分子生物學(xué)電子版(修正版).doc

1.snRNA：小核RNA，只存在于細胞核或者核質(zhì)核仁中的一類小分子量的RNA，具有獨特功能并且獨立存在的實體，約為70-300個核苷酸，可參與真核生物的RNA剪接。2.siRNA：即干擾RNA，一類小分子量的RNA，可以高效，特意地阻斷體內(nèi)同源基因的表達，促使同源mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定的基因缺失。3.核酶：一類具有催化活性的核糖核酸，呈錘頭狀，參加RNA的剪切和降解。與RNA酶有顯著區(qū)別，它是RNA，后者是蛋白質(zhì)。4.反義RNA又稱調(diào)節(jié)RNA，是指能與特定mRNA互補結(jié)合的RNA片段，即堿基序列正好與有意義的mRNA互補的RNA分子。5三鏈DNA：是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的，由多聚嘧啶核苷酸或者多聚嘌呤核苷酸與DNA雙螺旋形成的。/由于雙螺旋的一股輕微折疊后，該股中的堿基可與雙螺旋的堿基以Hoogsteen氫鍵相連如TAT、CGC、TAA、CGG。6.RNAi：即RNAi干擾，siRNA高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達，促使同源RNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的現(xiàn)象。7.何謂反義RNA？其功能和醫(yī)學(xué)意義如何？答：又稱為調(diào)節(jié)RNA，是指能與特定mRNA互補結(jié)合的RNA片段，也即堿基序列與有意義的mRNA互補的RNA分子。功能：a阻斷mRNA的翻譯，b抑制DNA復(fù)制和mRNA的轉(zhuǎn)錄，c選擇性的關(guān)閉基因。意義：參與基因調(diào)控：可用于基因治療（病毒、腫瘤）；8什么叫做核酶？如何發(fā)揮作用？有何應(yīng)用價值？答：即一類具有催化活性的核糖核酸。主要催化RNA的剪接反應(yīng)和剪切反應(yīng)。應(yīng)用意義：通過設(shè)計合成特異性切割病毒以及病毒的RNA的核酶，對病毒和腫瘤的基因治療將發(fā)揮重要作用。9.何謂RNAi？其作用機理和應(yīng)用前景如何？答：即RNAi干擾，siRNA高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達，促使同源RNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的現(xiàn)象。作用機理：分為起始階段和效應(yīng)階段。起始階段Dicer酶以依賴ATP的方式切割外源性的雙鏈RNA為小分子干擾RNA，清除病毒，阻斷轉(zhuǎn)座子表達；效應(yīng)階段小分子干擾RNA結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)活化的復(fù)合物及RISC，然后RISC結(jié)合至mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割它，從而發(fā)揮作用。應(yīng)用前景：大通量研究基因功能的工具；基因敲除中的應(yīng)用；用于基因治療；基因表達的調(diào)控。第二章 1移動基因：又叫轉(zhuǎn)位因子（transposable elements）,由于它可以在染色體基因組上移動，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumping gene）。2斷裂基因：真核細胞的結(jié)構(gòu)基因，其核苷酸序列中含有與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)段，從而被分割成不連續(xù)的若干區(qū)域。將這種編碼序列不連續(xù)，有間隔區(qū)段的DNA片斷稱為斷裂基因3 RNA剪接：將斷裂基因的內(nèi)含子刪除和表達子連接并最終形成成熟mRNA的過程。4 重疊基因：不同基因的核苷酸序列有時為相鄰兩個基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因。5 假基因：在珠蛋白基因簇各片段核苷酸序列分析時發(fā)現(xiàn)，除了有正常的功能基因之外，還有功能失活的特殊序列片段，它不能行使表達功能。該類核苷酸序列中存在的無表達功能的畸變核苷酸序列片段。6 衛(wèi)星DNA：又稱隨體DNA,不編碼蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄RNA的小片段高度重復(fù)一類小片段DNA序列，多富含GC堿基在DNA浮力密度實驗中會在主峰旁形成些小峰，形似衛(wèi)星分布而稱之。一般5-10bp短序列，人類為171bp，保護和穩(wěn)定染色體7 基因組：表示某物種單倍體的總DNA。對于二倍體高等生物其配子的DNA總和即為一組基因組不同生物基因組數(shù)目不同。8 LTR：即長末端重復(fù)序列，為RNA基因組的兩端含有的U3RU5兩個完全相同的正向重復(fù)序列。具隨機整和能力，可用作病毒載體問答：1 什么叫做基因？何謂基因的新概念？基因的主要功能是什么?答：基因就是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必須的全部核酸序列。所謂基因的新概念是隨著近年分子生物實驗技術(shù)的發(fā)展從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，提出的移動基因，斷裂基因，重疊基因，假基因等基因的新概念。功能：編碼蛋白質(zhì)或者RNA分子基本遺傳信息的基本遺傳單位，是構(gòu)成DNA的功能單位。2.何謂轉(zhuǎn)位子和轉(zhuǎn)位作用？轉(zhuǎn)位的后果如何？答：一種大于2000bp的可以在染色體基因組上移動，甚至可以在不同染色體間跳躍的基因序列，也可以稱為插入因子IS因子。轉(zhuǎn)位作用：轉(zhuǎn)位子具有雙向整合特性，可以插入其他基因及自身基因不同位點上的移動方式。后果：可以在細菌染色體或質(zhì)粒中隨機轉(zhuǎn)移，被插入的基因即失去活性?？梢栽谌旧w或質(zhì)粒的某一IS上脫落轉(zhuǎn)位至另一相同的IS上，引起突變或基因轉(zhuǎn)移。3.何謂基因工程的四大里程碑和三大技術(shù)發(fā)明？答：四大里程碑：1944年Oswald報道肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗，明確遺傳物質(zhì)是DNA；1953年James waston和Francis Crick闡明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(半保留復(fù)制及其中心法則)；遺傳密碼子的破譯；基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。三大技術(shù)發(fā)明：工具酶的發(fā)明（內(nèi)切酶、合成酶、連接酶）；基因合成和測序（合成儀、測序儀）；PCR技術(shù)（PCR擴增儀）。