（環(huán)境科學(xué)專業(yè)論文）秸稈降解菌的選育及復(fù)配研究.pdf

鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o d e r ni n d u s t r y , t h eh r g e s c a l eu s eo fp e s t i c i d e sa n dc h e m i c al f e r t i l i z e r s ，s o i lo r g a n i ct r o t t e rc o n t e n tw e r ed e c r e a s e d a tt h es a m et i m e ，as u r p l u so fs t r a w s p r o b l e m si s m o r ea n dm o r ep r o m i n e n t , r e s u l t i n gi nt h eb m n i n go ft h es t r a wa n ds oo n , p o l l u t i n gt h ee n v i r o n m e n t , b u ta l s o r e s ul t e di naw a s t eo fr e s o u r c e s s t r a wr e t w n i n gh a sb e e n p r o v e dt oi n c r e a s et h es o i lo r g a n i cr m t t e rc o n t e n ta n dt m i r a ai nt h em a t e r i alb a hn c eo fhn d u h o w e v e r , s t r a wr e t u r n i n gd i r e c t l yw i l la d v e r s e l ya f f e c ta g r i c u l t u r a lp r o d u c t b n , c o m b i n e d a p p l i c a t i o no fh i g h - e f f i c i e n ts t r a w - d e c o m p o s i n gb a c t e r i aw i t hi tw a se f f e c t i v e i nt h i ss t u d y , b a s e do ns t r a wc o m p o s i t i o n , s t r u c t u r ea n dc h a r a c t e r i s t i c s ，t h r o u g ht h es t r a i n s e l e c t i o n , c o m p o s i t i o na n dd o m e s t i c a t e ds t r a i n si no r d e rt ob u i l dh i g h - p e r f o r m a n c es t r a i n so fs t r a w d e g r a d a t i o n , t h er e s u l t sw e r ea sf o l b w s ： 1 i nt h i ss t u d y , f i v es t r a i n s ，n u m b e r e dx 1 一x 5 ，w e r ei s o h t e df r o mr o t t e ns t g a w , c o wd u n g c o m p o s t , a n dp a d d ys o i la m o n g t h e5s t r a i n s ，x ih a dt h eh i g h e re n z y m ea c t i v i t ya n ds t r a w d e c o m p o s i t i o ne f f i c i e n c y t h ea c t i v i t i e so fc x ，c b c 1 ，f p aa n dh e m i c e l l u l a s eo fx 1w e r e 5 3 6u m l ，6 9 7u m l ，9 5u m l ，1 1 6u m la n d2 3 4 1 5u m l ，r e s p e c t i v e l y t h es t r a w - d e g r a di n ge f f i c i e n c yo f x li na l ls t r a i n sw e r et h eh i g h e s t , r e a c h i n gu pt o4 0 2 2 t h es t r a i nx 1w a sc h o s e na st h es t a r ts t r a i nf o rm u m 薩n i ct r e a t m e n t sw i t hu l t r a v i o l e t a n dn i t r o u sa c i d t h em u t a my11 - 4w a ss e l e c t e d c o m p a r e dw i t hx 1 ，t h ea c t i v i t i e so ft h e f p a ，c x , c b ，c1 ，h e m i c e l l u l a s ea n ds t r a w - d e g r a d i n go fy 11 - 4w e r ei m p r o v e db y13 2 l8 7 ，2 7 9 ，4 6 8 ，4 4 1 a n d11 5 ，r e s p e c t i v e l y 3 f o u rl i g n i n - d e g r a d i n gf u n g iw e r ec h o s e na c c o r d i n gt ot h e i rl i g n i n - d e g r a d i n ge n z y m e s a c t i v i t y l 3h a dt h eh i g h e s tl i g n i np e x n a s ea c t i v i t yt h a tr e a c h e du pt o13 5u m l s i xy e a s t s w a si s oht e df r o md i s ti l l e r sy e a s ta n ds o i la m o n gt h e n , , m i n