5 4 5 5 1 因此 該類聚合物已經得到美國f d a 的批準 廣泛地應用于手術縫合線 骨 釘等醫(yī)療領域 5 6 1 一 聚乙醇酸 p g a 聚乙醇酸又稱作聚乙交酯 p g a 是最簡單的線形脂肪族聚酯 它由乙交酯開 環(huán)聚合而成 p g a 玻璃化轉變溫度t g 為3 5 4 0 具有結晶度高 4 5 5 5 熔點 高 2 2 0 2 2 5 c 等特點 是最早應用于醫(yī)用縫合線的合成材料 高度結晶的p g a 不溶 于大多數有機溶劑 只溶于高氟代的有機溶劑 六氟異丙醇 中 以p g a 為原料的無紡 網狀支架主要應用于組織工程軟骨 骨以及肌鍵的構建 v a c a n t i 等將兔軟骨細胞種植 于厚約l o o g m 的無紡p g a 支架中體外培養(yǎng)一周后 移植于兔膝蓋創(chuàng)面 7 周后 埋 植了軟骨細胞 p g a 復合物的創(chuàng)面都形成了新生軟骨組織 而對照組只有少量纖維狀 軟骨存在 57 1 1 9 9 5 年 曹雨林等取小牛肩部 膝部的肌腱細胞 接種于0 4 c m x0 4 c m 無紡p g a 網狀支架上 體外培養(yǎng)l 周植入裸鼠皮下 結果在第6 周標本中發(fā)現 支 架四周排列著拉長的肌腱細胞 中心部分則顯示較多的隨意排列的肌腱細胞和細胞外 基質 在第1 2 周標本中 支架四周和中心部分的細胞已完全和正常肌腱組織相剮5 8 二 聚乳酸 p l a 聚乳酸又稱作聚丙交酯 p l a 是近來應用更為廣泛的一種組織工程材料 由于 其單體分子手性的不同 可以分為l 型 d 型以及d l 型p l a 其中由于自然界中多 為l 乳酸 所以l 型p l l a 應用更為廣泛 聚乳酸可以由丙交酯催化開環(huán)聚合而成 也可以由乳酸直接縮聚合成 p l l a 和p d l l a 為結晶性聚合物 而p d l l a 為無定型 聚合物 相對于p g a 而言 由于p l a 的疏水性提高 其降解時間大大延長 p u a 完全 降解至少需要2 4 個月 而且其降解產物乳酸往往會導致局部組織p h 值降低 進而誘 發(fā)組織炎癥反應 5 6 1 以p l l a 為支架材料己經有大量的報道 c h u 等將兔的肋部軟骨 細胞種植于圓柱狀的p l a 多孔支架中 體外培養(yǎng)結果證明軟骨細胞在支架中具有較 高的細胞活性 5 9 1 將上述支架與兔軟骨膜處細胞復合后 體內移植6 周后所構建的組 織中只含有2 0 的i i 型膠原 另外8 0 都為i 型膠原 組成與正常軟骨組織相差甚遠 7 北京化t 大學碩i j 畢業(yè)論文 但是非常接近軟骨膜的組成 由此可見構建的組織工程化組織的組成更多的是取決于 細胞的種類而不是支架的性能 刪 三 聚乙丙交酯 p l g a 通過不同比例p l a 和p g a 的共聚 可獲得一系列具有不同降解速率 從幾個星期 到幾年 的聚乙丙交酯 p l g a p l g a 8 5 1 5 常用做手術縫合線 其他組成的p l g a 則多用于控制釋放載體 大孔p l g a 7 5 2 5 海綿作為組織工程支架使用 蔡晴等比較 了兩種p l a 與p g a 比例分別為5 0 5 0 和7 0 3 0 的p l g a 在體外的水解和酶解行為 實驗結果顯示p l g a 5 0 5 0 的失重速率要快于p l g a 7 0 3 0 而且發(fā)現胰酶對p l g a 的降解作用是由表及里進行的 因此p l g a 比表面積越大 降解速度越快 6 1 1 r i l e y 等以氯化鈉為致孔劑 采用鹽溶瀝出的方法構建了孔徑為1 5 0 3 0 0 9 m 的p l g a 7 5 2 5 多孔支架 體外種植小鼠成骨細胞于支架中5 6 天后 成骨細胞己經侵入支架 2 0 0 p m 深處 并保持其堿性磷酸酶活性 此時p l g a 支架己經發(fā)生了部分礦化 6 2 1 1 2 2 2 聚己內酯 聚己內酯 p c l 是另一類具有良好生物安全性的聚酯類聚合物 聚己內酯的玻璃 化溫度和熔點都很低 在室溫下呈橡膠態(tài) 適于構建軟組織工程支架 聚己內酯的另 一顯著特點是降解速率緩慢 通常其完全降解時間以及強度保持時間都大于2 4 個月 非常適于作為長期植入裝置或再生速率緩慢的組織或器官的支架材料 6 3 1 1 2 2 3 醫(yī)用聚氨酯 p u p u 具有優(yōu)異的力學強度 高彈性 耐磨性 潤滑性 耐疲勞性 生物相容性 可加工性等性能 因此被廣泛用于生物材料 尤其是血液接觸材料以及組織工程中的 支架材料 以促進細胞和組織的再生 如長期植入的醫(yī)用裝置及人工器官等 