環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-11環(huán)科.doc

環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)專業(yè)：環(huán)境科學(xué)時(shí)間：二零零九年九月環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)一、課程簡(jiǎn)介 環(huán)境生物學(xué)是環(huán)境科學(xué)專業(yè)開設(shè)的一門重要的專業(yè)必修課。通過本課程的學(xué)習(xí)，了解生物與環(huán)境之間的相互作用及其關(guān)系，生物在環(huán)境監(jiān)測(cè)、環(huán)境評(píng)價(jià)、環(huán)境修復(fù)中的作用以及環(huán)境污染物的生物降解與轉(zhuǎn)化規(guī)律，生物技術(shù)在環(huán)境治理中的應(yīng)用等有關(guān)基本知識(shí)。 系統(tǒng)地掌握環(huán)境生物學(xué)的基本理論、基本知識(shí)和基本技能。 二、課程實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?1 、目的：通過實(shí)踐操作，印證和鞏固課堂教學(xué)中學(xué)到的環(huán)境生物學(xué)的理論知識(shí)，學(xué)會(huì)實(shí)地觀察的技術(shù)，培養(yǎng)進(jìn)行科學(xué)工作的能力，養(yǎng)成實(shí)事求是的工作作風(fēng)和解決實(shí)際問題的能力。 2 、要求： 要求學(xué)生能夠正確使用實(shí)驗(yàn)室的基本儀器設(shè)備，掌握環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作技術(shù)，并能夠客觀地對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察、描述、比較、分析和綜合。 三、考試（考核）方式 ： 以考核方式進(jìn)行，要求學(xué)生獨(dú)立完成每個(gè)實(shí)驗(yàn)并提交報(bào)告，并用百分制記分，然后求平均分 = 總分 / 實(shí)驗(yàn)次數(shù)。其實(shí)驗(yàn)成績(jī)占課程總評(píng)成績(jī)的 30% 。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在課程考試中占 30% 。 四：主要儀器：光學(xué)顯微鏡（含有關(guān)配件）50 臺(tái)，超凈工作臺(tái)4臺(tái)，高壓蒸氣滅菌鍋2只，烘箱、恒溫培養(yǎng)箱各3臺(tái)，電爐 10 只，酒精燈、載玻片、接種環(huán)（針）、培養(yǎng)皿、試管、移液管、錐形瓶 等若干 。 五、主要參考書目： 1 孔繁翔，環(huán)境生物學(xué)，南京：南京大學(xué)出版社。 2 王家玲，環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，北京：高等教育出版社。3 程樹培，環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南，南京：南京大學(xué)出版社。 實(shí)驗(yàn)一 有毒物質(zhì)對(duì)水生生物的影響或急性毒性實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)）農(nóng)藥是一類特殊化學(xué)品。農(nóng)藥引起的環(huán)境污染和對(duì)生物的影響日益突出。在施用過程中,僅有1 %左右的農(nóng)藥作用于靶生物，其余的或殘留于土壤,或通過間接途徑進(jìn)入水環(huán)境，從而影響土壤生物和水生生物。水環(huán)境中的農(nóng)藥可通過食物鏈途徑逐級(jí)濃縮，從而導(dǎo)致對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的危害，甚至可最終危害人類健康。農(nóng)藥對(duì)水生生物的毒性是農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和管理的重要參數(shù)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容百草枯、草甘膦、敵殺死和樂果是目前我國(guó)廣泛施用的除草劑和高效殺蟲劑。本實(shí)驗(yàn)采用急性毒性實(shí)驗(yàn)來研究農(nóng)藥對(duì)水生生物的影響。二、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體長(zhǎng)約58cm的鯽魚；實(shí)驗(yàn)藥品：草甘膦實(shí)驗(yàn)儀器：塑料桶（容量約10L）；容量瓶（100ml）；移液管；燒杯（250ml）；三、實(shí)驗(yàn)方法步驟(一)急性毒性試驗(yàn)的一般程序 1急性試驗(yàn)劑量分組 (1)先查閱文獻(xiàn)，找出與受試化學(xué)物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化合物的毒性資料，并以其相同生物種類和相同染毒途徑得出LD50(LC50)值作為受試物的預(yù)期毒性中值。 (2)以此LD50(LC50)為待測(cè)化合物的中間劑量組，再上下以3倍之差的劑量各推12個(gè)劑量組做預(yù)試驗(yàn)，求出生物全活、全死劑量。 (3)在預(yù)試驗(yàn)的全活全死劑量之間設(shè)56個(gè)劑量組，一般的各組間距按1.21.5等比級(jí)數(shù)設(shè)計(jì)。 2選用適宜的染毒方式染毒，觀察兩周內(nèi)的死亡情況。 3癥狀觀察：LD50值并不能充分說明受試化合物的急性毒性，因此應(yīng)詳細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸不同劑量外源化合物后的中毒癥狀、發(fā)生和發(fā)展過程及規(guī)律，死亡前癥狀特點(diǎn)、死亡時(shí)間等。一般常見的中毒癥狀有興奮現(xiàn)象、抑制現(xiàn)象。 4剖檢死亡和瀕死動(dòng)物及部分存活動(dòng)物，做大體病理解剖檢查。 5計(jì)算LD50(LC50)，及其標(biāo)準(zhǔn)法。通常采用寇氏法和幾率單位法。6根據(jù)所得結(jié)果，按相關(guān)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)定其毒性大小，如急性毒性作用帶愈小，則引起死亡的危險(xiǎn)性就愈大，反之，則愈?。籐D50值愈小，毒性愈大。(二)本實(shí)驗(yàn)方法步驟1、農(nóng)藥的配制：母液稀釋法（二次稀釋法）即先用少量的水把農(nóng)藥稀釋，配成母液，再用大量的水把母液稀釋成所需濃度。這樣配出的藥液高效又穩(wěn)定！2、劑量分組按水生生物急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。每種農(nóng)藥設(shè)67 個(gè)試驗(yàn)濃度組,并同時(shí)設(shè)一對(duì)照組。每組5-6條魚。3、實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)用魚體長(zhǎng)約5-8cm，選擇行動(dòng)活潑、體色光澤完整的健康魚；實(shí)驗(yàn)容器采用塑料桶，盛水量以每尾魚1-2L水為宜，水的pH值為6.7-8.5，水溫為室溫；水中的溶解氧不應(yīng)低于4mg/L，用放置3天以上的自來水；試驗(yàn)期間的光暗比為1212，溫度23 1 。4、LD50計(jì)算方法：直線內(nèi)插法四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、實(shí)驗(yàn)方法步驟3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（觀察結(jié)果并計(jì)算LD50）并分析試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)二 不同類型水體中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)及水質(zhì)量評(píng)價(jià)（4學(xué)時(shí)）水中細(xì)菌總數(shù)往往同水體受有機(jī)物污染的程度呈正相關(guān)。因此，它是評(píng)價(jià)水質(zhì)污染程度的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)平皿法對(duì)水樣中細(xì)菌作計(jì)數(shù)，這是測(cè)定水中好氧和兼性厭氧異養(yǎng)細(xì)菌密度的方法。由于細(xì)菌在水體中能以單獨(dú)個(gè)體、成對(duì)、鏈狀、成簇或成團(tuán)的形式存在，此外沒有單獨(dú)的一種培養(yǎng)基或其一環(huán)境條件能滿足個(gè)水樣中所有細(xì)菌的生理要求，所以由此法所得的菌落數(shù)實(shí)際上要低于被測(cè)水樣中真正存在的活細(xì)菌的數(shù)目。細(xì)菌總數(shù)是指1mL水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3724h培養(yǎng)后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。一般規(guī)定，1mL自來水的總菌數(shù)不得超過100個(gè)。 水污染的細(xì)菌學(xué)指標(biāo)：飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌總數(shù)100個(gè)/mL大腸菌群3個(gè)/L 水質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)評(píng)價(jià)細(xì)菌總數(shù)(/mL)極清潔水10100個(gè)清潔水1001000個(gè)不太清潔水100010000個(gè)不清潔水10000100000個(gè)極不清潔水多于100000個(gè)一、目的和內(nèi)容了解并掌握水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法。二、材料和器皿()固體培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌）牛肉膏3g；蛋白胨5g；氯化鈉10g；瓊脂1520g； pH7.07.2；水1000ml硫代硫酸鈉(二)無菌采樣瓶，滅菌移液管，滅菌培養(yǎng)皿，盛有4.5mL滅菌蒸餾水的試管，高壓滅菌鍋，廢舊報(bào)紙，放大鏡。 