e dj 6c o u l df e r m e n tx y b s ea n d g l u c o s e ，w h i c hw a sg o o d t or e d u c e p r o d u c t i n h i b i t i o no nc e l l u l o s ea n dh e m i c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n 4 u s i n gs t r a wa ss o l ec a r b o ns o u r c e ，d o m e s ti c a t e ds t r a m sf r o mf o r e s ts o i la n db a m b o o f o r e s ts o i lw a so b t a i n e d b y r e s l x i e ti v ec u l t u r ea n dc o m b i m t i o n t h es l r a w - d e g r a di n g e f f m i e n c yo ft h ed o m e s t i c a t e ds t r a i n sw a su pt o3 8 3 am i x t u r ew i t hy 11 - 4 + x 2 + l 3 + j 6 c o n s i s t i n go fc e l l u l o s e d e c o m p o s i n gf u n g i , l i g n i n - d e g r a d i n gf u n g ia n dy e a s tw a so b t a i n e db y s t r a i nc o m b i m t i o n ae f f r i e n ts t r a w - d e g r a di n gc o m b i n e di n o c u hw a so b t a i n e db yr e m i x i n g d o m e s ti c a t e ds t r a i n sw i t hy 11 - 4 + x 2 + l 3 + j 6 a n di t ss t r a wd e g r a d a t i o ne f f i c n c yw a su pt o 4 5 7 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 5 t h ep h ，e n z y m ea c t i v i t y , m i c r o b i a ic o m p o s i t i o na n dt h eo fs t r a w - d e g r a d a t i o ne f f j ：i e m y w e r ed e t e r m i n e df o r14d a y st oi n v e s t i g a t et h es t a b i l i t yo ft h ec o m b i n e di n o c u ht h er e s u l t s s h o w e dt h a tp hk e p ts t a b l ed u r i n gt h ed e g r a d a t i o n t h ee n z y m ea c t i v i t ya n dt h ef u n g ia n 的u n t k e p ta tah i g hl e v e ld u r i n gc u l t u r e a n dt h eb a c t e r i aa m o u n ti n c r e a s e dg r a d u al l ya l lt h et i m eb y u s i n gt h em e t a b o l i t e s p r o d u c e db yf u n g id u r i n gt h es t r a wd e c o m p o s i n g b e c a u s eo ft h e s t a b i l i t yo f t h es t r a w - d e 繆a d a t i o n n o c u l aa b o v e ，t h es t r a wd e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yh a db e e na s t e a d yi n c r e a s e 6t h r o u g ht h es t r a wi n f l u e n c et h ec o u r s eo faf e w ，e a s yt om a n - r m d ec h a n g e si nt h e i n s p e c t i o no fan u m b e ro ff a c t o r st od e t e r m i n et h ed e g r a d a t i o no ft h es t r a wo ft h eb e s ti n i t i ai c o n d i t i o n s ：t h eb e s ti n o c u l u mc o n c e n t r a t i o no f4 ；i n i t i a ip hw a s5 o ；t h er e c r u i t m e n to fn a n dk p e rk i l o g r a ms t r a ww a s1 1 6ga n d1 2 6gt h er e s u l ts h o w e dt h a t t h ea d d i t i o no f pc o u l d p r o m o t et h es t r a wd e g r a d a t i o nw i t h i nm e a s u r e dc o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：s t r a wr e t u r n i n g ；s t r a w - d e g r a d a t i o n ；m u t a t i o nb r e e d i n g ；d o m e s t i c a t i o n ；s w a i n c o m b i n a t i o n 鄭重聲明 本人的學(xué)位論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立撰寫并完成的，學(xué)位論文沒有剽竊、抄襲等 違反學(xué)術(shù)道德、學(xué)術(shù)規(guī)范的侵權(quán)行為，否則，本人愿意承擔(dān)由此產(chǎn)生的一切法律責(zé)任和 法律后果，特此鄭重聲明。 