第三章名詞解釋：1基因表達：是目的基因DNA在導(dǎo)入的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA, 再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)。2 啟動子：是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當(dāng)啟動子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點開始轉(zhuǎn)錄。3 終止子：位于一個基因編碼區(qū)下游提供終止信號的DNA序列，可以被RNA聚合酶識別并發(fā)出停止mRNA合成的信號。4 起始密碼子：編碼多肽鏈的第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細菌中也有罕見的其實密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達作用AUGGUG。5 終止密碼子：有三個密碼子（UAA, UAG，UGA），為終止密碼子，只表示鏈的終止，不表達氨基酸。問答1外源基因在大腸桿菌中表達需要的條件有哪些？答：條件：一：外源基因插入序列必須保持有正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏或錯位及錯碼。否則會導(dǎo)致編碼錯誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點的識別序列；二：原核mRNA聚合酶能夠識別插入的基因，三: 外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的信使RNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效的進行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不至于受菌體蛋白酶的降解2 影響外源基因在大腸桿菌中表達的因素有哪些？答：包括以下這些因素：啟動子結(jié)構(gòu)對表達效率的影響；表達載體的選擇；外源基因中密碼子的作用；mRNA的一級結(jié)構(gòu)與基因表達；mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響；mRNA穩(wěn)定性的影響；轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達效率的影響；轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達的關(guān)系；宿主選擇對表達的影響；培養(yǎng)條件的控制對表達效率的影響。第四章名詞解釋：1 鋅指結(jié)構(gòu)：由兩個半胱氨酸殘基和兩個組氨酸殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。 2 亮氨酸拉鏈：存在與蛋白C末端，為兩組走向平行.帶亮氨酸的螺旋形成的對稱二聚體，約為30個氨基酸，每兩個亮氨酸之間隔有六個氨基酸，于是每兩圈螺旋就有一個亮氨酸，排成一排，從而在2個-螺旋的蛋白分子之間形成一條拉鏈。3 RNA編輯：是mRNA轉(zhuǎn)錄后因插入，缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白。4增強子：是使啟動子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高的一類順式作用元件，其本身不具有啟動子活性，可獨立存在與上游區(qū)、下游區(qū)或基因內(nèi)部，可進行遠距離增強啟動作用，而且無方向性。問答1 真核表達調(diào)控的順式作用元件有哪些？其作用特點是什么？ 答：順式作用元件有：啟動子，增強子，沉默子，衰減子，終止子。作用特點：是能夠與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的DNA片段，決定轉(zhuǎn)錄起始位點和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。2 真核表達調(diào)控的反式作用因子有哪些？其作用特點？答：反式作用元件：主要分為通用轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類。作用特點：一，同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識別；二：同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先結(jié)合再影響DNA。三：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA的結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象上細微的改變，從而發(fā)揮調(diào)控作用。四：反式作用元件在合成過程中有相當(dāng)大的可變性和可塑性。4 常用的真核表達載體有哪些？并簡述其特點。答：主要有一下幾種：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，痘類病毒載體，HSV-I單純皰疹病毒載體。特點：一，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：對細胞的感染效率高，并能表達整合的病毒基因；可以同時感染大量細胞；長時間感染細胞并不會發(fā)生毒害作用；宿主范圍十分廣泛；可以進行DNA的單拷貝整合；但穩(wěn)定性差，安全性差，重組病毒滴度不高而且局限于感染分裂細胞。二，痘類病毒載體：對多種細胞敏感易于培養(yǎng)利于大量生產(chǎn)制備；對外環(huán)境相對穩(wěn)定并易于保存運輸；接種途徑簡單易行；利于多價疫苗的研究開發(fā)；利于大片段的外源性基因的插入，且不影響病毒的正常復(fù)制和表達，但是基因組分子量大不易操作，沒有mRNA的剪切功能故不宜采用基因組DNA，需使用無內(nèi)含子的cDNA。三，HSV-I單純皰疹病毒載體：比較大利于大片段的外源性基因插入提供條件，而且插入容量大；可以感染神經(jīng)細胞。5 簡述真核，原核倆大表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點？答：一，真核生物DNA只有一小部分是裸露的，有核膜包裹；原核生物大部分屬于非結(jié)合狀態(tài)，且無核膜的阻隔，轉(zhuǎn)錄的mRNA直接在胞質(zhì)中進行蛋白合成。二，真核生物DNA都有內(nèi)含子，可以剪接加以去除；原核生物mRNA的剪接加工能力。三，真核生物可以在需要時可以重排某些DNA片段和擴增特定基因的機制，而原核生物沒有。四，真核生物有三種mRNA酶，可參與不同類型的RNA分子轉(zhuǎn)錄作用，而原核生物只有一種RNA酶。五，真核生物產(chǎn)生的mRNA分子壽命大多比原核生物長。六，真核生物具有對初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接能力。七，真核生物不存在操縱子結(jié)構(gòu)，原核生物多是。八，真核生物基因多拷貝，而原核生物含有很少的重復(fù)序列。