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游離脂肪酸及高糖對內(nèi)皮細胞功能的影響研究作者：萬沁 鐘?；?何建華 馬紅燕 徐勇 李佳 作者單位：瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,四川 瀘州 646000 【摘要】 目的 探討游離脂肪酸及高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的功能的影響及可能機制。方法 研究游離脂肪酸及高糖對血管內(nèi)皮細胞功能指標(biāo)一氧化氮(NO)和可溶性細胞間黏附分子1(sICAM1)的影響;用激光共聚焦顯微鏡觀察游離脂肪酸及高糖對PKC、PKC的影響。結(jié)果 不同濃度游離脂肪酸及高糖均可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞功能紊亂及PKC及PKC表達位置轉(zhuǎn)移及表達增強，高糖中加入游離脂肪酸可使變化更顯著。結(jié)論 游離脂肪酸及高糖均可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能紊亂，可能部分是通過PKC及PKC途徑來實現(xiàn)的?！娟P(guān)鍵詞】 內(nèi)皮細胞功能;游離脂肪酸;高糖;蛋白激酶C(PKC);PKCEffects of free fatty acids and high glucose on endothelial cellsWAN Qin, ZHONG HaiHua, HE JianHua, et al.Department of Endocrinology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China 【Abstract】Objective To study the effects of free fatty acids and high glucose on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and the possible mechanisms.Methods The expressions of nitric oxide (NO) and soluble intercellular adhesion molecule1 (sICAM1) were determined by kits. The expressions of PKC and PKC were determined by laserscanning confocal microscopy. Results Different concentration of free fatty acids and high glucose induced HUVECs dysfunction, PKC and PKC translocation and over expression, and high glucose added free fatty acids made more significant changes.Conclusions Free fatty acids and high glucose could induce endothelial cells dysfunctions by PKC and PKC signaling pathways. 【Key words】Endothelial cells function; Free fatty acids; High glucose; Protein kinase C（PKC）; PKC血管并發(fā)癥是糖尿病的主要并發(fā)癥之一,它嚴重影響了糖尿病患者的預(yù)后和生存，其中血管內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）的損傷在大血管并發(fā)癥中起著關(guān)鍵作用，已證實高血糖在血管EC的損傷中起重要作用1。除高糖外,游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)水平升高也在糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，F(xiàn)FA特別是軟脂酸(palmitic acid，PA)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞功能受損是糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵因素2。但目前有關(guān)FFA引起EC損傷的機制尚不清楚。FFA介導(dǎo)的EC損傷中的機制有多種,氧化損傷是研究的重點3,也與細胞黏附因子(ICAM1)、一氧化氮(NO)等表達增加引起炎癥反應(yīng)有關(guān),其中激活的蛋白激酶C（PKC）起著關(guān)鍵性作用,但PKC各亞型的作用不一。體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）是血管內(nèi)皮功能研究中最常采用的一種細胞,它對包括炎癥因子在內(nèi)的多種體內(nèi)因子均有很好的反應(yīng)性,通過HUVEC的體外實驗可以幫助探討在體條件下多種因素對血管內(nèi)皮功能的影響及其機制。本實驗以HUVEC為靶細胞，觀察FFA、高糖單獨及這兩種因素共存時對血管EC的損傷情況，進一步探討大血管并發(fā)癥的發(fā)生機制。1 材料與方法1.1 材料 軟脂酸(美國Sigma公司)，牛內(nèi)皮細胞生長因子（endothelial cell growth factor， ECGF）,胎牛血清、I型膠原酶、M199培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Gibco公司)，兔抗人因子相關(guān)抗原抗體、SP免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、PMSF(Sigma公司)，酶標(biāo)儀(美國BioRad550型)，微量自動洗板機(美國BIOTEK公司，型號EL404）；NO試劑盒(南京建成生物有限公司)，ICAM1試劑盒(晶美生物工程有限公司)。