學(xué)位論文儲拶一 2 0 0 9 年4 月2 0 日 學(xué)位論文使用授權(quán)聲明 本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭 州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論 文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的 全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文 和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論 文或成果時，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。 鄭州大學(xué)碩上學(xué)位論文 第一章文獻(xiàn)綜述 國內(nèi)外的研究及實踐均表明，土壤的基礎(chǔ)地力對作物產(chǎn)量影響很大，約6 5 的產(chǎn)量 取決于土壤地力，農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)國家堅持常年秸稈還田以保持和提高地力。作物秸稈還田可 以歸還作物秸稈帶走的養(yǎng)分，有利于更新土壤腐殖質(zhì)，維持土壤有機質(zhì)平衡，改善土壤 的理化性狀和作物的生長環(huán)境，改良因長期使用無機肥造成的土壤板結(jié)問題，達(dá)到培肥 地力的作用，已被日益廣泛提倡 1 - 3 1 ，成為緩解我國基礎(chǔ)地力下降的一個有效措施，同 時也是我國農(nóng)業(yè)走可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。 1 1 秸稈資源利用現(xiàn)狀 我國是一個農(nóng)業(yè)大國，據(jù)統(tǒng)計，每年的秸稈產(chǎn)量達(dá)到7 億多噸，占世界秸稈總產(chǎn)量 的2 0 0 o 3 0 0 o 4 j ，其中玉米秸稈占3 5 ，小麥秸稈占2 1 ，稻草占1 9 0 缸5 1 。傳統(tǒng)上秸稈主 要用作農(nóng)村的生活燃料，但是隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，農(nóng)村生活水平的提高，秸稈作為燃料逐 漸被其他燃料替代，秸稈過剩問題在農(nóng)村越來越突出，逐漸變成了無用的廢物，隨之就 出現(xiàn)了屢禁不止的秸稈就地焚燒問題，造成了資源的浪費和環(huán)境污染，鐵路、公路沿線、 飛機場附近的秸稈焚燒還影響交通和航班的正常運行。從根本上解決秸稈焚燒問題，必 須為秸稈利用找到出路。 除還田外，目前秸稈的利用方式主要有：制有機肥、生產(chǎn)飼料、食用菌培養(yǎng)基料、 用作能源等。秸稈作肥料具有腐熟周期短、產(chǎn)量高、易于機械化和產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點，但存 在優(yōu)良的秸稈降解菌種篩選困難，操作條件嚴(yán)格，設(shè)備成本和運行費用較高等問題【6 l ； 秸稈發(fā)酵作飼料具有能耗小、成本低等優(yōu)點，但秸稈有效能量、消化率均較低，應(yīng)用范 圍小，因而對秸稈的消耗量不大，尤其在畜牧業(yè)不發(fā)達(dá)地區(qū)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)解決不了農(nóng)村秸稈過 剩問題；用秸稈栽培食用菌投資小，見效快，技術(shù)要求不高，但在栽培技術(shù)上還比較陳 舊、傳統(tǒng)，還沒有取得突破，單產(chǎn)過低，應(yīng)用不廣；秸稈的能源化利用方式主要包括： 制乙醇、氣化及制沼氣等，但纖維乙醇在經(jīng)濟(jì)上仍處于需要國家財政扶持補貼才能實現(xiàn) 產(chǎn)業(yè)化的階段，離規(guī)?；瘧?yīng)用還有相當(dāng)長的距離，而秸稈氣化目前也僅處于實驗階段， 存在產(chǎn)氣率低、成本高、氣體凈化困難等問題，以秸稈為發(fā)酵原料產(chǎn)沼氣則存在秸稈降 解率低、投入產(chǎn)出效益差、池內(nèi)結(jié)殼、難出料等問題用。 此外，秸稈還有生產(chǎn)纖維素酶、制氫、生產(chǎn)木糖醇等方面的應(yīng)用，有的正處于實驗 階段，有的雖已小規(guī)模應(yīng)用，但還存在許多需要解決的問題【8 】。 以上各種利用方式均需要秸稈的收集，而作物秸稈具有能量密度小、分散度高、不 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 易收集和運輸、收集勞動強度大、集中收購成本較高。大規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，秸稈需要就 近處理，以節(jié)省勞力，秸稈直接還田，可使秸稈直接原位降解，省工省時，簡便易行， 實現(xiàn)土地利用的物質(zhì)平衡及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，備受關(guān)注。 1 2 秸稈還田研究概況 由于秸稈還田的短期經(jīng)濟(jì)效益不明顯，其他各種秸稈利用方式應(yīng)用也比較有限，農(nóng) 民為了圖方便，省事，往往對過剩的秸稈的處理方式是直接焚燒，焚燒秸稈不僅燒掉秸 稈本身所含的有機質(zhì)，而且還燒掉了土壤中的部分有機質(zhì)，劉天學(xué)研究表明，焚燒秸稈 使土壤有機質(zhì)含量減少1 6 5 6 ，同時秸稈焚燒對土壤微生物影響巨大，土壤中的細(xì)菌、 放線菌和真菌數(shù)量分別較焚燒前減少了8 5 9 5 、7 8 5 8 和8 7 2 8 ，此外，焚燒秸稈所 造成的土壤水分的蒸發(fā)及土壤結(jié)構(gòu)的破壞，也不利于土壤微生物的生存和作物的生長f 9 】。 隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的迅猛發(fā)展，化肥施入過多，有機肥使用過少，隨之而來的是環(huán)境惡化、 地下水硝酸鹽濃度升高，江河湖泊富營養(yǎng)化現(xiàn)象嚴(yán)重，以及逐漸嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降， 上述問題使國家和社會也越來越重視土地質(zhì)量及環(huán)境保護(hù)問題，秸稈還田的重要性逐漸 體現(xiàn)出來。 1 2 1 秸稈還田的方式 現(xiàn)在秸稈還田的主要方式分為直接還田和間接還田兩類。 秸稈直接還田，是把一定數(shù)量的秸稈直接耕翻入土。該技術(shù)又可分為機械粉碎還田、 覆蓋還田及整稈還田。其中機械粉碎還田應(yīng)用較廣，是一項高效、省時省工的有效措施， 這種方式n 、p 、k 的還田率高，但會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來不利影響：秸稈直接還田，需要3 年時間才能徹底腐爛分解，秸稈不能及時腐爛，土壤中氮素不足，使微生物與作物爭奪 氮素，結(jié)果導(dǎo)致秸稈分解緩慢，作物生長不良，另外還使播種后的種子不能充分接觸土 壤，阻礙種芽生長，影響發(fā)芽率，苗期作物也會因缺氮而黃化、苗弱，生長不良【1 0 1 。 間接還田技術(shù)包括堆漚還田、過腹還田、菇渣還田、沼渣還田及生化腐熟快速還田。 秸稈堆漚還田利用夏季高溫季節(jié)把秸稈堆積，采用厭氧發(fā)酵漚制，其特點是成本低廉， 但是時間長、受環(huán)境影響大，勞動強度高；過腹還田、沼渣還田及菇渣還田是一種效益 很高的秸稈利用方式，提高秸稈的經(jīng)濟(jì)價值，但由于種種原因兩者所消耗的秸稈量仍然 很有限；生化腐熟快速還田是利用生物技術(shù)，把秸稈快速轉(zhuǎn)化為有機肥，但需要把秸稈 先收集起來，費工費時，且優(yōu)良微生物復(fù)合菌種和化學(xué)制劑篩選困難，操作條件需嚴(yán)格 控制，秸稈需嚴(yán)格預(yù)處理，設(shè)備成本和運行費用較高【l l 】。 2 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 2 秸稈還田的影響 1 2 2 1 對土壤理化性質(zhì)的影響 秸稈還田可以提高土壤孔隙度和非毛管孔隙度，提高土壤團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體的含量， 降低土壤容重，起到疏松土壤、增強通透性等作用【2 _ 1 3 1 。還田后的秸稈，經(jīng)過微生物作 用與土壤中鈣、鎂粘結(jié)形成腐殖酸鈣和腐殖酸鎂，增加土壤中水穩(wěn)性團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成， 提高土壤蓄水保水能力。李紅、周連第等人經(jīng)過3 年池栽定位實驗表明，連續(xù)多年的小 麥、玉米桔稈還田可提高土壤對水分的保蓄能力，土壤含水量增加1 0 4 2 1 1 ，其中 以4 0c m - 6 0c m 土層的含水量增加最多【1 4 1 。王炎炳、趙聚寶、遲風(fēng)琴等人的研究表明， 秸稈還田可以使土壤孔隙度增加，土壤容重降低，土壤變疏松【1 5 】。還田的秸稈還可使土 粒的破裂系數(shù)降低，土壤微結(jié)構(gòu)系數(shù)增加，特征微團(tuán)聚體組成比例明顯下降，具有明顯 的改土作用i t 6 】。土壤物理性狀的改善使土壤通透性增強，提高了土壤的蓄水保肥能力， 有利于提高土壤溫度，促進(jìn)了土壤中微生物的活動和養(yǎng)分的分解與利用，有利于作物根 系的生長發(fā)育，促進(jìn)了根系的吸收活動。 秸稈還田可以通過促進(jìn)土壤有益微生物的生長，加速土壤物質(zhì)循環(huán)，改善養(yǎng)分供應(yīng) 狀況，補償土壤潛在肥力的消耗，達(dá)到培肥地力的作用【1 7 】。秸稈養(yǎng)分含量占整株的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)：n 為2 4 - 4 4 ，p 2 0 5 為2 5 0 0 - 3 0 ，k 2 0 為8 0 - 8 5 ，還田后能有效增加土壤養(yǎng) 分，培肥地力。統(tǒng)計全國6 0 份實驗結(jié)果，秸稈還田后全氮平均提高0 0 0 1 4 ，速效磷 平均提高3 7 6m g k g ，速效鉀平均增加3 1 2m g k g t l 8 】，其中鉀增加最多，我國是一個鉀 資源缺乏的國家，通過秸稈還田補充鉀資源意義重大。另外，秸稈在分解過程中產(chǎn)生的 有機酸等中間產(chǎn)物可使土壤中一些養(yǎng)分的有效性增加1 1 9 2 0 。 韓成偉、張巖等人研究國內(nèi)多份結(jié)果表明，秸稈還田后1 5 年，土壤有機質(zhì)可提高 0 0 8 0 2 9 ；張淑香等人連續(xù)1 2 年的秸稈還田實驗結(jié)果顯示，在還田的前5 年，土壤有 機質(zhì)增加幅度較大，但隨著秸稈還田年限的增加，有機質(zhì)達(dá)到一個平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，含 量提高幅度降低【2 l 】，因此推行秸稈還田五年，即可改善我國土壤有機質(zhì)狀況。 1 2 2 2 秸稈還田的生物學(xué)效應(yīng) 土壤酶活性的提高可以促進(jìn)土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分的有效化。研究表明，秸稈還 田能促進(jìn)真菌和細(xì)菌的大量繁殖，提高土壤中微生物的數(shù)量，同時給土壤酶提供了大量 作用底物，因而提高了土壤酶活性。研究顯示，秸稈還田使土壤的淀粉酶、蛋白酶、轉(zhuǎn) 化酶、蔗糖酶、磷酸酶等的活性得到了不同程度的提高1 2 2 。2 3 1 ，勞秀榮等5 年盆栽土培定 位實驗結(jié)果表明，土壤有機質(zhì)積累量，速效氮磷鉀的生物有效性，脲酶活性強度等指標(biāo) 與秸稈還田量呈極顯著正相關(guān)，長期秸稈還田并配施適量的化肥，是培肥地力，提高產(chǎn) 量的有效措施之一。 