第五章名詞解釋：1 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。2 同尾酶：有一些限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基順序不完全恒定，即識別順序不同，但酶切后產(chǎn)生同樣黏性末端的兩種酶稱為同尾酶，如BamH和Bgl 。 3 同裂酶：識別序列相同，對甲基化切點敏感性不同的兩種酶 。如:Mbo 和Sau3A共同識別序列GATC ，但對GmeATC切點,前者不能切，后者能切。 4 甲基化酶：常見的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相應(yīng)堿基甲基化。常用于使酶切位點中的堿基甲基化而避免降解，保護酶切位點。5 Klenow酶：為DNA聚合酶大片段，分子質(zhì)量為7.6KD，是經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亞基，保留的大亞基部分。這種酶只有DNA聚合酶的活性和3/外切酶的活性，但是沒有5/外切酶活性。6 堿性磷酸酶：該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質(zhì)，將DAN或RNA片段的5端的磷酸切除，產(chǎn)生5-OH7 逆轉(zhuǎn)錄酶：又稱為依賴RNA的DNA聚合酶，可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，這種酶具有聚合酶活性和3外切酶活性。8 DNA連接酶(Ligase）:是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3-OH和5-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補粘性末端或平端以及缺口修復(fù)，不能連接單鏈DNA,被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。問答：1 影響型核算內(nèi)切酶活性的因素有哪些？如何克服？答：一、DNA的純度。限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA底物的反應(yīng)速率，很大程度上取決于所使用的DNA本身的純度。在DNA制劑中的你、某些污染物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、究竟、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切酶的活性。 克服的方法為：a、增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達10單位甚至更多些；b、擴大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋；c、延長酶催化反應(yīng)的保溫時間。二、DNA的甲基化程度。限制性內(nèi)切酶不能夠切割甲基化的核苷酸序列，因此甲基化會強烈的影響酶的活性。為了避免這種問題，在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。三、酶切消化反應(yīng)的溫度。不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動范圍。大多數(shù)限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度是37C，但也有例外。溫度過高或過低都會影響酶的活性甚至最終導(dǎo)致其完全失活。四、DNA分子結(jié)構(gòu)。有些限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需的酶量要比消化線性DNA高出許多倍，而有些限制性核酸內(nèi)切酶切割他們自己處于不同部位限制位點的效率也有明顯的差別。五、限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液。不同的內(nèi)切酶對鹽濃度要求不一樣。同時還有其他一些如巰基試劑、適宜PH值、甘油體積分數(shù)等對不同的內(nèi)切酶來說要求也不同2 如何實現(xiàn)DNA粘性末端連接?單酶切點的連接如何降低本底和克服自我環(huán)化？答：用同一限制性內(nèi)切酶對載體及外源DNA作相同消化，隨后把這兩種DNA混合起來，加入DNA連接酶，便可產(chǎn)生出穩(wěn)定的雜種DNA。上述方法的缺點是限制酶切割產(chǎn)生的具有黏性末端的載體DNA分子 連接反應(yīng)混合物中會發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)，使得只含有載體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的“本底”比例大幅度上升?？朔@一缺點的方法是：用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶（BAP或CAP），預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5/-P基團，于是在連接反應(yīng)中，它自己的兩個末端就再也不能被連接酶共價連接起來了。這樣形成的雜種DNA分子的每一個連接位點中，載體DNA都只有一條鏈?zhǔn)峭庠碊NA連接上的，而另外一條鏈由于失去了5/-P基團，不能作此連接，故留下一個具有3/-OH和5/-OH的缺口，盡管如此，這樣的DNA分子仍然可以導(dǎo)入細菌細胞，并在寄主細胞內(nèi)完成缺口的修復(fù)工作。 3 基因片段與載體間的平末端連接有什么方法？答：連接平末端DNA分子的方法有兩種：一、T4連接酶連接法。T4 DNA連接酶除了能封閉具有3/-OH和5/-P末端的雙鏈DNA的缺口外，在存在ATP和加入高濃度酶的條件下，它還能夠連接具有完全配對堿基的平末端DNA分子，但其連接效率比黏性末端要低的多。二、同聚物加尾法。先用末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA分子3/-OH基團端加上同聚物尾巴，再用DNA連接酶進行連接。為了在平末端的DNA分子上產(chǎn)生帶有3/-OH的單鏈延伸，需要用5/特異的核酸外切酶處理DNA分子，以便移去少數(shù)幾個末端核苷酸。將要連接的DNA分子3/-OH基團端延伸出poly（dA）和poly（dT）或者poly（dG）和poly（dC）尾巴后，互補的尾巴就會連接起來，連接分子的裂口可通過大腸桿菌DNA聚合酶的作用予以補上，留下的單鏈缺口則可由DNA連接酶封閉。三、用化學(xué)合成的銜接物鏈接DNA分子。第六章名詞解釋：1.COS質(zhì)粒，粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進入細菌細胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細胞中進行復(fù)制。易環(huán)化和擴增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫。2.Cos位點（Cohesive-end site）： DNA為線狀雙鏈分子，兩端各有幾個堿基的單鏈互補粘性末端，通過粘性末端的互補作用形成雙鏈環(huán)形DNA。