三、方法和步驟 (一)采集水樣：注意采集水樣的代表性和數(shù)量，詳見第四章。 水樣采集與保存：要求按無菌操作進(jìn)行采樣，全過程不受污染采樣自來水：先用酒精燈將龍頭滅菌水龍頭完全打開放水?dāng)?shù)分鐘(排除管道內(nèi)積存的死水)采集水樣(如水樣中含有余氯，要采取相應(yīng)措施消除氯，即3%硫代硫酸鈉1ml/500ml)江、河、湖、塘、水庫(kù)等處水：先將采樣瓶滅菌將采水器在距水面1015cm深處取樣。采樣后，采樣瓶?jī)?nèi)的水面與瓶塞底部應(yīng)留有一些空隙，以便在檢驗(yàn)時(shí)可充分搖動(dòng)，混勻水樣。保存立即檢驗(yàn)：一般從取樣到檢驗(yàn)不應(yīng)超過2h保證原水中細(xì)菌不起變化。不能立即檢驗(yàn)：可在15下冷藏保存，不得超過6h(二)吸取0.5ml水樣(河水、污水、游泳池水或港灣水等)，注入盛有4.5ml無菌水的試管中，混勻成10-1稀釋液，注意在吸水樣前，水樣及稀釋水應(yīng)徹底攪動(dòng)均勻。(三)吸稀釋液0.5ml按10倍稀釋法稀釋成10-2、10-3、10-4等連續(xù)的稀釋度（圖21）。 (四)根據(jù)水樣的潔凈程度，污染嚴(yán)重者選取10-2、10-3、10-4三個(gè)連續(xù)稀釋度，中等的選取10-1、10-2、10-3三個(gè)連續(xù)稀釋度。稀釋度的選擇是本試驗(yàn)精確度的關(guān)鍵，選擇適宜者，平皿上菌落總數(shù)介于30和300之間。(五)吸取由高倍至低倍的稀釋液，每個(gè)稀釋液分別注入兩個(gè)培養(yǎng)皿，每皿1ml。(六)注入徹底融化，然后冷卻到45的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于河水樣）約15ml，立即旋搖培養(yǎng)皿，充分混勻。方法是握住平皿，先往一個(gè)方向畫圓，再朝相反方向回轉(zhuǎn)；或一面畫圓，一面適當(dāng)傾斜。小心勿使這個(gè)混合液體濺到培養(yǎng)皿的邊緣。讓平皿培養(yǎng)基于水平位置放置至固化。 (七)接種河水樣的培養(yǎng)皿，倒置于37培養(yǎng)24h，接種海水樣、港灣水樣的培養(yǎng)皿，應(yīng)倒置后于1820下培養(yǎng)到長(zhǎng)出明顯菌落(5天左右)。l 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)過程中的質(zhì)量控制（1） 檢驗(yàn)中所用的一切用品必須是完全滅菌的。在滅菌前應(yīng)徹底洗滌干凈，121高壓蒸汽滅菌20min，或160干烤2h。培養(yǎng)基和稀釋液按規(guī)定要求進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。（2） 同時(shí)各接種空白樣品、同一稀釋度平行樣品和不同稀釋度的幾個(gè)平板平皿作對(duì)照。（3） 水樣稀釋時(shí)應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液混入其中。（4） 將水樣注入皿內(nèi)時(shí)，從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋，最后將吸管直立使水流空，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。（5） 為防止產(chǎn)生片狀菌落，水樣加入平皿后，在20min內(nèi)向皿內(nèi)傾入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即混合均勻。（6） 皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要放置長(zhǎng)久后才翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，而應(yīng)于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)將平皿翻轉(zhuǎn)進(jìn)行培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長(zhǎng)。圖2-1 菌液逐級(jí)稀釋過程示意圖 四、結(jié)果與分析 (一)菌落計(jì)算原則平皿菌落的計(jì)算可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，防止遺漏，也可借助于菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。對(duì)那些看來相似，并且長(zhǎng)得相當(dāng)接近，但并不相觸的菌落，只要它們之間的距離至少相當(dāng)于最小菌落的直徑，便應(yīng)該一一予以計(jì)數(shù)。對(duì)鏈狀菌落看來似乎是由于一團(tuán)細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基和水樣的混合中被崩解所致，應(yīng)把這樣的一條鏈當(dāng)做一個(gè)菌落來計(jì)數(shù)，不可去數(shù)鏈上各個(gè)單的菌鏈。