1.2 方法1.2.1 HUVEC原代細胞培養(yǎng) 采用原代培養(yǎng)方法。取健康產(chǎn)婦的嬰兒臍帶,用0.1膠原酶37消化2030 min，用培養(yǎng)液重新懸浮細胞，臺盼藍染色細胞活性在95%以上。以104105個/ml接種到培養(yǎng)瓶中，置于37，5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用含20的小牛血清的M199培養(yǎng)液,其中1 000 ml培養(yǎng)液中含2 mg ECGF，青霉素0.125 g，鏈霉素0.1 g，5 000 U肝素鈉。23 d換液1次，細胞生長至融合后進行傳代，經(jīng)因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定陽性,傳代培養(yǎng)至24代用于實驗。1.2.2 分組 對照組：葡萄糖濃度5.5 mmol/L;2.高糖組:葡萄糖濃度30 mmol/L;3.FFA組：以PA為代表，培養(yǎng)液中分別加入終濃度為125、250和500 mol/L的PA。4.葡萄糖與FFA聯(lián)合作用組：30 mmol/L高糖+250 mol/L的PA。每組6孔,于37、5%CO2孵箱中孵育48 h。1.2.3 NO的測定 細胞上清液中NO含量的測定：NO化學(xué)性質(zhì)活躍，體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為硝酸鹽(NO-3)和亞硝酸鹽(NO-2)，采用硝酸還原酶法測定NO-3+NO-2可較準確反映NO水平。具體檢測方法主要參照試劑盒說明進行。1.2.4 sICAMl測定 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ABCELISA）法測定上清液中sICAM1水平，具體操作嚴格按照試劑盒進行。1.2.5 激光共聚焦顯微鏡作PKC及PKC免疫熒光分析 將生長在載玻片的EC同步經(jīng)上述分組培養(yǎng)后用丙酮：甲醇73濕盒內(nèi)固定；滴加0.1TritonX100PBS4下作用細胞10 min；分別加1100的兔抗人PKC、PKC多抗，37溫育60 min，4作用細胞過夜；滴加1100的FITC標(biāo)記羊抗兔IgG 100 l，37溫育60 min;用甘油封片；各步驟間以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗滌，35 min。用激光共聚焦顯微鏡(LaserScanning Confocal Microscope，CLSM，MRC1024型)觀察熒光在細胞內(nèi)分布、定位，測定時選用激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為475 nm，Iris5.1，Pixel size1.291 m，Power30%，Gain 1 500，所有實驗保持參數(shù)不變。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料以xs表示,數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行處理。數(shù)據(jù)方差齊性的采用多樣本方差分析;數(shù)據(jù)方差不齊者采用秩和檢驗。2 結(jié)果2.1 NO、sICAM1濃度 見表1。各濃度FFA組、高糖組NO水平比對照組明顯降低。其中高糖組、高濃度FFA顯著降低（P0.001），低、中濃度FFA組明顯（P0.05）。不同濃度FFA組內(nèi)比較，低、中濃度組之間NO水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義,高、中濃度組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。提示FFA達到一定濃度時，對NO水平的抑制作用會更明顯。在高糖培養(yǎng)同時加入FFA后可加重上述損害，其NO下降水平與高糖組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。高糖組及各濃度FFA組sICAM1水平比對照組明顯增加。高、中、低濃度FFA組對sICAM1濃度的刺激程度組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），其對sICAM1表達的刺激作用呈劑量依賴性。在高糖培養(yǎng)同時加入FFA后sICAM1濃度升高更明顯，與高糖組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。表1 正常對照組、高糖組和FFA組NO、sICAM1濃度值(略)2.2 PKC,PKC的表達 PKC在正常HUVEC內(nèi)在胞漿呈彌漫性分布，胞核無表達或弱表達（圖1A）。高糖作用后，PKC發(fā)生轉(zhuǎn)位，主要轉(zhuǎn)位于胞核和核周，尤以胞核明顯（圖1B）。而加入不同濃度的FFA同樣可引起這種轉(zhuǎn)位（圖1C、D、E）。在高糖中加入FFA后可使轉(zhuǎn)位更明顯（圖1F）。PKC主要在正常HUVEC中胞漿表達,以細胞核周明顯（圖2A），不同濃度的FFA作用后PKC發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)位，主要是以核周向胞漿胞膜轉(zhuǎn)位,且熒光強度升高，提示表達增強（圖2B、C、D）。而同樣高糖作用后可引起轉(zhuǎn)位及熒光表達強度增高（圖2E）。在高糖中加入FFA后可促進轉(zhuǎn)位及熒光強度增強（圖2F）。