總黃酮的測定方法.doc

總黃酮的測定方法黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物,種類繁多, 大多數(shù)黃酮類化合物與葡萄糖或鼠李糖結(jié)合成苷,部分為游離態(tài)或與鞣質(zhì)結(jié)合存在。黃酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物, 一般具有C6-C3-C6的基本骨架結(jié)構(gòu)。近年來, 黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用倍受青睞, 人們對含有黃酮的化合物進行大量研究, 以期獲得黃酮含量較高的中草藥。因此黃酮的含量測定成為研究的關(guān)鍵步驟。一、方法（一）高效液相色譜法1.原理植物類樣品用石油醚脫脂后，經(jīng)甲醇加熱回流提取，以高效液相色譜法分離，在紫外檢測器360nm條件下，以保留時間定性、峰面積定量。2儀器和試劑（1）高效液相色譜儀（2）紫外檢測器（3）層析柱（4）超聲波清洗儀（5）索氏提取器（6）微孔過濾器（濾膜0.45um）（7）甲醇（色譜純）（8）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（9）石油醚，鹽酸，磷酸（分析純）。（10）去離子水（11）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取經(jīng)105干燥恒重的蘆丁標(biāo)誰品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ugml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3.操作步驟（1）樣品處理1）固體樣品：稱取2.0g干燥的固體樣品，研細，置于索氏提取器中，用石油醚（6090）提取脂肪等脂溶性成分，棄去石油醚提取液，剩余物揮去石油醚，加人甲醇50ml和25HC15ml，80水浴回流水解1h，取出后快速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.45um濾膜過濾，供分析用。2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取樣品2.0ml，直接以石油醚萃取脫脂，揮去石油醚后，以甲醇溶解并定容，經(jīng)微孔濾膜（0.45um）濾過后供測定用。（2）色譜分離條件色譜柱：CLCODS，6mm150mm，5um;流動相：0.3磷酸水溶液：甲醇（V:V）40:80，臨用前用超聲波脫氣；流速：lmlmin；柱溫：40；檢測波長：360nm；靈敏度：0.02AUFS；進樣量：20ul。（3）樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液各10ul，注入高液相色譜儀進行分離，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間定性，以其峰面積計算出樣品中總黃酮的含量。4、結(jié)果計算（二）分光光度法1原理黃酮類化合物是具有苯并吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱，一般都具有4位羰基，且呈現(xiàn)黃色。黃酮類化合物的3羥基、4羥基或5羥基、4羰基或鄰二位酚羥基，與鋁鹽進行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色的絡(luò)合物。本方法對樣品中黃酮類化合物進行提取純化后，用分光光度法于510nm波長下測定其吸光度，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品比較，進行待測物中總黃酮的定量測定。2儀器和試劑（1）722分光光度計（2）索氏提取器（3）真空泵，鹽基交換管等。（4）恒溫水浴，分液漏斗。（5）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（6）亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉（分析純）。（7）氯仿，無水乙醇，甲醇（分析純）。（8）5香草醛溶液：稱取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。（9）聚酰胺樹脂（10）去離子水。3操作步驟（1）樣品處理1）固體樣品：稱取12g干燥的固體樣品，用濾紙包緊，置于索氏提取器中，加入50100ml70乙醇溶液浸潤后，在80水浴下回流3h，至提取液無色為止。粗提液冷卻后，減壓抽濾，并用少量25乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液。在50下減壓蒸餾，除去其中的乙醇，直至索氏提取器內(nèi)溶液呈無醇味。倒出容器內(nèi)溶液，用30ml熱水分3次洗滌，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75ml氯仿分3次萃取脫脂，待完全分層后，收集各次下層水溶液并定容至50ml。稱取12g經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺樹脂粉末，濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的水溶液12ml，沿層析柱漫漫滴人柱內(nèi)，放置一定時間，待測液被充分吸附后，用70乙醇或甲醇洗脫，流速為1.0mlmin，至流出液基本無色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脫劑定容后即可用于測定。2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取1.0ml樣品，定容至50ml后，直接以75ml氯仿分3次萃取脫脂，其余步驟同上。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、00ml（相當(dāng)于蘆丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30乙醇溶液至5ml，各加5亞硝酸鈉溶液0.3ml，振搖后放置5min，加入10硝酸鋁溶液0.3ml搖勻后放置6min，加1.0molL氫氧化鈉溶液2ml，用30乙醇定容至刻度。搖勻，放置15min，于510nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以蘆丁含量（ug）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相關(guān)系數(shù)（r）。（3）樣品測定：根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟于510nm處進行吸光度的測定（樣液如有沉淀，應(yīng)過濾后測定）。4.結(jié)果計算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出相當(dāng)于樣品吸光度的蘆丁含量，按下式求出總黃酮含量（三）毛細管電泳法毛細管電泳法是離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動力, 在毛細管中按其淌度或分配系數(shù)不同進行高效、快速的電泳分離新技術(shù)。常用的方法主要有毛細管區(qū)帶電泳( CZE )、膠束電動力學(xué)毛細管色譜(MEKC) 、毛細管凝膠電泳( CGE) 、毛細管等速電泳( CITP) 等。它的各種操作模式特別是CZE 和MEKC 都能很好的用于中藥成分含量分析。（四）其他共振散射光譜法、單掃示波極譜法、近紅外漫反射光譜法（對已知總黃酮含量的樣品在1100 2500 nm 處掃描建立樣本數(shù)據(jù)庫, 對預(yù)測集樣品進行分析, 結(jié)果預(yù)測值與H PLC 真值的相關(guān)系數(shù)( r )為0. 973, 結(jié)果準(zhǔn)確且提高了檢測效率）、流動注射法-化學(xué)發(fā)光, 電化學(xué)法, 免疫化學(xué)發(fā)光, 這些檢測靈敏度高的分析方法也將逐步應(yīng)用于總黃酮的含量測定。二、總黃酮的作用1、對造血系統(tǒng)的保護作用2、對免疫系統(tǒng)的保護作用3、清除自由基、抗氧化作用4、保護DNA三、為什么測植物中總黃酮的含量多用蘆丁做對照品？1 蘆丁有典型的黃酮類結(jié)構(gòu)和紫外特征，在總黃酮家族中是比較典型