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點。3.COS細胞：用一個復(fù)制起始部位缺失的SV40突變種感染猴細胞，由于病毒DNA不能自主復(fù)制，便整合到宿主染色體DNA中，病毒DAN?,早期基因表達產(chǎn)生功能性的T抗原，這樣的細胞就叫COS細胞。問答：1 基因重組是常用哪幾種載體？其共同特點如何？ 答：常用載體的種類：質(zhì)粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動物病毒；共同特征：自主復(fù)制易于擴增分離純化有非必需區(qū)有單一酶切位點（多克隆位點）單一酶切位點：一種酶在一個載體上只有一個酶切位點；多克隆位點：一個載體上的某一個區(qū)域含有多個單一酶切位點有選擇標(biāo)記基因表達載體還應(yīng)有表達調(diào)控元件（啟動子、增強子、終止子,SD序列）2 作為理想的質(zhì)粒載體有哪些基本條件？答：作為理想的質(zhì)粒載體，應(yīng)具備以下幾個條件（1）能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子（2）具有一種或多種限制酶的單一切割位點，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的復(fù)制功能；（3）在基因組中有1-2個篩選標(biāo)記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征，（4）分子量要小，多拷貝，易于操作。第七、八章名詞解釋：1 RT-PCR：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成DNA,再以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。這樣低濃度的mRNA被擴增放大易于檢測。是一種快速、簡便且敏感性極高的檢測RNA的方法，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、克隆cDNA及合成cDNA探針、改造cDNA序列等。2 錨定PCR：在基因未知序列端添加同聚尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因配對互補結(jié)合后進行PCR擴增。3 反向PCR：用限制性內(nèi)切酶消化DNA，然后環(huán)化切割的的產(chǎn)物，再用已知序列上也可將兩端相反方向的引物進行PCR，也可將環(huán)化DNA線性化再進行PCR，是擴增未知序列的簡便方法。4原位PCR：直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增的方法。在單個細胞中進行PCR擴增，然后用特異探針進行原位雜交即可檢出含該特異序列的細胞。5 Southern印跡：將DNA經(jīng)酶切后瓊脂電泳分離，在凝膠中進行堿變性處理，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜等固體載體上，用標(biāo)記的DNA特異探針對固定在膜上的DNA進行雜交的方法。主要用來檢測DNA限制性內(nèi)切酶圖譜。6 Northern印跡：將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進行雜交。7 斑點雜交：直接將變性DNA樣品點于硝酸纖維素膜上，固定好后先預(yù)雜交，再與標(biāo)記探針雜交，然后通過高嚴謹性沖洗(低鹽高溫)，降低本底和提高特異性。探針與同源樣品雜交后，陽性結(jié)果產(chǎn)生斑點，故稱斑點雜交。 8 原位雜交：用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，使其與細胞或組織切片中核酸進行雜交檢測的方法.有兩種：與胞內(nèi)DNA的雜交和與RNA的雜交。9 Western印跡:一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)，將蛋白質(zhì)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固體載體上，然后加入抗體形成抗原抗體復(fù)合物，利用發(fā)光或顯色原理將 結(jié)果顯示到膜或底片上。10 差異顯示PCR：又稱為差異顯示RT-PCR，用于分離在不同的真核細胞中差異表達的DNA并加以克隆，產(chǎn)生不同長度的DNA片段，電泳后比較兩者差別。該技術(shù)最大的優(yōu)點是省去了cDNA克隆和隨后繁雜的克隆篩選工作。問答：1 試述PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用？舉例說明 答：一，在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。即個人識別和親子鑒定。二，遺傳病相關(guān)基因的檢測：如果堿基突變的位置與某種限制性內(nèi)切酶的識別位點相關(guān)，突變會產(chǎn)生新的或消除原有的內(nèi)切酶位點，那么用特定的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，通過電泳酶切圖譜就能直接判斷堿基發(fā)生突變與否。若某一遺傳病與這一酶切位點的存在或消失有連鎖關(guān)系，PCR-RFLP即可用于該遺傳病的診斷。用于遺傳病的產(chǎn)前診斷比如苯丙酮尿癥，鐮刀狀紅細胞貧血，杜氏營養(yǎng)不良癥，血友病。三，致病病毒的檢測：檢測HIV，HBV,HSV單純皰疹病毒,HPV人乳頭病毒,等。比如人類免疫缺陷病毒HIV-1是一種RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，根據(jù)其保守序列設(shè)計引物，先用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板產(chǎn)生cDNA，再進行PCR擴增。該法比分子雜交、血清學(xué)等診斷方法敏感性高，且操作簡便，是診斷HIV的最佳方法。直接檢測臨床標(biāo)本中HBV DNA序列的存在，對確定患者血液標(biāo)本的感染性。HCV是單股正鏈RNA病毒，可采用逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合巢式PCR法對急性丙型肝炎作出快速診斷四，腫瘤的診斷和研究如抑癌基因，癌基因的檢測，腫瘤相關(guān)病毒基因的研究等。如人類一些血液系統(tǒng)的惡性腫瘤與特定的染色體易位或基因重排有關(guān)，這種易位、重排擾亂了基因的正常調(diào)控，可導(dǎo)致原癌基因從相對靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)。應(yīng)用PCR技術(shù)能發(fā)現(xiàn)微量存在有染色體易位的癌細胞。五，感染性疾病病原體的診斷和研究。比如在針對支原體，螺旋體，衣原體，幽門螺旋桿菌等不易生長的細菌檢測。2 核酸探針標(biāo)記常用哪些方法？ 答：一、探針放射性同位素標(biāo)記法 放射性同位素的選擇：32P、35S或3H均可用于標(biāo)記DNA或RNA。