現(xiàn)代儀器分析__論文.doc

儀器分析 結(jié)課論課題：高效液相色譜法研究系別：生物工程系專業(yè)：生物制藥技術(shù)班級(jí)：制藥1432班學(xué)號(hào)：201407043240姓名：高慧芳指導(dǎo)老師：王紹良高效液相色譜法研究摘要：高效液相色譜法，也稱高壓液相色譜法。它是在經(jīng)典的液相柱色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展而成的一種高效、快速、高靈敏的色譜分離方法。根據(jù)柱內(nèi)填料的不同及不同的分離機(jī)制，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜及凝膠色譜。由于采用了高效填充劑，并配以高壓輸液泵、高靈敏檢測(cè)器、自動(dòng)記錄裝置及自動(dòng)收集裝置，使高效液相色譜法的分離速度及效率均大大提高，更趨于儀器化、自動(dòng)化，且使用范圍廣。制備型的HPLC能大量分離制備較純的樣品。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，HPLC與質(zhì)譜、核磁共振譜、紅外光譜等波譜技術(shù)的聯(lián)用進(jìn)展加快。關(guān)鍵字：液相色譜；分類；應(yīng)用背景：1903年俄國(guó)植物化學(xué)家茨維特首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。茨維特使用色譜法 chromatography來(lái)描述他的彩色試驗(yàn)。他在論文中寫(xiě)到：植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖?！币?、高效液相色譜法分類根據(jù)分離機(jī)理可分為：吸附色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜、大小排阻（凝膠）色譜、液-液分配色譜法 。1、吸附色譜分離吸附色譜法是當(dāng)組分分子流經(jīng)固定相（吸附劑，如硅膠或氧化鋁）時(shí)，不同組分分子、流動(dòng)相分子就要對(duì)吸附劑表面的活性中心展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)。這種競(jìng)爭(zhēng)能力的大小，決定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。2、鍵合相色譜分離鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中的固定液的液體，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜。若采用極性鍵合相、非極性流動(dòng)相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相、極性流動(dòng)相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。3、離子交換色譜分離離子交換色譜法是流動(dòng)相中的被分離離子，與作為固定相的離子交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)，它們對(duì)交換劑的基體離子親和力大小的不同而達(dá)到分離的。組分離子對(duì)交換劑基體離子親和力越大，保留時(shí)間就越長(zhǎng)。4、大小排阻色譜分離大小排阻色譜法的固定相是一類孔徑大小有一定范圍的多孔材料。被分離的分子大小不同，它們擴(kuò)散滲入多孔材料的容易程度不同。小分子最易擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)孔中，保留時(shí)間最長(zhǎng)；大分子完全排斥在孔外，隨流動(dòng)相很快流出，保留時(shí)間最短。5、液-液分配色譜法 分離液-液分配色譜的固定相和流動(dòng)相是互不相溶的兩種溶劑,分離時(shí),組分溶入兩相,不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離.目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上而制成的,使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法(簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋.鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位,是應(yīng)用最廣的色譜法.按照固定相和流動(dòng)相極性的不同,分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類. 二、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介高效液相色譜儀主要由：輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。1、輸液泵 ：高效液相色譜的流動(dòng)相采用高壓泵輸送,有不同類型的輸液泵,按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵.目前使用較多的是柱塞式往復(fù)泵。2、進(jìn)樣器 ：進(jìn)樣器是將試樣送入色譜柱的裝置.一般要求進(jìn)樣裝置的密封性好,死體積小,重復(fù)性好,保證中心進(jìn)樣,進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力,流量影響小。 3、色譜柱 ： 色譜柱是色譜分離的核心.為了保證色譜柱的柱效高,使用壽命長(zhǎng),一般使用由專業(yè)化工廠生產(chǎn)的商品柱.色譜柱管多由不銹鋼制成,內(nèi)裝一定的固定相.色譜往長(zhǎng)一般1030cm,內(nèi)徑25mm. 化學(xué)鍵合相是廣泛使用的固定相,其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠的應(yīng)用最為廣泛。 4、檢測(cè)器 ：樣品經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢側(cè)器進(jìn)行檢測(cè).按其適用范圍檢測(cè)器可分為通用型和專屬型兩大類,專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì),紫外檢測(cè)器(UVD),熒光檢測(cè)器(ED)屬于這一類,它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng);通用型檢測(cè)器檢測(cè)的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),示差折光檢測(cè)器(RID),蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質(zhì)譜作為高效液相色譜的檢測(cè)器。5、數(shù)據(jù)記錄處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng) :現(xiàn)代HPLC的特征是用微機(jī)控制儀器.HPLC儀器的中心計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng),即能做數(shù)據(jù)采集和分析工作,又能程序控制儀器的各個(gè)部件,還能在分析一個(gè)試樣之后自動(dòng)改變條件而進(jìn)行下一個(gè)試樣的分析,許多色譜儀的軟件系統(tǒng)具有方法認(rèn)證功能,使分析工作更加規(guī)范化. 三、高效液相色譜的特點(diǎn)高壓壓力可達(dá)150300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。高速流速為0.110.0 mL/min。