未加一抗的陰性對照組無熒光表達。3 討論 糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病的主要并發(fā)癥，其發(fā)病關(guān)鍵部位是血管EC。血管EC不僅阻隔血液與血管內(nèi)膜下成分的接觸,更重要的是它能分泌和表達一系列生物活性物質(zhì),在調(diào)節(jié)血管舒縮、血小板功能及凝血、纖溶系統(tǒng)和白細胞移行方面具有重要作用。在病理狀態(tài)下EC易受損傷,致內(nèi)皮功能發(fā)生變化,因此血管EC的損傷被認為是形成糖尿病及其血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)。近年來炎癥反應(yīng)學(xué)說在2型糖尿病及其血管并發(fā)癥的研究中成為熱點，普遍認為糖尿病及其血管病變是炎癥性疾病,由于炎癥因子引起的炎性反應(yīng)導(dǎo)致EC功能紊亂,從而對糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。這些炎癥因子包括:急性期反應(yīng)蛋白、內(nèi)皮黏附分子、腫瘤壞死因子、白介素系列、纖溶酶原激活物抑制物、von Willebrand因子、脂聯(lián)素、抵抗素等，其中ICAM1是重要成員,在正常情況下很少表達，當(dāng)受到刺激后，可表達于多種細胞表面。在糖尿病慢性血管并發(fā)癥的形成和發(fā)展中起重要作用,其水平升高反映了糖尿病時EC功能異常4。 糖尿病的血管EC損傷的具體機制目前尚未完全明確,已證實高糖及FFA在血管EC的損傷中均起著重要作用。FFA是脂類代謝中最活躍的部分,升高的FFA可導(dǎo)致血管EC功能損傷。FFA介導(dǎo)的EC損傷中的機制有多種,可能與其誘導(dǎo)致細胞凋亡、EC的一氧化氮合酶活性改變和細胞因子刺激EC神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生等有關(guān)。氧化損傷一直是研究的重點，研究表明,隨實驗動物的血漿FFA濃度增加,血漿氧化應(yīng)激的標(biāo)志物異前列腺素和蛋白質(zhì)羰基增高,表明FFA可增加細胞的氧化應(yīng)激4。還有研究表明FFA培養(yǎng)細胞后使氧化應(yīng)激增強，白介素IL8增多、核因子NFB活性增強,ICAM1含量增加，認為NFB能調(diào)控血管EC黏附分子、NOS等基因表達而引起炎癥反應(yīng)。Coll5發(fā)現(xiàn),高FFA可使細胞內(nèi)活性氧增高,通過氧化應(yīng)激促發(fā)MAPKERK和NFB等途徑激活和表達增加,進而形成糖尿病血管損害，但機制并不完全明了。 激活的PKC可抑制eNOS的活性，導(dǎo)致NO生成減少，引起EC損傷是糖尿病血管病變的機制之一。同時高糖通過PKC上調(diào)黏附分子表達，成為糖尿病內(nèi)皮功能受損的一個重要機制6。但PKC各亞型的作用不一,PKC與糖尿病慢性并發(fā)癥如腎病、心血管疾病等發(fā)生有關(guān),還參與EC功能紊亂發(fā)生7。而PKC參與EC功能紊亂發(fā)生的作用,研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素1的縮血管作用由主要由PKC介導(dǎo)的。凝血酶刺激EC的血管VCAM1基因表達是NFB依賴性機制,在共轉(zhuǎn)染HUVECs時凝血酶刺激NFBVCAM1表達過程僅能被PKC抑制劑阻斷8。 本研究采用人臍靜脈EC的體外培養(yǎng)方法,探討FFA對EC的損傷作用，結(jié)果顯示,高糖、不同濃度的FFA均對EC的NO合成具有明顯的抑制作用，還可刺激sICAM1的表達，而在高糖培養(yǎng)同時加入FFA可加重上述損害。實驗發(fā)現(xiàn)高糖和不同濃度FFA均可誘導(dǎo)的PKC轉(zhuǎn)位及表達增加，還可誘導(dǎo)的PKC轉(zhuǎn)位，提示高糖和FFA對血管EC的損傷機制除公認的氧化應(yīng)激外，PKC轉(zhuǎn)位、PKC轉(zhuǎn)位及表達增加可能也參與作用。 血管EC的損傷是血管病變的啟動環(huán)節(jié),血漿FFA可能通過氧化應(yīng)激、PKC，PKC途徑等損傷EC，導(dǎo)致的內(nèi)皮源性NO水平下降，炎性標(biāo)志物ICAM1升高，在糖尿病血管病變發(fā)病過程起到很重要的作用。血漿FFA濃度增高已成為糖尿病血管病變的危險因子,因此如何在該病理生理鏈的上游調(diào)整糖尿病患者FFA代謝紊亂以及在下游通過PKC，PKC途徑改善血管EC功能有可能成為未來糖尿病患者防治大血管病變治療的一個新的治療靶點。晉升網(wǎng)（）設(shè)有論文學(xué)院、考試學(xué)院、在線投稿等，本網(wǎng)站致力于成為醫(yī)務(wù)工作者晉升職稱心靈導(dǎo)師；是目前國內(nèi)收錄醫(yī)學(xué)期刊、醫(yī)學(xué)雜志最多最權(quán)威的醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)平臺；提供免費醫(yī)學(xué)期刊在線閱讀；網(wǎng)羅和甄選海量優(yōu)秀醫(yī)學(xué)論文檢索，獨立研發(fā)醫(yī)學(xué)在線資源分享庫和醫(yī)學(xué)在線模擬考試庫；整合刊類、標(biāo)題、關(guān)鍵詞檢索及全文檢索，并獨家研發(fā)刊社管理和刊社加盟系統(tǒng)、在線投稿、在線查稿、在線閱讀、遠程審稿、在線下載等系統(tǒng)；聚刊社力量，建服務(wù)平臺，讓晉升網(wǎng)通過“專業(yè)”走入每一個醫(yī)務(wù)人員的身邊是我們不懈的追求目標(biāo)【參考文獻】1 Omi H，Okayama N，Shimizu M,et al.Participation of 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