HPLC儀器原理20080610.ppt

HPLC儀器原理 大連依利特分析儀器有限公司應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室 主要內(nèi)容 1 概述2 高壓輸液系統(tǒng)3 進(jìn)樣系統(tǒng)4 檢測(cè)器5 色譜柱6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7 其他 1 概述 HPLC HighPerformanceLiquidChromatography 系統(tǒng)一般由輸液泵 進(jìn)樣器 色譜柱 檢測(cè)器 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成 其中輸液泵 色譜柱 檢測(cè)器是關(guān)鍵部件 有的儀器還有梯度洗脫裝置 在線脫氣機(jī) 自動(dòng)進(jìn)樣器 預(yù)柱或保護(hù)柱 柱溫控制器 自動(dòng)餾分收集裝置 工作站等 高效液相色譜法的基本流程 2 高壓輸液系統(tǒng) 2 1高壓輸液泵 功能 高壓輸液泵是液相色譜分離過程的動(dòng)力裝置 它將沖洗劑 流動(dòng)相 連續(xù)不斷地送進(jìn)柱系統(tǒng) 使樣品在色譜柱中完成分離過程 2 2高壓輸液泵的基本要求 恒流 準(zhǔn)確度與精密度恒壓耐高壓系統(tǒng)死體積小惰性表面壓力檢測(cè)與保護(hù)功能耐用 易維護(hù)程序控制 什么樣的高壓輸液泵才是優(yōu)良的呢 2 3泵的分類 柱塞往復(fù)泵 液壓隔膜泵 螺旋注射泵 氣動(dòng)放大泵 世界主要HPLC儀器公司商品泵類型分布隔膜泵2 氣動(dòng)放大泵3 柱塞往復(fù)泵4 螺旋注射泵 2 4雙柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu) 并聯(lián)式雙柱塞泵 串聯(lián)式雙柱塞泵 2 5消除脈動(dòng)的方法 降低單沖程排液體積凸輪曲線設(shè)計(jì)改進(jìn)驅(qū)動(dòng)方式脈動(dòng)阻尼器 2 6單向閥 柱塞桿和密封圈 單向閥 密封圈 柱塞桿 2 7部分P型高壓恒流泵的技術(shù)指標(biāo) P230高壓恒流泵 雙柱塞串聯(lián)式 P230p高壓恒流泵 雙柱塞串聯(lián)式 P270高壓恒流泵 雙柱塞并聯(lián)式 流量范圍選擇寬 可選擇微量 分析 制備 穩(wěn)定 重現(xiàn) 小結(jié) 3 進(jìn)樣系統(tǒng) 3 1功能與特點(diǎn) 功能 進(jìn)樣系統(tǒng)是將待分析樣品引入色譜柱的裝置 特點(diǎn) 進(jìn)樣重復(fù)性好死體積小耐高壓保證中心進(jìn)樣便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 3 2分類 手動(dòng)手動(dòng)注射進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣閥自動(dòng)圓盤式坐標(biāo)式其他 六通進(jìn)樣閥 可靠和重復(fù)自動(dòng)注射樣品自動(dòng)完成進(jìn)樣 清洗和編程自動(dòng)稀釋 混合 衍生溫度控制生物兼容 3 3AS230自動(dòng)進(jìn)樣器 小結(jié) 4 檢測(cè)器 連續(xù)監(jiān)測(cè)色譜柱分離組分的組成和含量 4 1HPLC檢測(cè)器基本要求 靈敏度高 線性范圍寬 通用響應(yīng)快 響應(yīng)值不受溫度及流動(dòng)相影響噪音低 漂移小死體積小對(duì)樣品無(wú)破壞性方便便宜 示差折光檢測(cè)器RI紫外 可見 二極管陣列檢測(cè)器DAD熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù) LC MS LC MS MSLC NMR LC NMR MS 4 