高效塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。 四、高效液相色譜法的應(yīng)用1.在鑒別中的應(yīng)用 在HPLC法中,保留時(shí)間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān),是定性的參數(shù),可用于藥物的鑒別.如中國(guó)藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項(xiàng)下規(guī)定:在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品主峰的保留時(shí)間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進(jìn)行鑒別。 2.在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用 HPLC分離效能高,靈敏,在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛.主要用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查?！坝嘘P(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料,中間體,副產(chǎn)物,降解產(chǎn)物等物質(zhì),這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似,含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測(cè).若雜質(zhì)是已知的,又有雜質(zhì)的對(duì)照品,可用雜質(zhì)對(duì)照品做對(duì)照進(jìn)行檢查.若雜質(zhì)是未知的,可以采用主成分自身對(duì)照法或峰面積歸一化法進(jìn)行檢查。 3.在含量測(cè)定中的應(yīng)用 用高效液相色譜法側(cè)定含量可以消除藥物中的雜質(zhì),制劑中的附加劑及共存的藥物對(duì)測(cè)定的干擾.中藥材及其制劑組成復(fù)雜,基中不少有效成分的含量測(cè)定也越來(lái)越多地采用了高效液相色譜法。五、高效液相色譜法測(cè)定VE含量1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1 了解高效液相色譜儀的基本操作；1.2 了解高效液相色譜儀測(cè)定VE的原理。2 實(shí)驗(yàn)原理高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。VE（維生素E）又名生育酚或產(chǎn)妊酚，在食油、水果、蔬菜及糧食中均存在。有抗氧化作用，能增強(qiáng)皮膚毛細(xì)血管抵抗力，并維持正常通透性；有改善血液循環(huán)及調(diào)整生育功能、抗衰老作用等。VE通過(guò)高效液相色譜柱進(jìn)行分離，PDA檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。3實(shí)驗(yàn)器材3.1 實(shí)驗(yàn)樣品VE樣品溶液3.2 實(shí)驗(yàn)試劑濃度為50g/ml的VE標(biāo)樣3.3 實(shí)驗(yàn)儀器高效液相色譜儀附PDA檢測(cè)器4 色譜條件色譜柱：C18柱； 流動(dòng)相速度：0.3ml/min；進(jìn)樣量：5l； 柱溫：30。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)采用的是單點(diǎn)法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1. 液相色譜儀測(cè)定蘋(píng)果的VE含量進(jìn)樣量保留時(shí)間峰面積標(biāo)樣5l3.59min42217待測(cè)樣品5l3.59min17369樣品中VE的濃度=乙烯標(biāo)樣的總量蘋(píng)果的峰面積/乙烯標(biāo)樣的峰面積=標(biāo)樣進(jìn)樣量標(biāo)樣中VE的濃度樣品峰面積樣品進(jìn)樣量標(biāo)樣峰面積=5l50g/mL17369/（5l42217）=20.57g/mL5.2 實(shí)驗(yàn)討論本次實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定標(biāo)樣溶液VE含量時(shí)，在指定的保留時(shí)間內(nèi)并未出峰。討論分析原因：樣品溶液在上周實(shí)驗(yàn)后，一直置于離心管中，未避光低溫保存，導(dǎo)致樣品中VE氧化，液相測(cè)定時(shí)沒(méi)有在相應(yīng)的時(shí)間出峰。本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，且主要目的是了解高效液相色譜儀的基本操作，以及液相色譜儀測(cè)定VE的原理，故結(jié)合前組同學(xué)對(duì)VE含量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行討論與分析。因時(shí)間有限，實(shí)驗(yàn)采用了單點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)量分析，且無(wú)平行重復(fù)，這樣誤差較大。我們以后實(shí)驗(yàn)時(shí)，VE標(biāo)樣可以選擇5個(gè)濃度，每個(gè)濃度分別測(cè)定3-4次，取其峰面積的平均值后作標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣誤差更小。六.應(yīng)用前景展望液相色譜分析是指流動(dòng)相為液體的色譜技術(shù),是色譜法中最古老的一種,但通過(guò)改進(jìn)填料的粒度及柱壓,在經(jīng)典的液相柱色譜的基礎(chǔ)上引入了氣相色譜的塔板理論,在技術(shù)上采用了高壓輸液泵,高效固定相和高靈敏度的檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)了分析速度快.分離效率高和操作自動(dòng)化,這種色譜技術(shù)被稱為高效液相色譜法。它出現(xiàn)不過(guò)三十多年的時(shí)間，但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器結(jié)構(gòu)和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、恒溫器、記錄儀等主要部件。 高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲(chóng)劑、除莠劑的分析等物質(zhì)的分析。 對(duì)于高效液相色譜的發(fā)展前景應(yīng)該是非常樂(lè)觀的，現(xiàn)在的社會(huì)的發(fā)展節(jié)奏很快，各個(gè)領(lǐng)域?qū)τ诜治鰴z驗(yàn)的需求很多，而分析檢驗(yàn)中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成 化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。所以她的發(fā)展情景很樂(lè)觀。理由有幾點(diǎn)1， 隨著科技的發(fā)展，技術(shù)的日臻完善，較之以前色譜分析的方法有了很大程度的提高，很多科學(xué)家在對(duì)于一些分析上的難點(diǎn)有了新的突破，這樣一個(gè)不斷完善的技術(shù)在以后的社會(huì)發(fā)展中一定會(huì)扮演著一個(gè)重要的角色。 2， 最近,一些先進(jìn)的檢測(cè)儀器成功的用在了高效液相色譜分析法上,使得高效液相色譜的應(yīng)用更廣泛,并充分利用高效快速.選擇性好.靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),建