32P最常用于核酸的標(biāo)記。35S適用于原位雜交和DNA序列測定。3H放射比活度低，故常用于原位雜交。 核酸探針的標(biāo)記方法缺口平移法 大腸桿菌DNA聚合酶I具有53DNA聚合酶活性，以相對應(yīng)的鏈為模板，從切口處3-OH端逐個加入新的核苷酸，此酶還具有53外切核酸酶活性，可從切口的5端逐個切去核苷酸，造成切口平移。若反應(yīng)體系中存在一種或多種標(biāo)記的核苷酸，如a-32P dNTP，則隨著反應(yīng)的進行，這些標(biāo)記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標(biāo)記的DNA探針。缺口平移法適用于標(biāo)記大于1 kb的雙鏈DNA。隨機引物法： 隨機引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用隨機引物，沿單鏈模板進行DNA的合成。末端標(biāo)記只將DNA 3端或5端標(biāo)記的方法稱末端標(biāo)記，常用的方法如下：(1)DNA聚合酶I Klenow片段末端標(biāo)記法(圖7-3)。用該酶將含有核素標(biāo)記的dNTP補平切口或粘性末端。(2) T4DNA聚合酶標(biāo)記法。加入dNTP后抑制外切活性可將標(biāo)記的dNTP進行填充標(biāo)記。(3)T4多核苷酸激酶標(biāo)記法。用該酶可將g-32P從g-32P ATP轉(zhuǎn)移至核酸的5-OH端(4)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法。將多種標(biāo)記的dNTP逐個轉(zhuǎn)移到核酸缺口中的3-OH端，形成長尾標(biāo)記。二、非放射性標(biāo)記核酸探針： 生物素標(biāo)記：生物素能以共價結(jié)合方式連接到UTP或dUTP的嘧啶環(huán)C5位置上，形成生物素化的核苷酸。其標(biāo)記方法有摻入標(biāo)記法和光敏生物素標(biāo)記方法。1. 摻入標(biāo)記法：生物素標(biāo)記的dNTP可代替相應(yīng)的單核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通過隨機引物法或缺口平移法，將生物素化核苷酸摻入到DNA分子中，獲得生物素標(biāo)記的DNA探針。2.光敏生物素標(biāo)記法：先通過連接臂將一個光敏基團連接于生物素，成為光敏生物素(photobiotin) 半抗原地高辛配基標(biāo)記方法：將Dig與dUTP(或dCTP，dCTP)相連生成Dig-dUTP復(fù)合物，再通過切口平移法和隨機引物法將其摻入到DNA上。3 核酸分子雜交在基因診斷中的應(yīng)用？舉例說明。 答：核酸雜交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的兩條單鏈核酸在一定條件下，按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程。常用的技術(shù)有Southern印跡、Northern印跡、斑點雜交、原位雜交等。通過核酸雜交技術(shù)，可以利用帶有某種標(biāo)記的已知核酸片段作為探針，去檢測未知核酸序列。因此，核酸雜交可用于基因鑒定和基因突變分析等領(lǐng)域1、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析 ：多態(tài)性（polymorphism）指基因組中特定基因座位（DNA序列）存在兩種或兩種以上狀態(tài)（等位基因），并且其中任何一個等位基因在人群中的頻率不低于1%。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是由于DNA變異（產(chǎn)生新的酶切位點或消除原有的酶切位點）導(dǎo)致在限制性核酸內(nèi)切酶酶切時產(chǎn)生不同長度的片段?？山柚鷖outhern blotting或PCR 的方法進行檢測RFLP分析與遺傳病基因診斷。人類染色體VNTR序列的RFLP分析圖譜：DNA fingerprinting。2、等位基因特異性寡核苷酸（ASO）探針雜交寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，因此可用人工合成的針對正常和突變等位基因的特異性寡核苷酸探針進行雜交，檢測點突變。3、基因表達分析 常用Northern blotting或原位雜交分析。第九章名詞解釋：1 基因組文庫：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱基因組文庫。2.cDNA文庫：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補DNA（cDNA ）建立基因文庫（gene library）。問答1 目的基因克隆時常用哪些方法分離和獲得基因？答：一 、化學(xué)合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其對應(yīng)的多肽鏈氨基酸序列。第一個核苷酸固定于不溶性的固相載體上, 然后按預(yù)定順序從該核苷酸開始，以3、5-磷酸二酯鍵與另一核苷酸進行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團 ），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物, 再用同樣的步驟與下一個核苷酸進行縮合反應(yīng), 如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來, 解除保護基, 進一步純化。二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法擴增目的基因：以DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板, 利用酶促反應(yīng)（Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的4種dNTP由引物沿模板從53按堿基配對原則, 形成與模板DNA互補的半保留復(fù)制鏈, 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)25-30個循環(huán)產(chǎn)物呈 2n指數(shù)擴增，由pgg（紫外可見），可獲得基因片段三、建立基因組DNA文庫：分離真核生物中某種DNA成分, 通常是分離供體細胞中的染色體DNA，酶切后，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立包含有真核細胞染色體DNA片斷的克隆株, 這種克隆株群體稱基因組文庫。四、構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補DNA（cDNA ）建立基因文庫（gene library）五、其他方法 構(gòu)建差示文庫篩選特殊基因差示文庫； mRNA差異顯示法獲得目的基因 ； 基因改造可獲得新型目的基因2.構(gòu)建基因組文庫的意義及構(gòu)建過程如何？