2常用HPLC檢測(cè)器類型 商品HPLC檢測(cè)器基本狀況電化學(xué)2 熒光3 二極管陣列4 示差折光5 UV vis6 放射性7 LC MS8 LC FTIR 單波長(zhǎng)及可變波長(zhǎng)紫外 可見檢測(cè)器光路圖 4 3紫外 可見檢測(cè)器 朗伯 比爾定律 紫外 可見檢測(cè)池結(jié)構(gòu) UV230 紫外可見檢測(cè)器 UV230 檢測(cè)器特性 寬范圍測(cè)定波長(zhǎng)集成微型光學(xué)系統(tǒng)和二極管陣列技術(shù)光譜分辨率高 動(dòng)態(tài)范圍寬波長(zhǎng)準(zhǔn)確度和重復(fù)性高長(zhǎng)壽命D2燈與W燈兼容生物HPLC系統(tǒng) UV230 檢測(cè)器功能 開機(jī)自檢 電源 燈狀態(tài)與能量 標(biāo)準(zhǔn)靈敏度時(shí)間波長(zhǎng)程序高靈敏度吸收譜錯(cuò)誤信息提示 UV230 檢測(cè)器技術(shù)指標(biāo) 波長(zhǎng)范圍 190nm 720nm波長(zhǎng)分辨率 6nm波長(zhǎng)準(zhǔn)確度 0 5nm波長(zhǎng)重復(fù)性 0 1nm時(shí)間波長(zhǎng)程序 0 1min 999 9min響應(yīng)時(shí)間設(shè)定 0 0sec 9 9sec 基線噪聲 3 0X10 5 AU 基線漂移 5X10 4 AU h 反相標(biāo)樣 UV230 波長(zhǎng)程序 蘇丹紅 UV230 波長(zhǎng)程序 流通池的選擇 分析池光程 10mm 體積 10 L半制備池光程 3mm 體積 5 L微量池光程 3mm 體積 1 2 L 4 4二極管陣列檢測(cè)器 DAD DAD230二極管陣列檢測(cè)器是大連依利特分析儀器有限公司在國(guó)家科技部 九五 攻關(guān)項(xiàng)目的支持下 開發(fā)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高性能檢測(cè)器 EC2000DAD數(shù)據(jù)處理工作站特點(diǎn) 等高線 光譜 色譜圖 三維圖 旋轉(zhuǎn)與局部放大三維圖 單波長(zhǎng) 雙波長(zhǎng)吸收比 波長(zhǎng)時(shí)間程序 最大吸收波長(zhǎng) 總體吸收色譜圖 色譜工作站所有定性定量功能色譜峰純度判斷 等高線圖法 光譜色譜三維圖法 重疊光譜圖法 波長(zhǎng)比圖法和色譜峰純度計(jì)算法等 譜圖庫(kù)管理與檢索程序 建立特定的紫外譜圖庫(kù) 自動(dòng)從光譜 色譜三維數(shù)據(jù)中對(duì)各色譜峰提取光譜圖 自動(dòng)譜圖庫(kù)檢索 梯度控制 低壓 高壓 依利特DAD記錄三維光 色譜圖 等高線圖1苯 2聯(lián)苯 3萘 4蒽 5螢蒽 其中b的2 3之間有二甲苯 總體性能檢測(cè)器濃度敏感性檢測(cè)器中等靈敏度對(duì)壓力和溫度的變化很敏感流動(dòng)相流速影響檢測(cè)信號(hào) 流通池的幾何形狀 大小及材料 檢測(cè)器的光路系統(tǒng) 4 5示差折光檢測(cè)器 通用型檢測(cè)器 示差折光檢測(cè)器檢測(cè)池示意圖 依利特RI230示差折光檢測(cè)器 4 6蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 有望作為新一代通用型檢測(cè)器 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的優(yōu)點(diǎn)及限制 優(yōu)點(diǎn)通用型質(zhì)量檢測(cè)器靈敏度高于RI可以進(jìn)行梯度洗脫可作為SEC和SFC色譜 細(xì)內(nèi)徑LC檢測(cè)器可測(cè)定磷脂 皂甙 糖類 聚合物 樹脂限制受樣品組分和流動(dòng)相的揮發(fā)性的影響 ChromachemELSD檢測(cè)器 4 6其它檢測(cè)器 