「病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理」.doc

病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理 目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染細(xì)胞，從而得到表達(dá)滿足實(shí)驗(yàn)需求。1、病毒的種類病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA 和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。1.1.2特點(diǎn)1） 直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合 RNAi 研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 (比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)。2） 可以通過簡單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3） 可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4） 無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便。5） 可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。1.1.3慢病毒包裝簡要流程：1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。 2） 慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。 3） 培養(yǎng) 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。 4） 病毒的純化和濃縮。 5） 分裝、- 80 保存。 6） 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂。有近50個(gè)血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。1.2.2特點(diǎn)1） 幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞2） 可以獲得復(fù)制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒3） 病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達(dá)到 1012 PFU/mL，能有效的進(jìn)行增殖。4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.5） 感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。1.2.3腺病毒包裝簡要流程1） 構(gòu)建表達(dá) siRNA/miRNA 的腺病毒載體2） 采用 PacI 消化純化的質(zhì)粒。3） 消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4） 將病毒粗提液感染 293A 細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。5） 分裝，-80保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比較慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)（Lentivirus）腺病毒表達(dá)系統(tǒng)（Adenovirus）病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組，長時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)風(fēng)度中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間慢（1-3天）快（1-2天）滴度滴度最高可達(dá)10*8pfU/ml滴度最高可達(dá)10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性鑒tag72、構(gòu)建目的基因到載體2.1構(gòu)建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1）如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到載體，酶切，并測序鑒定2）如果沒有匹配的酶切位點(diǎn)，則設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定2.2質(zhì)粒載體2.2.1概念能夠進(jìn)行自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過個(gè)些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，利用選擇培養(yǎng)基來篩選從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3、質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒，以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。3.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2）取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置10min4）4離心10min（4000r/min）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細(xì)胞沉淀，立即冰浴30min7）4離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細(xì)胞（冰上放置）9）分裝細(xì)胞，200ul一份，4保存3.2質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1）取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA2ul混勻，冰浴30min2）離心管放到42保溫90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h（150r/min）5）取適當(dāng)體積（100ul）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在選擇性培養(yǎng)基上，正置30min6）倒置平皿37，1216h，出現(xiàn)菌落3.3質(zhì)粒提取步驟1）取14ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清2）加250ul溶液/RNaseA（溶液為細(xì)胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置1-2min。3）加入250ul溶液（細(xì)胞裂解液），輕柔的反復(fù)顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。4）加入350ul溶液（中和液），立刻輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6次，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5）12000室溫離心10min，收集上清。6）將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2min。7）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液。8）加入500ul溶液PB（洗滌液）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。9）加入500ul溶液W（去鹽液），12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一次。10）12000轉(zhuǎn)離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。11）將DNA純化柱置于新的離心管中，懸浮滴加50-100ul溶液Eluent（為無菌的雙蒸水，PH為8.0-8.5），室溫放置2min。12）12000轉(zhuǎn)離心1min，此時(shí)管底即為高純度的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒于-20保存。