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 秸稈還田因其具有良好的土壤效應(yīng)、生物效應(yīng)和農(nóng)田效應(yīng)，故能提高作物產(chǎn)量，增 產(chǎn)增收，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)中國農(nóng)科院土肥所研究統(tǒng)計1 9 7 2 1 9 8 9 年期間1 2 9 次 秸稈還田實驗，作物平均增產(chǎn)4 - 9 ，其中，增產(chǎn)5 以上的占7 0 ，平產(chǎn)的占2 4 ， 減產(chǎn)5 以下的占6 2 4 1 。近來，中國1 0 0 多個5 年以上的定位實驗結(jié)果表明，與不還田 相比，秸稈還田平均增產(chǎn)率為1 2 8 t 2 5 1 。 1 2 2 3 秸稈還田存在的問題 秸稈還田雖然具有培肥地力等優(yōu)勢，但如果還田方式不當(dāng)，則秸稈不能充分腐解， 會影響播種質(zhì)量、出苗、苗期生長和作物產(chǎn)量。秸稈中c n 值較高，而微生物生長對c n 值的要求則在3 0 左右，所以秸稈在土壤中分解緩慢，且易造成微生物與作物爭氮，影 響苗期生長，進(jìn)而影響后期產(chǎn)量。美國在俄亥俄州和兩個實驗站進(jìn)行了8 年的秸稈還田 實驗，結(jié)果顯示，在俄亥俄州還田的玉米產(chǎn)量增加5 1 ，而在較干旱的堪薩斯州，秸稈 還田則造成了減產(chǎn)【2 6 】。德國東部1 9 5 8 - 1 9 6 2 年8 7 個實驗，平均增產(chǎn)5 ，未補加氮肥 的則出現(xiàn)減產(chǎn)【2 7 】。 秸稈還田后地溫升高，為作物生長提供良好條件的同時，也為某些病蟲害的發(fā)生和 流行創(chuàng)造了適宜條件，；如果還田后，秸稈不能快速降解，某些病菌在秸稈上滋生，從 而增加了病菌的數(shù)量，使病害率增加。趙子俊等人的實驗證明，秸稈覆蓋還田后玉米螟 和玉米黑粉病危害減輕，地下害蟲和玉米絲黑毯病加重。如果在較大面積上連續(xù)數(shù)年實 施該技術(shù)，這4 種病蟲均存在加重趨勢犯8 】。 在秸稈還田過程中補加秸稈降解菌劑，使秸稈在短期內(nèi)快速腐爛降解，有望解決秸 稈降解影響作物生長、病原菌借秸稈滋生等問題。 1 2 2 4 秸稈降解菌劑應(yīng)用現(xiàn)狀 秸稈快速降解菌劑是解決秸稈還田各種不利影響的有效方法，目前已有許多商品化 的秸稈降解菌劑應(yīng)用。國外如日本微生物學(xué)家島本覺也研發(fā)的酵素菌可直接用于秸稈肥 制作，達(dá)到秸稈還田目的，已在二十多個國家得到迅速推廣，酵素菌可用于堆漚秸稈腐 熟，對其它有機物具有很強的分解發(fā)酵能力，但對纖維素分解率也只有2 0 左右。國內(nèi) 秸稈腐解菌劑主要有中國科技開發(fā)院云南分院和云南省微生物研究所聯(lián)合研發(fā)的福貝 復(fù)合菌、恒隆態(tài)環(huán)保生物技術(shù)研究所研發(fā)的h m 菌種、北京中龍創(chuàng)科技有限公司開發(fā)生 產(chǎn)的“滿園春”生物發(fā)酵劑、廣東省高明市綠寶科技有限公司開發(fā)生產(chǎn)的腐稈靈，山東億 安生物工程有限公司研制的c m 菌等，這些菌劑可將各種作物秸稈等廢棄物快速變成有 機肥料，在秸稈制作有機肥方面得到了廣泛的應(yīng)用，但用于直接還田效果還不夠理想。 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)趙明文等人研究了纖維素降解菌劑對還田秸稈的催腐降解效果，實驗表 明，與不接種相比，經(jīng)3 4d ，秸稈分解率僅提高b 6 2 【2 9 1 ；金海洋研究表明水稻秸稈 還田中應(yīng)用維素素分解菌可以顯著降低水稻秸稈的強度，增加土壤轉(zhuǎn)化酶、脲酶、多酚 4 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 氧化酶和纖維索酶的活性，但其所用菌劑只能增加秸稈的降解率5 5 0 o - 1 0 7 0 d 3 0 】；謝柱 存和何偉松等人研究了3 種秸稈降解菌劑在秸稈還田上的應(yīng)用效果，3 種秸稈腐熟菌劑 對秸稈的催腐作用及對水稻產(chǎn)量的影響差異不明顯。溫從雨和王華良等人使用“瑞萊特” 牌微生物催腐劑進(jìn)行大田對比實驗，施用菌劑1 個月后，對比實驗兩處理秸稈腐熟狀況 均不明顯，水稻秸稈呈灰白色，手感有戮痛、無味、干燥【3 l 】。 總之，目前秸稈降解菌劑仍不能滿足秸稈直接還田的需要，高效秸稈降解菌劑還需 進(jìn)一步研究。 1 3 秸稈的組成及生物降解 秸稈是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的，它們互為伴生物，簡稱木質(zhì)纖維素。 半纖維素和木質(zhì)素通過共價鍵聯(lián)結(jié)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維素鑲嵌其中，要直接對纖維素進(jìn)行 糖化水解和生物轉(zhuǎn)化相當(dāng)困難。因此，要加快秸稈的降解就必須降低木質(zhì)纖維素的聚合 度、結(jié)晶度，破壞木質(zhì)素、半纖維素的結(jié)合層，脫去木質(zhì)素，增加有效比表面積，使纖 維素酶的可及度增加，才能達(dá)到對纖維素的降解，要想完成對秸稈的生物降解，所選生 物群體必須對這3 種組分都有一定的降解能力。 1 3 1 纖維素的結(jié)構(gòu)及生物降解 纖維素主要存在于植物的維管束組織中，它是由n 葡萄糖以p l ，4 葡萄糖苷鍵相 聯(lián)結(jié)而成的鏈狀高分子化合物。在植物細(xì)胞壁中，纖維素分子聚集成纖維絲，包埋在半 纖維素和木質(zhì)素中，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，性質(zhì)非常穩(wěn)定，不溶于水，無還原性，常溫下不發(fā) 生水解，在高溫下水解也很慢，只有在催化劑存在下，纖維素的水解反應(yīng)才顯著進(jìn)行【32 】 自然界中能降解纖維素的生物來源非常廣泛，軟體動物、昆蟲、原生動物、細(xì)菌、 真菌、放線菌等都能降解纖維素。