答：意義：提供全套遺傳信息, 即完整的基因組DNA,可以研究基因組中5端控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列, 內(nèi)含子的分布和作用, 以及重復(fù)序列的數(shù)量分布及大小 過程： 分離純化基因組DNA,提取哺乳動物細胞染色體DNA； 制備全部基因組的DNA片斷。機械斷裂法:用超聲波或高速攪拌DNA溶液斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端，因此插入載體之前還需要進行修飾加工，少用限制性內(nèi)切酶降解（鳥槍法）過去用EcoR,現(xiàn)在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載體匹配的粘末端，可以直接與處理過的載體連接。 DNA片斷與載體的連接包裝 常用載體：粘性質(zhì)粒 噬菌體 酵母人工染色體基因組DNA +粘性質(zhì)粒重組DNA轉(zhuǎn)化細菌菌落 基因組DNA +噬菌體重組DNA包裝成噬菌體感染細菌噬菌斑1個克隆含有基因組的某個片段，整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。3 構(gòu)建cDNA文庫的意義？常用載體及構(gòu)建過程如何？答：意義：通過構(gòu)建cDNA文庫能直接分離到生命活動過程中的一些調(diào)控基因及了解這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系因此cDNA文庫的構(gòu)建是基因克隆的重要方法之一，從cDNA文庫中可以篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達。它是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的工具。常用載體是質(zhì)粒（噬菌體）。過程：1.制備mRNA 1)取材：mRNA約占總RNA的15，所以應(yīng)選用目的基因mRNA表達最豐富的組織細胞為材料來源，如獲胰島素基因，由應(yīng)以胰島細胞為原始生物材料，細胞因子基因應(yīng)選用經(jīng)抗原或絲裂原刺激培養(yǎng)的淋巴細胞為材料；2)從總的RNA中分離mRNA：將提取的mRNA在寡聚脫氧胸苷酸 oligo(dT) 纖維素中進行親和層析 2.第一股 cDNA合成 1）以O(shè)ligo(dT) 為引物：從模板3末端開始，沿模板的35方向合成, 對于較長的mRNA分子很難得到全長cDNA ；2）隨機引物：以68個核苷酸為隨機引物，從mRNA的不同結(jié)合點合成全長cDNA第一鏈（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成 自身引導(dǎo)法； 置換合成法； 外加引物合成法 4.cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細胞4 采用單酶切點法克隆基因時有什么缺點？如何克服？答：（1）高背景：載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后，載體分子易于自我環(huán)化，既不利于目的基因的重組連接，大大降低陽性克隆效率，又可使非重組性載體造成高背景。應(yīng)對方法：通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的5-p以抑制DNA的自我環(huán)化。（2）雙向插入：經(jīng)單一限制核算內(nèi)切酶切割的目的基因和載體，因兩者的粘性末端是相同的，因此在連接反應(yīng)中，目的基因可發(fā)生雙向插入。載體對目的基因的表達是有方向的，而目的基因可雙向與之連接，這種連接如以克隆目的基因片段為目的則沒有影響，若以表達為目的，就要對插入的片段進行方向鑒定。應(yīng)對方法：若構(gòu)建表達DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以使定向克隆。5 目的基因與載體的連接方法有哪些？基因重組時在倆個酶切位點中其中有一個不相匹配時，你如何解決連接問題？答：連接方法： 粘性末端的連接：1單酶切點的粘性末端：目的基因片段與載體由相同的單一限制性內(nèi)切酶消化酶切后，兩者的末端均具有相同的粘性末端，然后兩者相互連接。 2.雙酶切片段的定向克隆使外源性DNA片段定向插入到載體分子中的克隆，是用兩個不同的限制性內(nèi)切酶切割目的基因，使之產(chǎn)生兩個不同的粘性末端，載體也用相同的兩個限制性內(nèi)切酶將載體切開，此時載體不僅不會發(fā)生自我環(huán)化，而且只能在DNA連接酶的作用下與目的基因的相應(yīng)的粘性末端互補連接 平端連接法：1.同聚物加尾法；2.用銜接物連接法；3.適配子連接法（帶有相應(yīng)酶切點的粘性末端）；4.TA克隆法 TaqDNA聚合酶在擴增目的基因DNA的同時, 能不依賴模板而在擴增產(chǎn)物兩3端加上兩個游離的“A”。 6 試述T-A克隆法的原理和用途。答：T-A克隆法是一種對PCR產(chǎn)物直接克隆的技術(shù)。TaqDNA聚合酶在擴增目的基因DNA的同時, 能不依賴模板而在擴增產(chǎn)物兩3端加個游離的“A”。這樣只要載體切口處人工加上游離的“T”，PCR產(chǎn)物即可與載體連接。這種技術(shù)使得PCR產(chǎn)物的克隆變得非常簡單。第十章1 轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細胞（或細菌）的過程稱轉(zhuǎn)染。2 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細菌的過程稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。3 轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷毎?。使原來細胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化，常見的轉(zhuǎn)化方法有：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法4 -互補：原理：所謂基因內(nèi)互補作用，在LacZ體系中,是指二個彼此互補的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無-半乳糖苷酶活性），它們編碼產(chǎn)生的無活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個突變體之間通過肽互補作用可呈現(xiàn)有功能的-半乳糖苷酶活性, 進而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而產(chǎn)生半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-氯-青定藍, 使菌落呈現(xiàn)出藍色反應(yīng)。問答1 重組DNA向受體細胞的導(dǎo)入方法有哪些？ 答：一.轉(zhuǎn)化 : 以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷毎?。轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細胞（感受態(tài)細菌）從周圍介質(zhì)中吸收來自另一種基因型細胞的DNA, 進而使原來細胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。常見轉(zhuǎn)化方法有 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法； 化學(xué)轉(zhuǎn)化法； 電穿孔法。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法:除去細胞壁后加外源DNA，經(jīng)吸收恢復(fù)再生培養(yǎng)，如枯草桿菌。 化學(xué)轉(zhuǎn)化法:將對數(shù)生長期的細菌在0下, 用預(yù)冷的CaCl2溶液低滲處理, 以使菌體的細胞壁和細胞膜通透性增加, 菌體膨脹成球形。DNA易于進入細菌的細胞內(nèi) 。電穿孔法：利用高壓脈沖電場, 在宿主細胞表面形成暫時性的微孔, 質(zhì)粒DNA可乘隙而入, 在脈沖過后, 微孔復(fù)原 。二、通過接合作用傳遞質(zhì)粒DNA：質(zhì)粒由F+向F菌的轉(zhuǎn)移過程叫接合作用傳遞質(zhì)粒, 又稱質(zhì)粒的接合傳遞。凡帶有在染色體上整合F質(zhì)粒的細菌又稱高頻重組株系（Hfr株系）。Hfr株系不穩(wěn)定，F(xiàn)質(zhì)粒可發(fā)生接合傳遞質(zhì)粒DNA, F+菌株可失去F質(zhì)粒, F菌也可獲得F質(zhì)粒, 其轉(zhuǎn)移難以人為控制,又不穩(wěn)定， 通常不用作克隆載體。三、通過轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞遺傳物質(zhì)。 轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細胞（或細菌）的過程稱轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細菌的過程稱轉(zhuǎn)導(dǎo)。原理：1.重組外源基因的噬菌體DNA, 體外包裝成噬菌體，感染宿主菌，同時導(dǎo)入外源基因。2.噬菌體的主動感染將含有外源DNA片段的重組噬菌體DNA導(dǎo)入宿主菌體內(nèi)。2如何利用抗體標(biāo)記基因篩選陽性克?。看穑捍蠖鄶?shù)質(zhì)粒載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有抗氨芐西林基因，抗四環(huán)素基因等，當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化抗性細胞后，所有轉(zhuǎn)入載體的細菌都獲得了抗性，被轉(zhuǎn)化的陽性克隆菌能在相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長，并形成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的原宿主菌則不能生長，據(jù)此可篩選攜帶外源基因的重組DNA轉(zhuǎn)化子。在含有兩個抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個抗性基因，就會導(dǎo)致該抗性基因的功能失活，用兩個分別含不同抗生素藥物的平板進行對照篩選，可篩選出陽性重組子克隆菌體。3、 如何從所克隆到的基因重組體載體中鑒定基因的存在和正確性？答：（1）重組子大小鑒別篩選：重組子中裝有一段較大分子量的外源性基因，其分子量明顯比原載體大很多，因此可將提取的重組載體和原載體，用一種限制性內(nèi)切酶消化后，直接進行凝膠電泳，從而據(jù)其電泳特性而初步篩選重組子中是否插入外源基因片段。（2）酶切鑒定：對于篩選出的具有重組子的菌株，經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別提取原載體或重組載體DNA，根據(jù)已知重組時外源基因兩端的酶切位點，用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，就可以看出載體中是否含有目的基因片段，以及有DNAmarker條帶對比分析可得知插入基因片段的大小。（3）PCR篩選法：利用能與插入基因片段兩端互補的特異引物，以少量抽提的重組子DNA為模板進行PCR分析，能擴增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子（4）原位雜交：在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置原位不變的轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位溶菌裂解，DNA變性和用特異探針進行雜交，從而鑒定出含有重組子的菌落或噬菌斑。第十一章1.基因突變：是基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變（通常它只涉及基因中部分序列的變化），并引起個體表型的改變, 而使生物體發(fā)生遺傳性變異。2.同義突變：是指堿基被替代后, 沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列, 這是與密碼子的簡并性相關(guān), 如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位堿基互相替代后其編碼表達的產(chǎn)物均為亮氨酸,因此這種突變不產(chǎn)生突變效應(yīng)。 3.錯義突變：是指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸的序列改變。有些錯義突變嚴重影響到蛋白質(zhì)活性甚至完全失去活性，從而影響了表型。如果該基因是必需基因，則該突變?yōu)橹滤劳蛔儭?4.無義突變：某個堿基的改變可使某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子。如賴氨酸的密碼子AAG突變?yōu)榻K止密碼子TAG,使肽鏈合成過早終止, 因而蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般沒有活性。若是發(fā)生在基因DNA的3末端處, 它所表達產(chǎn)生的多肽常有一定活性或有部分活性, 這種突變又稱為滲漏變型（leaky mutation）。 第十二章名詞解釋：1 cdk：即周期素依賴激酶，調(diào)節(jié)細胞周期的有絲分裂促進因子的組成成分，具有蛋白激酶活性的催化亞單位，活性依賴于同周期素結(jié)合。2 CD：即周期素依賴激酶抑制蛋白，是一種具有抑制cdk功能的新蛋白，能在細胞周期的特定時刻負調(diào)控cdk活性而控制細胞周期的進程。3 周期素：調(diào)節(jié)細胞周期的有絲分裂促進因子，依據(jù)其在周期中調(diào)控階段的不同，將其分為G1期和S期和M期周期素，有一段高度保守的氨基酸序列與cdk互相結(jié)合，其合成與cdk結(jié)合或降解起到對細胞周期的調(diào)節(jié)作用。問答：1 細胞周期調(diào)控檢查站有哪幾種？各自有何功能？ 答：人及哺乳動物細胞中存在三個細胞周期控制點，即決定G期的G1調(diào)控點，決定S期的S控制點，決定M期發(fā)生的M控制點。