質(zhì)粒提取步驟：吸取液體培養(yǎng)基于1.5ml離心管中12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清，吸取培養(yǎng)基重復(fù)離心棄上清離心，留取少量菌液作為菌種保存，可直接置于-20加250ulBufferS1懸浮細(xì)菌，懸浮均勻加250ulBufferS2溫和充分的上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻，使菌體裂解加350ulBufferS3溫和上下翻轉(zhuǎn)12000離心10min取上清液轉(zhuǎn)移到專用的制備管（2ml）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液加500ulBufferW112000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液加500ulBufferW212000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一遍將制備管置回2ml離心管12000轉(zhuǎn)離心1min將制備管移入新的1.5ml離心管中，加6080ulEluent或離子水，室溫1min12000轉(zhuǎn)離心1min移去制備管，將有質(zhì)粒的離心管于4或是-20保存4、質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生病毒（即病毒包裝）4.1名詞解釋4.1.1293T細(xì)胞是由293細(xì)胞派生, 表達(dá)SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞系, 被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過表達(dá)各種目標(biāo)蛋白, 或是用以包裝病毒。4.1.2脂質(zhì)體：某些細(xì)胞質(zhì)中的天然脂質(zhì)小體，可作為生物膜，用于捕獲外源性物質(zhì)后更有效地運(yùn)送到靶細(xì)胞，經(jīng)同細(xì)胞融合而釋放。4.2共轉(zhuǎn)染的操作步驟第一天：用無抗生素DMEM+10%FBS鋪板293FT細(xì)胞，2ml/孔。確保第二天細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合度第二天：1. 500ul 無血清培養(yǎng)基稀釋2ug 表達(dá)質(zhì)粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G 2. 500ul 無血清培養(yǎng)基稀釋15ul 脂質(zhì)體20003. 5min后，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止20min 4. 從6孔板中吸出1ml無血清培養(yǎng)基，然后滴加入1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。5. 6-10h后，移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED+10%FB（從此刻開始算時(shí)間）。第三天：1.轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達(dá)到70%以上第四天：1.轉(zhuǎn)染后48和72h分別收獲含病毒的上清。2.3000 rpm 離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。3.12000轉(zhuǎn)離心濃縮細(xì)胞、分裝-80C貯存。4.滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。4.3病毒包裝的原理質(zhì)粒DNA為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)（RNA），但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒，其同時(shí)連有目的基因和報(bào)告基因，psPAX2為能表達(dá)慢病毒外殼的質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物可通過粘附機(jī)制更易穿過細(xì)胞膜， pMD2.G為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過 lipofectamine2000進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞基因組中，宿主基因組在表達(dá)時(shí)，隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因RNA與psPAX2、pMD2.G基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細(xì)胞，病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其遺傳物質(zhì)RNA反轉(zhuǎn)錄出DNA，該基因再整合到靶細(xì)胞的基因組中，完成轉(zhuǎn)染過程，因?yàn)橘|(zhì)粒DNA只能轉(zhuǎn)錄出病毒RNA和表達(dá)目的基因卻不能表達(dá)出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細(xì)胞能反復(fù)增殖，故對(duì)宿主細(xì)胞是無害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細(xì)胞基因組中。5、慢病毒感染細(xì)胞5.1流程圖5.2感染步驟1）鋪板：將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長過夜2）感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時(shí)加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。3) 24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。5.3熒光顯微鏡的操作流程打開熒光器（30min內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細(xì)胞培養(yǎng)板置于載物臺(tái)，調(diào)節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細(xì)胞，再關(guān)閉光，開啟熒光通道，觀察熒光強(qiáng)度，判定感染率。圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，增益值和彩色度使熒光照片最完美。（針對(duì)leica）5.4注意事項(xiàng)內(nèi)容1.病毒濃度要適宜，太少的話細(xì)胞被感染的也少，但是病毒濃度太大，對(duì)細(xì)胞有傷害。2.感染病毒時(shí)培養(yǎng)基量少，以保證病毒的濃度，在培養(yǎng)10h左右可根據(jù)培養(yǎng)基顏色加培養(yǎng)基。3.在不明確細(xì)胞感染復(fù)數(shù)情況下，可進(jìn)行濃度梯度感染，計(jì)算細(xì)胞感染復(fù)數(shù)。4.在加病毒后一般24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。6、感染后的細(xì)胞檢測方法6.1熒光初步檢測若有熒光，則表示病毒感染成功，但并不能確定目的基因是否整合到細(xì)胞中，待進(jìn)一步檢測，熒光有強(qiáng)弱之分，與病毒加入的量有關(guān)。6.2RNA的提取及RT-PCR檢測6.2.1原理因?yàn)檎婧思?xì)胞DNA含有很多非編碼區(qū)，真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的mRNA，是否表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條途徑來測定6.2.2RNA提取步驟加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml無菌的離心管中；加100ul氯仿劇烈振蕩30s混勻，12000轉(zhuǎn)15min，可看到明顯分層；取上層透明液體至新的1.5ml離心管中，加等體積的異丙醇，混勻靜置10min，12000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清，加1ml70%乙醇，12000轉(zhuǎn)，離心10min，棄上清，風(fēng)干剩余液體，最后加DEPC-水溶解RNA，電泳，粗步判定RNA純度。6.2.3RT-PCR步驟：RT是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過程，用前一天提取好的總RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR儀的溫度設(shè)置下，RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下進(jìn)行復(fù)制成雙鏈DNA。（具體步驟省略）6.3蛋白提取及Western檢測western-Bloting：蛋白免疫印跡（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個(gè)部分組成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。 第二