能分解纖維素的微生物主要為真菌類及部分細(xì)菌當(dāng)中， 以木霉、曲霉、青霉的能力最突出，木霉中的綠色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、里氏木霉 ( t r i c h o d e r m ar e s s i e i ) 、康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i g g i ) 、擬康氏木霉( t r i c h o d e r m a p s e u d o k o n i n g i t ) 等又是其中比較著名的代表菌種，細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶量較低，且主要 為胞內(nèi)酶，主要有纖維桿菌屬( c e l l u l o m o n u # ) 、芽抱桿菌屬( n a c i l l u s ) 和梭狀芽孢桿菌 屬( c l o s t r i d i u m ) 等【3 3 】。國內(nèi)外眾多文獻(xiàn)報道的纖維素酶主要以霉菌產(chǎn)生的為主，對其中 的酶組分、性質(zhì)結(jié)構(gòu)及作用機理探討較為清楚。 微生物產(chǎn)生的纖維素降解酶系主要由3 類酶組成：內(nèi)切葡聚糖酶( c ，酶) ，外切葡聚 糖酶( c 。酶) ，p 葡萄糖苷酶( c 。酶) 。天然纖維素的降解需要三者的協(xié)同作用，內(nèi)切葡聚 糖酶主要作用于纖維素分子內(nèi)部的結(jié)晶區(qū)，隨機水解肛l ，4 糖苷鍵，將長鏈纖維素分子 截短，產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素，為外切葡聚糖酶及p 葡萄糖苷酶創(chuàng)造 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 酶切位點。外切葡聚糖酶( c 】) ，主要作用于纖維素線狀分子末端，水解肛l ，4 糖苷鍵， 每次切下一個纖維二糖分子，p - 葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子瞰，3 習(xí)。 1 3 2 半纖維素的結(jié)構(gòu)及生物降解 半纖維素是由不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，這些糖包括木糖、阿伯糖、甘露 糖和半乳糖等，其分子鏈比纖維素分子鏈要短，聚合度多數(shù)在2 0 0 以下 3 6 】。單糖聚合體 間分別以共價鍵、氫鍵、醚鍵和酯鍵連接，它們與伸展蛋白、其他結(jié)構(gòu)蛋白、纖維素和 果膠等構(gòu)成具有一定硬度和彈性的細(xì)胞壁。半纖維素的平均聚合度較小，以致使它很難 呈現(xiàn)線性，而是粉末狀，這樣就比纖維素更具備吸濕性和潤脹性，所以較容易水解。 大多數(shù)具有纖維素分解能力的絲狀真菌，都能分解半纖維素，并且具有較高的胞外 半纖維素酶活 3 r l ，但能分解半纖維素的微生物，并不一定具有降解纖維素的能力。半纖 維素降解菌中代表性菌株有纖維單孢菌、黑曲霉、焦曲霉、煙色曲霉、綠色木霉等【3 8 】 自然界中半纖維素微生物降解較快，在纖維素開始分解以前，一般已有較多的半纖維素 被分解消耗。但從分解的最終結(jié)果來看，纖維素基本上能完全分解，而半纖維素則往往 都會殘留一些抵抗性的難分解部分。 1 3 3 木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)及生物降解 木質(zhì)素是聚合的芳香醇構(gòu)成的一類物質(zhì)，存在于木質(zhì)組織中，位于纖維素、半纖維 之間，作用是通過形成交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來硬化細(xì)胞壁，并起抗壓作用。構(gòu)成木質(zhì)素的四種 醇單體分別是：對香豆醇、松柏醇、5 羥基松柏醇及芥子醇，這四種單體形成的一種復(fù) 雜酚類聚合物，其結(jié)構(gòu)單元通過碳碳鍵連接而成的三維空間高分子化合物，非常難于 降解p ，】。木質(zhì)素包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維等纖維束細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外填充于纖維素構(gòu) 架中增強植物的機械強度，利于輸導(dǎo)組織的水分運輸和抵抗不良外界環(huán)境的侵襲 4 0 , 4 q ， 影響纖維素和木質(zhì)素的水解。 木質(zhì)素的微生物降解過程，是一系列酶催化和非酶催化的非特異性的氧化還原過 程。已發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶主要有木質(zhì)素過氧化物酶( l i p ) 、錳過氧化物酶( m a p ) 和 漆酶( l a c ) 。l i p 和m n p 都是血紅素糖蛋白，需要在過氧化氫存在下進(jìn)行木質(zhì)素降解。 l i p 需以低濃度的過氧化氫作為氧化劑，經(jīng)過三個電子轉(zhuǎn)移步驟及一系列非酶步驟使甲 基化木質(zhì)素部分解聚【4 z 】。研究表明，木質(zhì)素不能作為微生物的唯一碳源，木質(zhì)素的降解 總是發(fā)生于次生代謝過程，能降解木質(zhì)素的微生物，也能降解纖維素和半纖維素【4 3 1 。在 木質(zhì)素微生物中，只有白腐菌能徹底分解木質(zhì)素為c o ：和水，而細(xì)菌和放線菌一般只能 部分地改變木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)，如脫甲基作用，木腐菌是木質(zhì)素降解研究的熱點，研究較 多的有軟腐細(xì)菌、變色真菌、軟腐真菌、白腐菌、褐腐菌m 】。 6 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 4 秸稈生物降解研究趨勢 由于纖維素微生物降解作用轉(zhuǎn)化纖維素具有廣闊的前景，以得到過量纖維素酶生產(chǎn) 為主要目的的纖維素酶基因克隆已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，現(xiàn)已到目前為止約4 5 0 個組分 的基因被克隆，但表達(dá)、分泌均較弱，并沒有構(gòu)建出能高效分解纖維素的“工程菌” 4 5 】， 因此這方面的研究還有待進(jìn)一步發(fā)展。 部分研究者開始從改變植物體本身去尋找纖維素降解纖維素的方法。美國密歇根大 學(xué)的研究人員通過對玉米基因進(jìn)行修飾，使玉米在其液泡內(nèi)產(chǎn)生降解酶，玉米在收割粉 碎后，液泡破裂，降解酶能夠?qū)?xì)胞壁進(jìn)行自我降解。