熒光檢測(cè)器 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù) LC MS LC MS MSLC NMR LC NMR MS LIFD230激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器 激發(fā)光波長(zhǎng) nm 473發(fā)射光中心波長(zhǎng) nm 525 510 540 激光類型10mWDPSS激光473nm 主要特點(diǎn) 全新的光路系統(tǒng)模塊 采用共聚焦光學(xué)配置 減小了雷利散射和拉曼散射所引起的背景噪聲 在發(fā)射通路上以長(zhǎng)通濾光片及帶通濾光片配合使用 以消減進(jìn)入光電倍增管的激光散射 提高檢測(cè)器的信噪比 對(duì)聚光物鏡的數(shù)值孔徑進(jìn)行優(yōu)化 以使物鏡的工作距離和其聚光能力相匹配 采用大數(shù)值孔徑的物鏡 增加了物鏡的采光效率 專用型檢測(cè)池模塊 采用反射式Z 型檢測(cè)池 實(shí)現(xiàn)了熒光的高效采集 大大提高了LIFD的靈敏度 專用型激光器電源模塊 小結(jié) 測(cè)得出來(lái) 盡量靈敏 多用途 5 色譜柱 色譜柱是HPLC分離過程的核心 1 柱頭螺絲2 過濾篩板3 色譜柱管刃環(huán)4 柱頭壓帽5 色譜柱柱管 零死體積連接 3微米多孔二氧化硅微球 不同品牌填料性能參數(shù)比較 分析 制備 固定相顆粒粒徑使用情況調(diào)查 實(shí)際應(yīng)用中HPLC色譜固定相類型 柱重復(fù)性公司信譽(yù)柱壽命技術(shù)支持塔板數(shù)柱硬件設(shè)計(jì)產(chǎn)品資料其他 選擇HPLC柱優(yōu)先考慮的因素 小粒徑短柱快速色譜制備柱整體柱專用色譜柱 蛋白質(zhì) 肽 氨基酸 核酸 糖 手性 高通量柱 開發(fā)新藥和組合化學(xué) 樣品制備處理柱高光潔度柱管 內(nèi)襯玻璃 PEEK 色譜柱發(fā)展方向 內(nèi)徑80mm柱長(zhǎng)250mm填料 SinoChromODS BP粒度 20微米最大上樣量 2g 俊杰制備色譜柱 6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 什么是工作站 由一臺(tái)個(gè)人電腦為中心 實(shí)現(xiàn)色譜信號(hào)數(shù)據(jù)采集及處理 并實(shí)時(shí)控制色譜儀各部件的運(yùn)行 從而形成閉環(huán)的控制系統(tǒng) 稱色譜工作站 色譜工作站的基本功能 包含色譜積分儀的全部功能儀器控制功能計(jì)算機(jī)軟件平臺(tái)所提供的功能 GPC DAD 7 其他 7 1LU230低壓梯度混合器 特點(diǎn)采用四入一出高質(zhì)量快速響應(yīng)電磁閥 保證流動(dòng)相組成的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性 單片機(jī)計(jì)算扣除電磁閥啟動(dòng)時(shí)間 使得流動(dòng)相組成變化步長(zhǎng)減少到0 1 提高了流動(dòng)相比例精度 并且有效降低了流動(dòng)相切換周期 保證流動(dòng)相均勻穩(wěn)定 基于流動(dòng)相流速參數(shù)控制電磁閥切換速度設(shè)定功能 保證在較高和較低流速下流動(dòng)相分配的準(zhǔn)確性 同時(shí)延長(zhǎng)了電磁閥壽命 泵后靜態(tài)混合器使溶劑混合快速 均勻 保證了分析結(jié)果的重現(xiàn)性 同時(shí)降低了基線噪聲 計(jì)算機(jī)控制和面板設(shè)置2 4元低壓梯度 實(shí)時(shí)顯示各通道比例 可選擇內(nèi)置DG230在線脫氣機(jī) 減小了儀器組合體積 7 2脫氣機(jī) 依利特DG230在線脫氣機(jī) 脫氣機(jī)原理圖 Teflon AF聚合物中空纖維脫氣膜 7 3柱溫箱