實驗一 培養(yǎng)基的配制與滅菌技術.docx

實驗一 培養(yǎng)基的配制與滅菌技術一、目的要求1 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2 學習高壓滅菌鍋的操作方法。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而NACL提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96時溶化，一般實際應用時在下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時凝固，通常不被微生物分解利用。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。高氏1號培養(yǎng)基是分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基，是由可溶性淀粉作碳源，KNO3作氮源，NaCl，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O，F(xiàn)eSO4.7H2O為微生物提供鈉、鉀、磷、鎂、硫等離子。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。通常為15磅/英寸2 (121.3)滅菌1520分鐘；不耐高壓的培養(yǎng)基則可采用流通蒸汽滅菌或間歇滅菌。含糖培養(yǎng)基用112.6（8磅/英寸2）滅菌15分鐘。紫外線滅菌是用紫外線燈進行的，紫外線殺菌機制主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA的復制；由于輻射能使空氣中的氧電離成O再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成過氧化氫H2O2，O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。三、器材天平，高壓蒸汽滅菌鍋，電烘箱，1mol/L NaOH,1mol/L HCl，培養(yǎng)皿，試管，吸管，酒精燈，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，接種環(huán)，牛角匙，pH試紙(pH5.59.0)，棉花，紗布，牛皮紙，記號筆，麻繩。四、操作步驟1 稱量培養(yǎng)基的配方見附錄。2 溶化（1） 在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。待藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。（2） 配制高氏1號培養(yǎng)基時，用少量冷水將淀粉調成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化，再稱取其他各成分依次逐一溶化，對微量成分FeSO4.7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4.7H2O配成0.01g/ml，再在1000ml培養(yǎng)基中加入1ml的0.01g/ml的貯備液即可。（3） 將馬鈴薯塊放入少于所需水量的水中，在石棉網(wǎng)上加熱，攪拌以免馬鈴薯塊糊在燒杯底，煮沸20分鐘，經(jīng)常補充水分，將馬鈴薯及煮沸液經(jīng)4層紗布過濾，補充水分到所需體積，加入稱量的糖。3 調pH在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達7.6。反之，則用1mol/LHCl進行調節(jié)。注意pH值不要調過頭，以免回調，否則，將會影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。對于有些要求pH值較精確的微生物，其PH的調節(jié)可用酸度計進行。4.分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內或三角瓶內（見圖1）。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面；分裝三角瓶的量以不超過容積達一半為宜。5.加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能。應使棉塞長度的1/3在試管口外，2/3在試管口內。4 生理鹽水的配置分裝 用吸管量取相應體積的生理鹽水。圖1 分裝 7. 包扎加塞后，將全部試管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一層牛皮紙或報紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱，日期。8. 滅菌（1） 首先將內層滅菌筒取出，再向外層鍋加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。（2） 放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞，（3） 加蓋，將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓。（4） 通電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。（5） 滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。9. 擱置斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右，將試管棉塞端擱在木條上（見圖2）。10. 倒平板將培養(yǎng)基溶化，待冷至5560時，將幾種培養(yǎng)基分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。手持法（見圖5）：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶，置火焰旁，左手拿平皿并松動試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出。如果試管內或三角瓶內的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后，輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即可成平板。皿架法（見圖4）：將平皿疊放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖均后制成平板。11.無菌試驗將已滅菌的培養(yǎng)基，置無菌試管內，放在37孵箱中培養(yǎng)24小時，將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)24小時，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。五、實驗報告1.如何檢驗滅菌后培養(yǎng)基是否合格？2.高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么要待降到0時才能打開排氣閥，開蓋取物？