已經(jīng)研究至第三代的斯巴達(dá)玉米 含有來自溫泉細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的單酶，及可以把半纖維素降解成雙糖分子的相關(guān)酶，同時又 帶有p 葡萄糖苷酶【4 6 】。該種基因改造方法對可以實現(xiàn)秸稈的自我降解，在秸稈還田上的 應(yīng)用潛力巨大，但是目前的研究還只是處于實驗室研究階段，玉米所攜帶的降解酶活性 還很有限，并且這種基因改造后的玉米對病蟲害的抵抗力可能會降低，雖然在植株被收 割粉碎以前，降解酶都被封鎖在細(xì)胞的液泡中，減少了對根、花粉和種子產(chǎn)生的不利影 響，但病蟲害一旦侵襲玉米，破壞玉米細(xì)胞內(nèi)液泡后，纖維素酶釋放出來，對玉米的破 壞可能是毀滅性的。 利用基因工程等高新技術(shù)降解秸稈具有比較誘人的前景，但是其利用也存在成本 高、安全性等方面還有許多限制性因素，目前仍處于實驗室研究階段。傳統(tǒng)的秸稈生物 降解方法仍有不少領(lǐng)域值得去嘗試和探索。隨著人類的不斷探索和研究的深入，相信在 不久的將來，一定會有更好的秸稈降解方法研究出來，可以實現(xiàn)秸稈的高效、低成本的 生物降解轉(zhuǎn)化，為秸稈資源的利用打開新的篇章。 1 5 課題的提出及意義 近年來的研究表明，非腐解有機質(zhì)能夠比腐解有機質(zhì)更能提高土壤生物活性【4 7 】，改 善土壤理化性狀，促使養(yǎng)分活化，因此非腐解的玉米秸稈較腐解的玉米秸稈對土壤有更 好的培肥作用 4 s ，4 9 1 。但簡單的直接還田，秸稈在自然條件下，腐解速度慢，大量還田后 會影響作物的生根和成活，還造成生產(chǎn)管理上的不便。 解決以上問題的有效方法是選育秸稈降解微生物菌劑，在機械化還田時配合使用， 使秸稈能在田間快速腐解，提高其腐解效率，使秸稈還田不影響下季作物的生長，又能 提高產(chǎn)量，必定有利于秸稈還田的順利推廣。目前有不少商業(yè)化秸稈降解菌劑，但降解 能力有限，主要用于秸稈堆肥的制作，在秸稈還田上的應(yīng)用效果還不夠理想。 秸稈的降解的過程也就是秸稈中纖維素、木質(zhì)素和半纖維素等物質(zhì)的酶解過程【s o 】 己有很多關(guān)于秸稈降解菌的報道多局限于其中一種物質(zhì)組分的降解。其中纖維素的研究 7 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 最多，但目前有關(guān)纖維素分解菌的研究普遍仍存在菌種酶活性不高，降解能力不強等問 題，且大部分是以純培養(yǎng)方法分離和篩選或者只是幾種菌的簡單組合，秸稈纖維素的降 解是多酶體系共同作用的結(jié)果，很少有一種微生物能分泌健全的降解酶系，所以純培養(yǎng) 物在保持纖維素分解能力上都存在一些問題，因此，高效纖維素降解菌的選育還有待進(jìn) 一步研究。近年在環(huán)境中的纖維素分解研究上，混合馴化菌系以其穩(wěn)定性和較強的適應(yīng) 能力，在秸稈降解菌的研究中逐漸得到重視【5 1 】。 但到目前為止，還未見到將馴化得到的混合菌系與纖維素降解菌、木質(zhì)素降解菌及 促生類酵母菌組配起來的報道。本課題首先通過大量的菌種篩選及秸稈降解菌系馴化工 作獲得大量的纖維素、木質(zhì)素降解菌及穩(wěn)定的秸稈降解馴化菌系，采用誘變育種提高纖 維素降解菌的性能，進(jìn)一步采用馴化菌系與菌種組合結(jié)合的方式，獲得既有穩(wěn)定性又有 高效降解能力的秸稈降解菌劑，為秸稈降解菌的選育做了進(jìn)一步的探索工作，并為秸稈 還田的順利推行提供了一定的技術(shù)支持。 1 6 技術(shù)路線 土壤、堆肥等 lj l l i 篩選單秸稈降 馴化復(fù)合菌系 解苗 lo li l 多代掏汰與 r 一1i r 一1 茵系復(fù)合 【l 一獵目j 【硼蓑，目j灑曲。土壤等 l li l 穩(wěn)定的 誘黼 酵母菌 馴化茵系 j i 。l i 組臺茵系 l 1 菌種穩(wěn)定性測定 i 最佳降解條件確定 lj 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 第二章纖維素降解菌的篩選 秸稈主要組分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中纖維素的結(jié)晶狀、不溶性的剛 性結(jié)構(gòu)造成了秸稈降解的天然抗性f s 2 】。因此高效纖維素降解菌的選育是解決秸稈生物降 解問題的關(guān)鍵。纖維素的降解是c x 酶( 內(nèi)切型葡聚糖酶) ，c 1 酶( 外切型葡聚糖酶) 和c b 酶( 1 3 - 葡萄糖苷酶) 等酶協(xié)同作用的結(jié)果【5 3 】，以往的研究一般只側(cè)重其中部分酶 活性的測定，難以全面了解菌種的降解酶系，往往存在酶組分比例不協(xié)調(diào)等問題【s ?！?，本 實驗嘗試以多種纖維素酶活性作為菌種的篩選指標(biāo)，以期找到酶活性較高，酶組分比例 協(xié)調(diào)的秸桿降解菌。與纖維素相比，半纖維素易于被生物降解利用，且降解纖維素的真 菌往往同時具有降解半纖維素的能力，因此，本實驗在測定菌種纖維素酶活性的同時， 也測定了菌種的半纖維素酶活性。 2 1 材料與方法 2 1 1 菌種來源 菜園土，森林土，稻田土，竹林土，朽木，麥田土，腐爛秸稈，牛糞堆肥。 2 1 2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：k 2 h p 0 42g ，烈h 4 ) 2 s 0 41 4g ，m g s 0 4 7 h 2 00 3g ，c a c l ：0 3g ，c 0 0 22 m g ，f e s 0 4 7 h 2 05 ，m g ，m n s 0 4 h 2 01 6m g ，z n s 0 4 1 7m g ，秸稈粉2 ，蒸餾水10 0 0m l ， 1 2 1 、0 1m p a 高壓滅菌3 0 m i n 。 剛果紅鑒別培養(yǎng)基：( n h 4 ) 2 s 0 42g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5g ，k h 2 p 0 41g ，n a c l0 5g ， c m c - n a2 0g ，剛果紅o 2g ，瓊脂2 0g ，蒸餾水l0 0 0m l ，自然p h 值，于1 2 1 、0 1m p a 下滅菌3 0 m i n 。 