酶的提取與分離純化-1.ppt

第三章酶的提取與分離純化 電泳 electrophoresis EP 指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動的過程 電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離的實驗技術(shù) 第四節(jié)電泳 一 電泳的基本理論1 原理 在一定pH條件下 用buffer 不同大小 形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同 用遷移率表示 各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶 影響遷移率的因素 顆粒性質(zhì) Q越大 r越小 形狀越接近球形 v越快 電場強度 E越高 v越快 電泳液 pH值 離pI越遠 v越快 用buffer保持恒定 離子強度 離子強度越高 v越低 通常 緩沖液離子強度在0 02 0 2之間 電滲 在電場中 液體對于固體支持物的相對移動 應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì) 自由界面電泳 又稱移動界面電泳 指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳 區(qū)帶電泳 指有支持介質(zhì)的電泳 待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶 支持介質(zhì)的作用 防止電泳過程中的對流和擴散 2 電泳的分類 按支持介質(zhì)種類的不同 區(qū)帶電泳可分為 紙電泳 用濾紙作支持介質(zhì) 用于核苷酸定性定量分析 醋酸纖維素薄膜電泳 常用于分析血清蛋白 胎盤球蛋白 優(yōu)點是簡便迅速 便于保存照相 比紙電泳分辨率高 以上兩種類型的電泳 由于介質(zhì)的孔徑度大 沒有分子篩效應(yīng) 主要靠被分離物的電荷多少進行分離 瓊脂糖凝膠電泳 一般用于核酸的分離分析 瓊脂糖凝膠孔徑度較大 對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 用于核酸和蛋白質(zhì)的分離 純化及檢測 分辨率高 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì) 3 電泳常用設(shè)備 1 電泳儀 提供穩(wěn)定直流電源的裝置 常壓電泳儀 600V 高壓電泳儀 3000V 超高壓電泳儀 30000V 50000V 2 電泳槽 自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽 3 附屬設(shè)備 二 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法 1 原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體 Acr 和交聯(lián)劑N N 甲叉雙丙烯酰胺 Bis 在催化劑和加速劑作用下聚合的 CH2 CH C O NH2 CH2 CH C ONHCH2NHC OCH2 CH CH2 CH CH2 CH nCH2 CH C OC ONH2NHCH2NHC O CH2 CH CH2 CH nCH2 CH C OC ONHNH2 丙烯酰胺 N N 甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 Acr Bis 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種 1 化學催化系統(tǒng) AP TEMED催化劑 過硫酸銨 ammoniumpersulfate AP 加速劑 TEMED N N N N 四甲基乙二胺 2 光催化系統(tǒng) 核黃素 光 TEMED 催化劑 核黃素 維生素B2 引發(fā)劑 光TEMED的存在 可加速聚合 凝膠濃度越大 小 孔徑越小 大 可分離分子量較小 大 的顆粒 Acr與Bis的重量比應(yīng)在30左右 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表 2 分離效應(yīng)PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng) 分為 連續(xù)電泳采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng) 連續(xù)PAGE 電荷效應(yīng) 分離膠中 蛋白質(zhì)表面凈電荷不同 遷移率不同 分子篩效應(yīng) 大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時 受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 濃縮效應(yīng) 使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶 然后再進入分離膠進行分離 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面 1 凝膠分上 下兩層 上層為大孔徑的濃縮膠 下層為小孔徑的分離膠 2 緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同 電極緩沖液為pH8 3的Tris 甘氨酸緩沖液 濃縮膠為pH6 8的Tris HCl緩沖液 分離膠為pH8 8的Tris HCl緩沖液 3 在電場中形成不連續(xù)的電位梯度 不連續(xù)系統(tǒng) 有三種物理效應(yīng) 即樣品的濃縮效應(yīng) 凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng) 提高了分辨率 三 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 sodiumdodecylsulphate polyacrylamidegelelectrophoresis SDS PAGE 簡稱SDS PAGE 是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量的一種最好的辦法 1 原理 SDS是種陰離子去污劑 帶有大量負電荷 與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷 因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異 SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵 疏水鍵 巰基乙醇使二硫鍵打開 引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變 使蛋白質(zhì) SDS復合物形狀近似橢圓形 短軸相同 1 8nm 長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比 因此 蛋白質(zhì) SDS復合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響 只與橢圓棒長度 