免疫組化非特異性染色的消除方法.doc

免疫組化非特異性染色的消除方法一、非特異性染色的主要因素 組織的非特異性染色的機(jī)理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點(diǎn)： （1）一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去 。 （2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。 （3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。 （4）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。 （5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。 （6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?二、消除非特異性染色的方法 消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒?，常用的方法有以下幾種： （一）動(dòng)物臟器粉末吸收法 常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動(dòng)2h，4中過夜，再攪拌10min，高速離心（300015000r/min）30min，12次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進(jìn)行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時(shí)可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（300015000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進(jìn)行吸收，以免消耗過多的抗體。 肝粉或新鮮細(xì)胞吸收是一種非特異性的消除方法，對(duì)熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時(shí)，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。 用臟器肝粉吸收對(duì)熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗23次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達(dá)到目的，京極方久氏認(rèn)為這樣吸收對(duì)熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時(shí)有必要再吸收一次。 【肝粉的制法】 （1）將若干只小白鼠或大白鼠放血?dú)⑺?，取出肝臟，用生理鹽水洗23次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。 （2）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機(jī)或勻漿器作成勻漿。 （3）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用23倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15 min后，再除去上清液。 （4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37烤干（過夜）。 （5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。 （二）透析法 熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。 （1）將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。 （2）浸入0.02mol/pH 7.17.4的PBS中（懸于大于標(biāo)記物體積約50100倍的PBS內(nèi)），在4中透析，每日更換34次PBS，約57天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。 （三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法 除游離熒光素可用246cm柱層析法，詳細(xì)方法參閱第二章。加入熒光抗體1518ml（按床體積的5%10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時(shí)，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留3040min ，使游離熒光充分進(jìn)入細(xì)篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測(cè)F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測(cè)定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。 若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時(shí)即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時(shí)，即進(jìn)行收集，之后出現(xiàn)SO4+（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。最后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4+及NH4+后可再用。 如僅用小量熒光抗體，可用120cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾23.5ml熒光抗體。 （四）DEAE纖維素柱層析法 標(biāo)記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換2050mg標(biāo)記蛋白量為宜 。常用梯度洗脫法如下： （1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標(biāo)記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強(qiáng)度洗脫液， 分別洗脫和收集： 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）洗脫部分1。 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）洗脫部分2。 0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）洗脫部分3。 將此三部分收集液（每管5ml）分別測(cè)定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆?。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。 （2）柱上吸附的過度標(biāo)記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至 2.0mol/L洗脫完。 經(jīng)過DEAE-纖維素層析后的標(biāo)記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細(xì)菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價(jià)測(cè)定的稀釋法除去非特異性染色。 （五）熒光抗體稀釋法 先測(cè)定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價(jià)，若二者效價(jià)相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價(jià)測(cè)定方法相同。 （六）純化抗原法 用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。 （七）純化抗體法-免疫吸收法 例如抗IgA血清的純化方法-免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下： 1人IgG聚合物的制備在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細(xì)，繼用1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。 2免疫吸收法將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫?cái)嚢?0min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。 （八）伊文氏藍(lán)（Evans blue）襯染法 用0.01%伊文氏藍(lán)的0.01mol/L pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對(duì)比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文氏藍(lán)一般先配成1%溶液，保存于4，用前再稀釋至0.01%用以 和然釋熒光抗體。 此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。 參考文獻(xiàn) 1Coons AH, et al. 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