流式細(xì)胞儀操作規(guī)程SO.doc

. 流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄1：淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定及絕對(duì)計(jì)數(shù)2：活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的檢測(cè)3：HLA-B27測(cè)定4：CD55CD59測(cè)定5：干細(xì)胞檢測(cè)和絕對(duì)計(jì)數(shù)6：白血病免疫分型測(cè)定7：淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4測(cè)定8：細(xì)胞周期分析9：活化血小板檢測(cè)10：血小板抗體測(cè)定11：紅細(xì)胞抗體測(cè)定12：粒細(xì)胞抗體測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號(hào)：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁(yè)) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個(gè)人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞表面抗原分布如下：T淋巴細(xì)胞：CD3+；B淋巴細(xì)胞：CD3-，CDl9+；輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+；NK細(xì)胞：CD3-CDl6+56+等。根據(jù)淋巴細(xì)胞膜上CD分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞儀可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群，利用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count組會(huì)自動(dòng)得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0109/L之間。若10.0109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.0109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD45/4/8/3 No.6607013 CD45/56/19/3 No.6607073 CD4/8/3 No.IM1650 同型對(duì)照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機(jī)測(cè)樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）6)需要做絕對(duì)計(jì)數(shù)的指標(biāo)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count(務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機(jī)) 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對(duì)值）操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV10.0109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.0109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646 CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM1834 CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 ） 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機(jī)測(cè)樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV5-10%提示排斥、持續(xù)增加提示應(yīng)作病理活檢；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常機(jī)體內(nèi)各種T細(xì)胞之間以及與其他免疫細(xì)胞之間在數(shù)量上保持一定比例，如果它們之間比例失調(diào)就會(huì)引起免疫功能紊亂，將導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生，檢測(cè)淋巴細(xì)胞各種亞群有助于疾病的診斷、預(yù)后和治療。CD45RA、CD45RO均為T細(xì)胞的輔助分子，CD45RA+純真型T細(xì)胞當(dāng)免疫力下降時(shí)減少；CD45RO+記憶型T細(xì)胞對(duì)第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中減少。方案（Protocol）同淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Result）HLA-B27測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測(cè)定HLA-B7陰性而HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和所占的百分比。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0109/L之間。若10.0109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.0109/L，應(yīng)分離單個(gè)核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 1ML 28 (HLA-B27/HLA-B7 No.IM1502 同型對(duì)照IgG1IgG2a No.IM1389) 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)洗、離心、上機(jī)測(cè)樣（備注： 測(cè)B27一定要至少洗一遍方可上機(jī)檢測(cè)）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告陰陽(yáng)性操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV90%。 臨床意義HLA復(fù)合體位于第6號(hào)染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長(zhǎng)度約3000-4000KB，占人體整個(gè)基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I類基因中B位點(diǎn)上的一個(gè)等位基因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎。HLA-B27基因?qū)儆谛蚆HC基因，所有有核細(xì)胞上均有表達(dá)，尤其是淋巴細(xì)胞表面含量豐富，人們發(fā)現(xiàn)HLA-B27抗原表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎有高度的相關(guān)性，超過(guò)90%的強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表達(dá)陽(yáng)性，而正常人群中僅5-10%的認(rèn)為陽(yáng)性。由于強(qiáng)直性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測(cè)在疾病的診斷中具有重要意義，HLA-B27的檢測(cè)是該疾病診斷和鑒別診斷中的一個(gè)重要指標(biāo)。方案（Protocol）1.選參數(shù)點(diǎn)擊點(diǎn)擊 鍵入文件名，點(diǎn)擊Save2.畫圖 結(jié)果1. positive (+) X-Mean=17.12. negative(-) X-Mean=1.2 X-Mean=5.8CD55/CD59測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明，紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55和CD59分子的表達(dá)量和缺乏表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量對(duì)PNH診斷和鑒別有重要意義。血細(xì)胞(紅細(xì)胞和白細(xì)胞)通過(guò)膜上的抗原分子與熒光素標(biāo)記的CD55或CD59的多克隆抗體結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD55或CD59表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 1ML 28 (CD59-FITC No.IM3457 CD55-PE No.IM2726) 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備:(一)白細(xì)胞CD55CD59檢測(cè)1準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記。分別向二管中加入樣品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）3離心后分別加入CD55/CD59 10ul和相應(yīng)的同型對(duì)照10ul。避光20-30分鐘。4洗滌離心 5上機(jī)測(cè)樣(二)紅細(xì)胞CD55CD59檢測(cè) 1準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記 2分別加入CD55CD59 10ul和相應(yīng)的同型對(duì)照10ul。 3向二管中加入1：200稀釋的樣品100ul（可根據(jù)紅細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整），避光20-30分鐘。 4洗滌離心。5混勻、上機(jī)測(cè)樣。 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV97% CD5997% PNH的臨界值：RBC CD5995% WBC CD5990% PNH的診斷值：RBC CD5991% 大部分80% 中性粒細(xì)胞CD5984% 臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時(shí)CD55和CD59明顯減低和缺如。方案（Protocol）(同HLA-B27) 結(jié)果1.RBC: normal 2.RBC: abnormal 3.WBC干細(xì)胞檢測(cè)和絕對(duì)計(jì)數(shù)方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與干細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0109/L之間。