但是未 經處理的p u 表面往往不利于細胞的生長 硎 1 2 2 4 其它合成組織工程生物材料 其它用于組織工程的高分子材料有聚 3 羥基丁酸酯 聚四氟乙烯 聚氨基酸 聚酐類 聚乙烯醇 p v a 聚膦腈類 聚甲基丙烯酸羥乙酯 p h e m a 聚氧化乙烯一 聚氧化丙烯一聚氧化乙烯 p l u r o n i c 智能水凝膠等 因它們各自的特點被不同程度地用 作生物材料 6 5 石刀 8 第一章緒論 1 2 3 組織工程用無機材料 1 2 3 1 羥基磷灰石 羥基磷灰石 h y d r o x y a p a t i t e h a 或h a p 化學分子式為c a l o p 0 4 6 o h 2 或 c a 6 卵0 4 3 o h 結構為六方晶系p 6 3 m 空間群 是脊椎動物骨骼和牙齒中的主要無 機成分 鋁 在骨質中 羥基磷灰石大約占6 0 是一種長度為2 0 0 4 0 0 埃 厚度 1 5 3 0 埃的針狀結晶 其周圍規(guī)則地排列著骨膠原纖維 齒骨的結構也類似于自然骨 但齒骨中的羥基磷灰石的含量高達9 7 因為具有同人體和動物骨骼 牙齒極為相似的 孔結構和化學成分 羥基磷灰石具有良好的生物相容性 對人體安全 無毒 又能夠 在植入人體后同骨表面形成很強的化學鍵結合 很好的輔助骨的生長 是很好的硬組 織替代材料 其抗壓強度較高 但抗拉強度 抗沖強度 斷裂韌性較低 在生理環(huán)境 中抗疲勞強度差 目前僅限用于不承力的部位 如牙科 整形外科和上顎面重建等領 域 6 9 1 隨后人們合成出柱狀和針狀的納米級h a 粉體和微晶 這些納米h a 粉體不僅 在制備h a 陶瓷方面提供了優(yōu)良的性能 而且在功能方面表現出一些特異性能 研究 表明 h a 的許多特性與其粒徑大小密切相關 當粒徑大小介于l 一 1 0 0 n m 時 h a 不 僅是一種性能優(yōu)良的無機陶瓷粉末 而且具有獨特的生物學活性 7 0 1 比如納米h a 對 癌細胞具有一定的抑制作用 但對正常細胞卻基本沒有影響 7 l 因此 對納米h a 制 備方法及其醫(yī)學應用的研究已越來越受到國內外材料工作者的廣泛關注 在骨科 整 形外科等臨床應用上取得了許多可喜的成果 但由于該類材料脆性大 強度低 力學 性能差 降解產物難以代謝等缺點 僅能應用于非承載的小型種植體 如人工齒骨 耳骨 充填骨缺損等 大大地限制了它作為人體種植體的廣泛使用 其降解性能仍然 是材料工作者和臨床應用需要解決的問題 在應用時要和其它材料復合 比如h a 與 天然生物材料的復合或與有機生物醫(yī)用材料的復合 1 2 3 21 3 磷酸鈣 1 3 t c p 磷酸鈣 t c p 的結構分為高溫型a t c p 和低溫型b t c p a 相和1 3 相的轉化溫 度是1 1 2 0 1 1 8 0 a 相為單斜晶 1 3 相為菱面晶 同a t c p 相比 1 3 t c p 的主要 優(yōu)點是有著更好的降解性能 1 3 t c p 材料的體外實驗顯示 該材料具有良好的細胞 相容性 動物或人體細胞可以在材料上正常生長 分化及繁殖 7 2 7 4 眾多的動物體內 實驗和臨床應用也表明 該材料無毒性 無局部刺激性 不致溶血或凝血 不致突變或 癌變 由于其組織成分與骨組織無機成分相同 故植入體內無明顯異物反應 局部無 明顯炎癥反應 d r i s k e l l 最早 19 7 3 年 觀察到1 3 t c p 材料植入骨缺損后 材料可以與 9 北京化工大學碩 t 畢業(yè)論文 骨組織發(fā)生直接連接 其間無纖維結締組織介入 將四種不同孔隙率和孔徑的聲1 3 t c p 材料植入兔脛骨內 發(fā)現上述幾種材料均表現出良好的生物相容性 材料植入 后局部發(fā)現巨噬細胞 多核巨細胞 成纖維細胞等參與材料的降解 但無炎性細胞浸 潤等炎癥反應 而且新骨可以直接在材料表面形成 且1 3 磷酸鈣 b t c p 具有良好的 生物降解性 其鈣 磷的質量比為1 5 與正常骨組織接近 而且多孑l1 3 t c p 還可 以提供大的比表面積 有利于細胞的增殖 分化和代謝 將其植入生物機體中 降解 下來的c a p 進入活體循環(huán)系統(tǒng) 對形成新生骨有一定的促進作用 b o o 7 5 等采用 組織工程的方法成功構建出骨組織 并認為1 3 t c p 較h a 更適于組織工程骨的構建 目前 國內外許多學者對b t c p 生物陶瓷多孔支架進行了相關方面的研究 鳥山等 7 6 以1 3 t c p 為原料制備多孔支架 最高強度達到1 9 7m p a 符合人致密骨強度的要 求 k l e i n t 7 7