蛋白質(zhì)分子量 有關(guān) 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳 可在標準曲線上求得分子量 2 操作 SDS PAGE及PAGE 即變性及非變性 1 制膠 變性 buffer中加0 4 SDS a 分離膠 根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠 查表 配制分離膠溶液 Acr Bis 29 1 分離膠buffer TEMED AP 水迅速倒膠 加水使液面平坦 室溫0 5h聚合完全 b 濃縮膠 用濃縮膠buffer 插上梳子 2 樣品制備 a PAGE 樣品 樣品緩沖液 蔗糖或甘油 指示劑溴酚藍 b SDS PAGE 樣品 樣品緩沖液 SDS 甘油 巰基乙醇 溴酚藍 煮沸2 5min 以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合 3 加樣及電泳 SDS PAGE 電極buffer中加0 1 SDS 溴酚藍距下端1cm時停止電泳 4 固定及染色a 固定 將凝膠浸于7 乙酸或12 5 三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分 b 染色 考馬斯亮藍染色法銀染法 靈敏度比前者高100倍 其它的染色方法 氨基黑 阿爾辛藍 過碘酸 Schiff試劑 糖蛋白 四 等電聚焦電泳 isoelectricfocusing IEF 利用蛋白質(zhì)具有不同等電點的特性 以聚丙烯酰胺為電泳支持物 在其中加入載體兩性電解質(zhì) 商品名 Ampholine 一種含有各種連續(xù)pI的小分子混合物 的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳 IEF PAGE 自學 第五節(jié)酶的濃縮 干燥與結(jié)晶一 酶的濃縮1蒸發(fā)濃縮 圖4 60減壓蒸發(fā)濃縮的簡易裝置1蒸餾瓶2毛細管3螺旋夾4橡皮管5溫度計6出水口7冷凝器8進水口9連接管10抽氣口11接收瓶 2超濾濃縮超濾濃縮以壓力差為動力 將待濃縮溶液通過超濾膜 酶分子較大被滯留 水分子和小分子選擇性透過 達到濃縮目的 圖4 61酶的超濾濃縮 3吸水劑 膠過濾濃縮利用葡聚糖凝膠SephadexG 25或G 50等的吸水特性 將干膠直接加入樣品溶液 吸水膨潤后 再過濾或離心分出濃縮的酶液 聚乙二醇濃縮 聚乙二醇 polyethyleneglycol 簡稱PEG 利用PEG的吸水特性 將PEG涂于裝有酶溶液的透析袋上 置于4 下 干PEG粉末吸收水和鹽類 酶溶液即被濃縮 一般用分子量大的PEG 如PEG6 000和PEG20 000 以防止PEG進入蛋白質(zhì)溶液 4反復凍融濃縮利用酶溶液相對于純水冰點較低的原理使酶分子與小分子物質(zhì)分離 5沉淀法鹽析法 有機溶劑法 二 酶的干燥酶的干燥多采用冷凍干燥法 將酶溶液在較低溫度下 10 到 50 凍結(jié)成固態(tài) 然后在高度真空條件下 將其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)而除去 也稱酶的升華干燥 三 酶的結(jié)晶結(jié)晶 Crystallization 是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)從蒸汽或溶液中析出的過程 結(jié)晶的條件酶的純度 純度越高越易結(jié)晶 50 2 酶的濃度 恰到好處 濃度越高越易結(jié)晶 控制在飽和區(qū)以上 過飽和區(qū)以下的介穩(wěn)區(qū)內(nèi) 3 結(jié)晶溫度4 溶液pH5 離子強度6 晶核7 結(jié)晶時間 第五節(jié)純化方案的設(shè)計與評價一 純化方案的設(shè)計1純化方法的選擇依據(jù)根據(jù)有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異 調(diào)節(jié)溶解度 沉淀法 根據(jù)分子大小 形狀的不同 離心分離 膜分離 凝膠過濾 根據(jù)分子電荷性質(zhì)的不同 離子交換層析 電泳 根據(jù)專一性結(jié)合的方法 親和層析 其它 吸附層析 疏水層析 2純化方法的排序先選用粗放 快速 有利于縮小樣品體積的方法 精確 費時 需樣品少的方法 宜后選用 二 純化方案的評價1酶活力測定 酶活力 enzymeactivity 又稱酶活性 即單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物生成量 是酶催化某一化學反應(yīng)的能力 方法 在酶反應(yīng)開始后不同時間 從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量反應(yīng)液 用適當方法停止其反應(yīng)后 再根據(jù)產(chǎn)物和底物在物化性質(zhì)上的差別進行分析 求得單位時間的酶促反應(yīng)變化量 常用的方法 化學分析法 比色法 產(chǎn)物可與特定的化學試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的有色溶液 分光光度法 利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同 量氣法 酶促反應(yīng)中產(chǎn)物或底物之一為氣體 滴定法 pH值測量法 產(chǎn)物之一是自由的酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì) 多用pH電極測 常用終止反應(yīng)方法 改變反應(yīng)最適條件 加酸 堿 加熱 加酶變性劑 5 三氯乙酸 酶活力單位 通常采用國際酶學委員會規(guī)定的單位 在純化過程中 為了方便 可采用自行規(guī)定的單位 只要達到可比較的目的即可 如直接以光密度值表示 2蛋白質(zhì)濃度測定 紫外吸收法 酪氨酸 色氨酸殘基中苯環(huán)有共軛雙鍵 在A280有最大吸收 特點 簡便 快速 不損耗樣品 但干擾因素多 雙縮脲法 具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物均有雙縮脲反應(yīng) 優(yōu)點 快速 缺點 靈敏度差 酚試劑 Folin 酚 測定法 繁瑣 但靈敏度 準確度高 染料結(jié)合法 考馬斯亮藍染色法 又稱Bradford法 靈敏 簡便 快速 干擾少 是常用的檢測法 3酶的純化指標純度提純倍數(shù)回收率常用比活力表示酶的純度 酶活力 u ml 比活力 蛋白質(zhì)含量 mg蛋白 ml酶液 比活力越高 酶純度也越好 提純倍數(shù) 提純后比活力 提純前比活力提純倍數(shù)越大 表示該方法純化效果越好 回收率 提純后酶總活力 提純前酶總活力 100 表示提純過程中酶損失程度的大小 回收率越高 損失越小 總活力 酶活力單位數(shù) 酶液總體積即樣品中全部酶活力 判斷一個分離純化方法的優(yōu)劣 常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個指標 回收率 反映酶的損失情況 提純倍數(shù) 表示方法的有效程度 一個好的純化步驟是回收率較高 提純倍數(shù)也較大 4純化表 提純倍數(shù) 0 6 0 416 1 449 8 0 4