基因工程常用工具酶及應(yīng)用.ppt

1 第四章 基因工程的工具酶及其應(yīng)用 2 TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS RESTRICTIONENZYMESGLUE DNALIGASEVEHICLE PLASMIDORVIRALVECTORS 3 基因工程的工具酶定義用于DNA和RNA切割和連接的各種酶叫做工具酶 4 分子剪刀 的發(fā)現(xiàn)者 5 第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶 restrictionendonuclease RE 是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識(shí)別雙鏈DNA中的特定序列 并以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶 6 在細(xì)菌體內(nèi) 這種內(nèi)切酶可以分解外源性的DNA物質(zhì) 例如病毒等 而細(xì)菌本身的DNA同一識(shí)別序列中的某些堿基被甲基化所保護(hù) 這種細(xì)菌內(nèi)部的限制與修飾作用分別由核酸內(nèi)切酶和甲基化酶完成 構(gòu)成了類似免疫的防御系統(tǒng) 7 解釋何謂內(nèi)切酶 o o o o o o o o o o o o o o 紅色為外切酶的作用位點(diǎn) 藍(lán)色為內(nèi)切酶的作用位點(diǎn) 8 限制性核酸內(nèi)切酶的分類 目前已發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶600余種 可分為三大類 類限制性核酸內(nèi)切酶廣泛用于基因工程 特點(diǎn) 識(shí)別切割位點(diǎn)比較專一 只有切割作用 無(wú)甲基化修飾作用 類和 類限制性核酸內(nèi)切酶同時(shí)具有內(nèi)切活性和甲基化修飾活性 且識(shí)別位點(diǎn)復(fù)雜 特異性差 不適用于基因工程 9 一 限制性內(nèi)切酶的命名 Hind Hind 細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母 細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母 細(xì)菌菌株的第一個(gè)字母 同一菌株中發(fā)現(xiàn)的第三種酶 10 EcoRIEcoRI 細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母 細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母 該酶的基因位于R質(zhì)粒上 該菌株發(fā)現(xiàn)的第一種內(nèi)切酶 11 12 二 II型限制酶的識(shí)別特點(diǎn) 識(shí)別專一的核苷酸順序 并在該順序的固定位置切割 識(shí)別順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu) Palindrome 客上天然居居然天上客 13 14 EcoRI PstI HpaI 5 stickyend5 粘末端 3 stickyend3 粘末端 bluntend平末端 三 限制性內(nèi)切酶的切割方式 15 四 識(shí)別位點(diǎn)與切割方式 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列一般為6個(gè)核苷酸 如EcoRI HindIII BamHI 居多數(shù) 也有少數(shù)限制性內(nèi)切酶 識(shí)別序列為4個(gè) 5個(gè) 或更多的核苷酸如8個(gè)及8個(gè)以上 當(dāng)識(shí)別序列核苷酸數(shù)為單數(shù)時(shí) 則以中間的核苷酸作為對(duì)稱軸 如GTNAC N代表四種核苷酸 16 一般說(shuō)來(lái) 在DNA分子中 識(shí)別序列短的出現(xiàn)概率大 識(shí)別序列長(zhǎng)的出現(xiàn)概率小 有N個(gè)核苷酸的識(shí)別序列出現(xiàn)概率為1 4n 如識(shí)別4個(gè)核苷酸Sau3A 則間隔256 4 4 4 4 個(gè)核苷酸就有一次機(jī)會(huì)出現(xiàn)識(shí)別位點(diǎn) 如識(shí)別8個(gè)核苷酸的NotI 則需間隔65536個(gè)核苷酸才有一次機(jī)會(huì)出現(xiàn)識(shí)別位點(diǎn) 17 稀切酶 有些酶的識(shí)別位點(diǎn)在核苷酸序列中出現(xiàn)的幾率很小 可稱為稀切酶 為了獲得大的DNA片段 需用稀切酶切割 個(gè)別限制性內(nèi)切酶可識(shí)別兩種以上的核苷酸序列 如AccI既可識(shí)別GTATAC 又可識(shí)別GTCGAC 18 位點(diǎn)偏愛(ài) 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列兩側(cè)的核苷酸組成與酶切效率有關(guān) 