液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：秸稈粉與麩皮質(zhì)量比4 ：l 混勻，取2g 加入2 5 0m l 三角瓶，每瓶 再加入1 0 0m lm a n d e l s 營養(yǎng)液。自然p h 值，于1 2 1 、0 1m p a 下滅菌3 0r n i n 。 m a n d e l s 營養(yǎng)液：( n h 4 ) 2 s 0 41 4g ，k h 2 p 0 42g ，尿素0 3g ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3g ，c a c l 2 0 1 3g ，f e s 0 4 7 h 2 07 5 0m g ，m n s 0 4 h 2 02 5 0m g ，z n s o 42 0m g ，c o c l 23 0m g ，水10 0 0 m l 。 固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：秸稈粉與麩皮質(zhì)量比4 ：1 混勻，每克固體加入3m l 營養(yǎng)液，自 然p h ，每2 5 0m l 三角瓶裝入2 0g 培養(yǎng)基，1 2 1 、o 1m p a 下滅菌3 0m i n 。 9 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 秸稈降解率測定培養(yǎng)基：新鮮玉米秸稈晾干劈開成四瓣，剪成1c m 見方的塊，混 合均勻，1 0 5 烘干，稱取4g 加入1 5 0 m l 的三角瓶，每瓶再加入1 2m l 的營養(yǎng)液，混 合均勻，自然p h 值，于1 2 1 、0 1m p a 下滅菌3 0 m i n 。 營養(yǎng)液的配制：心h 4 ) 2 s 0 41 5g ，尿素3g ，蛋白胨3g ，c a c l 2o 1g ，m g s 0 4 7 h 2 05 0g ， k h 2 p 0 4lg ，n a c ! o 1g ，f c s 0 4 7 - 1 2 00 0 5g ，m n s 0 4 7 h 2 00 0 1 6g ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 1 4g ， c o c l 20 0 2g ，水l0 0 0m l ，自然p h 值。 菌種保藏培養(yǎng)基：真菌用p d a 培養(yǎng)基，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 2 1 3 菌種富集 稱取菌種來源樣品5g ，加入以秸稈為唯一碳源的1 0 0m l 富集培養(yǎng)基中，2 8 恒 溫震蕩培養(yǎng)7d ，吸取5m l 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的富集培養(yǎng)基，富集三代。 2 1 4 菌種初篩 取富集三代的培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，在剛果紅鑒別固體培養(yǎng)基上分離純化菌種，挑選對 剛果紅培養(yǎng)基脫色明顯的菌種斜面保存。 2 1 5 菌種復(fù)篩 液體產(chǎn)酶實驗。將初篩菌種分別接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，3 0 振蕩培養(yǎng)4d ，過濾得 酶液，測定各項酶活性。 固體產(chǎn)酶實驗：將初篩的菌種分別接入固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，3 0 靜置培養(yǎng)5d 后，每 瓶加5 0m l 蒸餾水搖勻后靜止浸提2h ，過濾得酶液，測定各項酶活性。 2 1 6 酶活性測定 ( 1 ) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7 支帶有1 5m l 刻度的試管，分別加入lg ，l 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，0 8 ， 1 0 ，1 2 ，1 4 ，1 6 m l ，補加蒸餾水至2 m l 搖勻，加入2 m l d n s 顯色劑，置于沸水浴 中煮沸1 0m i n ，取出置于冷水浴中冷卻，稀釋并定容至1 5m l 。在5 5 0n m 波長處測其 吸光度。 ( 2 ) 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7 支帶有1 5m l 刻度的試管，分別加入1g l 木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ，0 8 ，1 0 ， 1 2m l ，補加蒸餾水至2m l 搖勻，保溫5 0m i n ，加入2m l d n s 顯色劑，置于沸水中煮 沸1 0m i n ，取出置于冷水浴中冷卻，稀釋并定容至1 5m l 。在5 5 0r i m 波長處測定吸光 度。 1 0 鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 ( 3 ) 酶活性測定 采用d n s 還原糖法測定各纖維素酶活性。 纖維素酶活性：1m l 酶液于5 0 ，p h4 8 條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1p g 還原 糖( 以葡萄糖計) 。的酶量即為1 個酶活力單位【5 5 】。 半纖維素酶活：1m l 酶液于5 0 ，p h4 8 條件下，每分鐘分解】木聚糖溶液產(chǎn) 生lp g 木糖的酶量即為一個半纖維素酶活力單位【5 6 】 f p a 活力單位的測定：取兩支2 5m l 刻度的試管，各加0 2m l 酶液，再加p h4 8 醋酸緩沖液1 8m l 。測定管加入l x 6c m 濾紙條，充分浸泡置5 0 恒溫水浴6 0m i n ，空 白管同時置5 0 士o 5 恒溫水浴6 0m i n 。然后分別加入d n s 顯色液2m l ，空白管同時加 1 x 6c m 濾紙條。沸水浴1 0m i n ，冷卻后加水至1 5m l ，以空白管調(diào)零點，在5 5 0n m 測 o d 值。 c 。活力單位的測定：取兩支2 5m l 刻度的試管，各加o 2m l 酶液。測定管加1 8m l c m c ( 1 ) ，另空白