若同個(gè)稀釋度中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平皿計(jì)數(shù)該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落少于平皿的一半時(shí)，而另半中菌落分布又均勻，則可將其菌落數(shù)的2倍作為全皿的數(shù)目。在記下各平皿菌落數(shù)后，應(yīng)算出同一稀釋度的平均菌數(shù)，供下步計(jì)算時(shí)用。 (二)計(jì)算方法l、首先選擇平均菌落效在30300者進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即可用它作為平均值乘其稀釋倍數(shù)。2、若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)都在30300之間，則應(yīng)按兩者的比值來決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)；若大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字。3、如果所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。4、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。5、如果全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表2l)。6、菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落在100以內(nèi)時(shí)按實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字；在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來表示。在所需報(bào)告的菌落數(shù)多至無法計(jì)算時(shí)，應(yīng)注明水樣的稀釋倍數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、闡述細(xì)菌計(jì)數(shù)原則。2、報(bào)告樣品中細(xì)菌總數(shù)。表21 稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（個(gè)/ml）報(bào)告方式（個(gè)/ml）10-110-210-311360164201640016000或1.610422760295461.63775038000或3.810432890271602.22710027000或2.71044無法計(jì)數(shù)4651513513000510000或5.1105527115270270或2.71026無法計(jì)數(shù)305123050031000或3.1104實(shí)驗(yàn)三 植物種子在不同濃度重金屬溶液中萌發(fā)率的變化（4學(xué)時(shí)）1 實(shí)驗(yàn)原理用不同濃度重金屬溶液培養(yǎng)植物種子，研究重金屬對(duì)植物種子萌發(fā)的影響，了解和掌握植物的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率進(jìn)行的毒性實(shí)驗(yàn)的具體方法及毒物對(duì)植物發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率的影響；通過植物種子發(fā)芽毒性試驗(yàn)，了解重金屬對(duì)植物種子的毒性效應(yīng)，監(jiān)測(cè)水體污染程度以及評(píng)價(jià)水體的使用價(jià)值，為早期預(yù)報(bào)重金屬對(duì)植物的毒害，為環(huán)境監(jiān)測(cè)中評(píng)價(jià)重金屬污染程度提供理論依據(jù)。2 材料與方法（1） 材料和器材 植物種子（水稻，小麥，白菜，玉米，黃瓜等）；分析純醋酸鉛；硫酸銅，蒸餾水；培養(yǎng)皿；濾紙；尺子；恒溫光照培養(yǎng)箱，溫度設(shè)定為25。（2） 方法 在一定溫度、濕度和光照條件下，用濾紙做發(fā)芽床，分別在第3天和第7天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。3 實(shí)驗(yàn)步驟（1）挑選籽粒飽滿、大小一致的植物種子300粒，隨機(jī)分成6組，每組50粒。取6只培養(yǎng)皿，鋪上2層濾紙，分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6。（2）用蒸餾水將重金屬溶液逐級(jí)稀釋為為不用濃度（查閱文獻(xiàn)資料，不同植物種子，不同重金屬濃度不同），稀釋過程中pH值的變化可不作考慮，獲得5種不同濃度的污染液。（3）向1、2、3、4、5號(hào)培養(yǎng)皿加入5ml的不同濃度重金屬污染液（浸濕濾紙即可），6號(hào)培養(yǎng)皿加入等體積的蒸餾水作為對(duì)照。作3次重復(fù)。（4）在每只培養(yǎng)皿的濾紙上，均勻放置50粒水稻種子。（5）將6只培養(yǎng)皿置于25、相對(duì)濕度75%、光照條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組補(bǔ)充適量蒸餾水，以保持濾紙的濕潤(rùn)。（6）萌發(fā)率的計(jì)算，