比如NaeI在pBR322質(zhì)粒上有4個(gè)識(shí)別位點(diǎn) 其中兩個(gè)位點(diǎn)可迅速被NaeI切割 第三個(gè)位點(diǎn)稍慢 而位于1285處的第四個(gè)識(shí)別序列 切割的效率只有其他位點(diǎn)的1 15 19 同尾酶 兩種酶識(shí)別不同的順序 但切割產(chǎn)生的粘末端相同 叫做同尾酶 同尾酶產(chǎn)生的粘末端 可通過(guò)堿基互補(bǔ)連接 形成的位點(diǎn)稱為 雜種位點(diǎn) 該位點(diǎn)不能再被原來(lái)的兩種酶切割 20 例 AGATCTGGATCCTCTAGACCTAGG Bgl BamH ATCTAG GATCCG 連接酶 AGATCCTCTAGG 21 同位酶 識(shí)別相同的序列 但切割位點(diǎn)不同 同裂酶 又稱異源同工酶 來(lái)源不同 但識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)相同 切割位點(diǎn)也可以不同 例如SamI CCC GGG 和XmaI C CCGGG 22 五 限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 反應(yīng)溫度一般為37oC反應(yīng)體積20 lDNA含量0 5 1 g酶含量1 2uDNA純度 OD260 280nm 1 7陽(yáng)離子Mg2 反應(yīng)時(shí)間1 1 5hpH7 5 23 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 各種限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)條件相似 主要區(qū)別是對(duì)鹽濃度的需求不同 據(jù)此可分為三組低鹽組0 50mmol LNaCl中鹽組50 100mmol LNaCl高鹽組100 150mmol LNaCl 24 限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性 當(dāng)酶切條件發(fā)生變化時(shí) 限制性核酸內(nèi)切酶的專一性可能會(huì)降低 導(dǎo)致同種酶識(shí)別多種序列 這種現(xiàn)象稱作限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性 25 例如EcoRI在正常條件下識(shí)別GAATTC 但在低鹽 小于50mmol L 高pH 大于8 甘油大量存在時(shí) 識(shí)別序列增加了AAATTC GAGTTC 導(dǎo)致EcoRI在DNA分子上的切割位點(diǎn)大大增加 26 第二節(jié)其他工具酶 一 DNA聚合酶作用 依據(jù)模版 連接游離的單核苷酸 形成與模版互補(bǔ)的新鏈 27 1 大腸桿菌DNA聚合酶 該酶具有三種酶活性5 3 DNA聚合活性3 5 外切酶活性識(shí)別切除錯(cuò)配的核苷酸5 3 DNA外切酶活性 28 5 CCGATA OH3 3 GGCTATCGGA5 CCGATAGCCT3 3 GGCTATCGGA5 3 DNA聚合酶活性 DNA聚合酶 dNTP 29 5 CCGATA OH3 3 GGCDNA聚合酶 5 CCG3 GGC dA dT3 5 外切酶活性 30 2 大腸桿菌DNA聚合酶 大片段 該酶是用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶 從全酶中切去5 3 外切活性的肽段后產(chǎn)生的一條多肽鏈 保留了5 3 聚合和3 5 外切活性 該酶稱為Klenow酶 也稱為Klenow片段 Klenowfragment 31 3 T4噬菌體DNA聚合酶 來(lái)源于T4噬菌體感染的大腸桿菌 具有5 3 DNA聚合酶活性3 5 外切酶活性 32 4 TaqDNA聚合酶 耐熱的DNA聚合酶 最適反應(yīng)溫度75 80oC 主要用于聚合酶鏈反應(yīng) 33 5 逆轉(zhuǎn)錄酶 reversetranscriptase 作用 以RNA為模版 合成cDNA ComplementaryDNA 該類酶有三種活性 RNA依賴的DNA聚合酶活性 DNA依賴的DNA聚合酶活性 外切RNA的活性 34 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種 AMV 來(lái)自于鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒M MLV 來(lái)自于莫絡(luò)尼鼠的白血病病毒 35 二 T4DNA連接酶 催化兩個(gè)DNA片段的3 OH和5 P末端形成磷酸二酯鍵該酶是大腸桿菌T4噬菌體的DNA30編碼的產(chǎn)物 分子量68kd 現(xiàn)已由基因工程菌表達(dá) 36 DNA連接酶 分子針線 37 DNA連接酶 連接的部位 磷酸二酯鍵 梯子的扶手 不是氫鍵 梯子的踏板 38 主要功能降解RNA由于RNA酶分布廣泛 如唾液 皮膚分泌物中都含此酶 在涉及RNA的實(shí)驗(yàn)中謹(jǐn)防RNA酶污染 三 RNA酶 39 四 核酸酶SI