G1控制點：在G1期哺乳動物細胞趨向有三種可能性連續(xù)分裂細胞不斷突破G1期至S期。通過G2期和M期連續(xù)分裂，2.停留在G1期的暫不增殖細胞。3.無增殖力細胞，在G1期停止走向終末分化。在正常情況下哺乳動物體內(nèi)的大部分細胞是處于非增殖狀態(tài)的休止期(G0期)，只在一定條件下才進入G1期，只有通過限制點的細胞才能進入SG2M期，R點是控制細胞增殖的關(guān)鍵。S控制點：完成G期后，S期激活因子啟動DNA復(fù)制，進入S期完成所有DNA復(fù)制以后進入G2期。M控制點：細胞進行有絲分裂需要M期激酶的活化。只有產(chǎn)生有活性的二聚體激酶，使細胞進入M期。M后期M期激酶失活，經(jīng)前期。中期。后期。末期后分裂成兩個子細胞，結(jié)束M期。 2 試述細胞周期調(diào)控異常與惡性腫瘤發(fā)生的相關(guān)性。 答：細胞周期素和CDK等細胞周期相關(guān)蛋白過表達或者缺陷，特別是那些決定細胞有G1進入S期的蛋白若表達異常，使細胞周期進程超越或突破細胞周期的控制點，細胞不能正常發(fā)生細胞自發(fā)產(chǎn)生的細胞死亡，衰老或分化，從而造成細胞惡化增生，形成惡性腫瘤。P53，Rb等抑癌基因的突變或缺失，與許多惡性腫瘤的發(fā)生進展和不良預(yù)后相關(guān)，如某些生長因子及其受體的高表達與癌基因異常激活有關(guān)，特別是一些與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白酶的異常活化，以抑制細胞凋亡基因的異常表達，均與細胞的惡性變相關(guān)。第十三章1 PCD：即程序性細胞死亡，又叫細胞凋亡，是由基因編程控制的細胞主動參與的自殺過程，是細胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一種生理性調(diào)節(jié)機制，在機體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。2 DNAladder：細胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活，染色質(zhì)DNA被有規(guī)律的切成180-200的整倍數(shù)的核小片段，在凝膠電泳中呈條帶狀，稱之為DNAladder。3 AP峰：即凋亡峰，經(jīng)DAPI即4-6-二脒基二苯基吲哚熒光染色，可見顆粒狀的熒光碎片(核內(nèi))，在流式細胞檢測細胞周期時可測出亞G1峰，稱“G1”期的AP峰。4 Caspase3：又稱Cpp32/Yama/Apopain，可作用于多聚ADP核糖多聚酶PARP使之降解為89KD和24KD。破壞PARP修復(fù)DNA功能，引起細胞凋亡。問答1 何謂細胞凋亡？細胞凋亡與細胞壞死有何不同？ 答：是由基因編程控制的細胞主動參與的自殺過程，是細胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一種生理性調(diào)節(jié)機制，在機體中承擔(dān)著重要的調(diào)控作用。不同：細胞凋亡是細胞主動死亡的過程，具有特征的形態(tài)和生化改變，是由基因控制的個別細胞發(fā)生的自主有序的死亡；是有目的有選擇性的自我消亡過程，是一種保證生命進化的淘汰機制。2 Bcl-2，Bcl-x，Bax三者如何調(diào)控細胞死亡？答：（一）Bcl-2基因：又稱為抗凋亡基因，其表達產(chǎn)物可增加細胞對多種促凋亡因素的抗性，而延長細胞的壽命，其機制有抗氧化作用；影響胞內(nèi)鈣離子的重新分布；與凋亡基因bax的產(chǎn)物形成異源二聚體bax/bcl-2而競爭抑制細胞凋亡的bax/bax同源二聚體的形成。 （二）bcl-x基因：其表達的mRNA可經(jīng)不剪切形成bcl-XS和bcl-XL兩個蛋白，bcl-XS促進細胞凋亡，bcl-XL抑制細胞凋亡。（三）bax基因：表達產(chǎn)物常以bax/bax同源二聚體誘導(dǎo)細胞凋亡，起加速凋亡的作用。3 細胞凋亡常用哪幾種特異檢測方法來證明細胞凋亡？答：(一）光鏡的形態(tài)學(xué)觀察：普通光鏡：細胞園縮，核濃縮、破碎 透射光鏡：凋亡小體（二）細胞DNA提取物的核酸電泳：電泳后經(jīng)過溴乙錠染色，在紫外光下呈梯形條帶。（三）MTT法：細胞凋亡，細胞琥珀酸脫氫酶下降，經(jīng)過MTT呈蘭紫色顆粒下降，經(jīng)過酸化異丙醇溶解后，于490nm波長下測OD值，計算IC50。(四)熒光法：斷裂DNA可被DAPI著色后形成核斷裂顆粒熒光。(五)流式細胞儀檢測法測定DNA細胞經(jīng)乙醇固定后，采用碘化丙錠熒光染料，通透細胞后用流式細胞儀檢測：1、測定DNA總量變化 2、測定細胞周期變化S期消失 3、測定凋亡峰于細胞G1期前出現(xiàn)亞G1峰，即凋亡峰。根據(jù)凋亡峰占總DNA的比例測定凋亡百分率。（六）Bcl-2、Bax胞漿蛋白檢測：1、免疫組化法：細胞固定滴片，用穿孔素打孔。加Bcl-2抗體，洗滌后加酶標(biāo)二抗顯色鏡檢。2、流式細胞儀檢測法Bcl-2/Bax：多聚甲醇固定細胞用TB穿孔液打孔加入Bcl-2/Bax單抗洗滌后加入熒光標(biāo)記二抗洗滌后FCM檢測含量。（七）Bcl-2/Bax基因表達檢測：提取細胞mRNA加逆轉(zhuǎn)錄酶加入引物，Taq酶PCR擴增cDNA定量檢測cDNA量。（八）其他方法：1、磷脂酰絲氨酸（ps ）測定2、斷裂DNA位點的原位標(biāo)記試驗第十四章問答：1 試述G蛋白的作用和特點 答：作用：G蛋白是連接受體與效應(yīng)器之間的中介物質(zhì)，是一種酶。由于在中介反應(yīng)過程中與鳥苷酸(GTP和GDP)結(jié)合故稱為G蛋白。G蛋白由a、b和g三個亞基構(gòu)成。具有酶催化活性的a亞基與鳥苷酸結(jié)合后，可催化GTP變?yōu)镚DP的反應(yīng)。b和g亞基是疏水蛋白，總是以gb復(fù)合物的形式存在于細胞膜的內(nèi)表面。G蛋白中介的反應(yīng)可分為四個階段：第一階段為靜止態(tài)。含a、b和g亞基。第二階段，激動劑分子與受體結(jié)合，使受體的構(gòu)象變得易于與G蛋白結(jié)合。第三階段，a/GTP在細胞膜內(nèi)擴散，與不同的靶蛋白效應(yīng)酶或離子通道相連，引起不同的生物效應(yīng)。當(dāng)GTP酶水解a/GTP成a/GDP時，效應(yīng)過程終止。第四階段是a/GDP從效應(yīng)靶蛋白上解離，a亞基與gb亞基重新結(jié)合，形成gba復(fù)合物，從而完成了一個循環(huán)。每個循環(huán)過程起到信號放大的作用。G蛋白偶聯(lián)型受體的特點：1.都是由七個跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成的。2.第五和第六跨膜區(qū)之間的第三內(nèi)環(huán)較其他環(huán)大，而且是G蛋白的結(jié)合區(qū)。3. G蛋白是一個三聚體，由a、b和g亞基組成，a亞基具有GTP酶活性。a亞基的多樣性決定了受體功能的多樣性和專一性。4.G蛋白的三聚體與激動劑結(jié)合的受體偶聯(lián)后，a亞基解離并激活效應(yīng)器(酶或離子通道)。5.當(dāng)a亞基結(jié)合的GTP被水解，激活效應(yīng)器的反應(yīng)即終止，此時a亞基可又與gb亞基結(jié)合。2 試述受