若10.0109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.0109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)需要做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count(務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機(jī))6)上機(jī)測(cè)樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對(duì)值）操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV10.0109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.0109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-樣本制備： 細(xì)胞膜表面抗原1首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體。2首先每管中加入5ul CD45-PC5抗體。3然后，按管上的標(biāo)記，加入相應(yīng)抗體各10ul(注意：必須是FITC和PE標(biāo)記的抗體搭配)4各管中加入標(biāo)本(骨髓或外周血)30100u1(根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定)，振蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）細(xì)胞漿和核抗原1準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對(duì)照。2首先每管中加入標(biāo)本(骨髓或外周血)100ul(根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定)，5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3每管中加入固定液100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4各管中加入PBS4ml。5300g離心5分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜劑100ul，輕輕混勻，室溫避光5分鐘。 7加抗體，陰性對(duì)照管中加入10ul，其余各管加入相應(yīng)抗體各10ul，室溫避光15分鐘。8各管中加入4mlPBS，振蕩混勻。9300g離心5分鐘后，棄去上清液。10各管中加入PBS500ul，振蕩混勻。11上機(jī)測(cè)樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV2 參考值 CD34+5% MPO+5% 粒系20% 淋系10.0109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若4.0109/L，應(yīng)分離單個(gè)核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系(自配) 成分：刺激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國(guó)SIGMA公司。 單克隆抗體 ( BeckmanCoulter公司) CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-FITC(No.IM2716)。 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 細(xì)胞培養(yǎng)與染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMIl640洗滌一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中，5C02 37孵育18小時(shí)，取出后以PBS洗一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分成兩管，其一為測(cè)定管加入lOul抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型對(duì)照，室溫避光20分鐘，PBS洗滌一次，待測(cè)。流式細(xì)胞儀測(cè)定 打開流式細(xì)胞儀及氬激光光源(488nm)預(yù)熱20min，同時(shí)儀器自動(dòng)初始化；用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測(cè)標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測(cè)50000以上細(xì)胞，在前向散射光(FS)和測(cè)向散射光(SSC)散點(diǎn)圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然后分析CD4陽(yáng)性細(xì)胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表達(dá)。 淋巴細(xì)胞在FSSSC散點(diǎn)圖中位置，即A門內(nèi)細(xì)胞； A門內(nèi)CD4陽(yáng)性細(xì)胞，即B門內(nèi)細(xì)胞； B門內(nèi)TH細(xì)胞亞群分布： 1區(qū)數(shù)值-Th 1細(xì)胞 (%) 4區(qū)數(shù)值-Th 2細(xì)胞 (%) 2區(qū)數(shù)值-Th 0細(xì)胞 (%)報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV2 正常參考值 Thl(IFN-)：17.395.52% Th2(IL-4)：1.500.44% ThO ：0.510.26% 臨床意義淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子：Thl細(xì)胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-為Thl最特異分泌的細(xì)胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來(lái)區(qū)分Thl與Th2。Thl為IFN-+，Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)(人的正常生理狀態(tài)、即未受到任何刺激下Th0分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅含有極少量的Thl和Th2細(xì)胞，這時(shí)我們所能檢測(cè)的胞內(nèi)的IFN-和IL-4也微乎其微。當(dāng)Th細(xì)胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中Th0即會(huì)向Thl或Th2大量分化，此時(shí)我們檢測(cè)到的IFN-和IL-4也較多。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)實(shí)際上是檢測(cè)Th細(xì)胞對(duì)刺激素刺激的反應(yīng)能力。方案（Protocol） 細(xì)胞周期分析方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等) 與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量標(biāo)本采集與處理 檢測(cè)對(duì)象 實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細(xì)胞 要求 1實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液和培養(yǎng)細(xì)胞如果不能立即做應(yīng)用冷乙醇固定，20可保存23個(gè)月，70可保存半年以上。 2樣本計(jì)數(shù)應(yīng)在1.0106/ml 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：DNA-Prep試劑系統(tǒng) 液體 28 （No.6607055） （包括DNA-Prep LPR和 DNA-Prep 染料） 2：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 3：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 4：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 灌洗液或培養(yǎng)細(xì)胞1 PBS洗，稀釋為1.0106/ml，取100ul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep 染料1ml,室溫避光15分鐘。2 過(guò)300目濾網(wǎng)，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)體（腫瘤）組織1 單細(xì)胞懸液制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。（如果是淋巴瘤只需用生理鹽水沖即可）。將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，以500800轉(zhuǎn)離心沉淀2分鐘。2 染色：同上3 上機(jī)檢測(cè)石蠟塊1 脫蠟水化：石蠟塊切成50um厚，35片，放入二甲苯中室溫放置24小時(shí)，更換二甲苯室溫再置24小時(shí)。取出加無(wú)水乙醇10分鐘，依次加95乙醇、70乙醇、50乙醇及雙蒸水各10分鐘。2 單細(xì)胞懸液制備及染色：同上3 上機(jī)檢測(cè)報(bào)告結(jié)果 報(bào)告各期的百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV450109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若150109/L，應(yīng)多采集進(jìn)行富集達(dá)到流式檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)。 4溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：一抗 凍干 0.2mg -20小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285) 二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L) (No.IM0819)凍干 1mg -20 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,棄上清，重復(fù)一次。3) 分別向試管中加入準(zhǔn)備好的10u1含血小板的PBS（血小板的量約為106）（血小板若在正常范圍，稀釋到原量直接取10u1。）。4) 分別向已編好號(hào)的試管中依次加入一抗和二抗（設(shè)對(duì)照）5)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘6)洗或不洗，上機(jī)測(cè)樣全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,棄上清，后同上3）6）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV2 參考值 IgA2.98% IgG3.04% IgM3.0% IgD2.91% 臨床意義為免疫性血小板減少性紫癜(ITP)診斷、治療、預(yù)后估計(jì)的重要指標(biāo)，在ITP、膠原性疾病時(shí)升高。方案（Protocol） 紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定（紅細(xì)胞抗體）方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理