附錄 培養(yǎng)基的配置一、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌用）牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 1520g 水 1000ml pH 7.4-7.6配置時，按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很易吸潮，在稱取時動作要迅速。牛角匙稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品。將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補足所失的水分。二、高氏1號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4.3H2O 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 瓊脂 1520g 水 1000mlpH 7.4-7.6配置時，淀粉單獨稱量在50ml小燒杯中。三、馬鈴薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌用）馬鈴薯 200g 蔗糖 20g瓊脂 1520g 水 1000mlpH 自然 配置時，馬鈴薯去皮，切成小塊，稱量。實驗二 土壤微生物的分離一、目的要求1 學習無菌操作技術2 掌握幾種分離純化微生物的基本方法二、基本原理 在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。一般根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求的不同，供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。土壤是我們開發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。三、器材肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，10酚，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素，菜園土，玻片，酒精燈，革蘭氏染液。四、操作步驟（1） 制備土壤稀釋液稱取土樣10g，放入盛90ml生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約20分鐘，將菌分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一只無菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一裝有9ml無菌水的試管中，以此類推，制成101，102，103，104，105，106稀釋度的土壤溶液。（2） 涂布或劃線（a） 將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上104，105，106三種稀釋度，然后用三支1ml無菌吸管分別由104，105，106三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml對號放入寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃推子在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻（見圖1）。（b） 用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線 34條，再轉動培養(yǎng)基約70。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后將接種環(huán)搭在平行線上作第二次平行劃線，同樣作第四次劃平行線，劃線結束后，蓋上皿蓋（見圖2）。（3） 培養(yǎng) 將涂布或劃線后的培養(yǎng)基平板倒置于不同溫度的溫箱中培養(yǎng)并觀察生長情況。（4） 挑菌將培養(yǎng)后長出的單個菌落，挑取接種到斜面上，分別置28和37溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔，顯微鏡涂片觀察判斷是否是單一的微生物，若有其他雜菌，再一次進行分離純化。（5） 鑒定對分離得到的細菌的進行生理生化反應測定。參考相關微生物鑒定手冊。五、實驗報告1、在選擇培養(yǎng)基上是否分離到細菌？根據(jù)在1，101，102三種稀釋度平板上分離得到的單菌落，確定最佳稀釋濃度。2、在平板劃線法中，為什么每次都需將接種環(huán)上的剩余物燒掉？3、為什么要將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)？附:一、絲狀真菌（霉菌）的分離純化（1）分離源: 菜園土（2）培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g 蔗糖 20g 瓊脂 15-20g 水 1000ml 馬丁培養(yǎng)基：蛋白胨 5g MgSO47H2O 0.5g葡萄糖 10g KH2PO4 1.0g瓊脂 18-20g H2O 1000ml 加入孟加拉紅水溶液3.3ml，121，20min滅菌。使用前，每100 ml培養(yǎng)基加入1%鏈霉素溶液0.3 ml。 查氏培養(yǎng)基：蔗糖 30g FeSO4 0.01gNaNO3 2.0g MgSO47H2O 0.5gK2HPO4 1.0g H2O 1000mlpH值 自然 115， 滅菌20min（3）方法將分離用的樣品，用無菌水制成一系列10倍稀釋懸液。根據(jù)樣品來源選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基。分離土壤樣品較多采用馬丁瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；霉變材料及河塘泥、生物膜等樣品中霉菌的分離多采用查氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、或馬丁氏瓊脂等。用無菌吸管分別吸取0.5 - 1ml不同稀釋度的菌懸液，接入無菌平板，按常規(guī)的混菌法或涂布法進行分離操作。每個稀釋度一般做三個平皿。置于2328培養(yǎng)37天，待菌落長好作進一步分離純化。依據(jù)菌落形態(tài)、質地和正反面顏色，判斷是否為純培養(yǎng)物。如有細菌或其他雜菌污染，則可挑取霉菌孢子或菌絲，用平板劃線法重復分離純化。對于形成固定菌落的如青霉、曲霉等，可用稀釋平板混菌法分離純化。菌落不定形、蔓延繁殖的如根霉、 毛霉等，因兩個菌落極易接觸混雜，故分離時需采用較高的稀釋度或以培養(yǎng)1624小時生長的菌絲接種。二、放線菌的分離純化（1）分離源: 菜園土（2）培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4.3H2O 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 瓊脂 1520g 水 1000mlpH 7.47.6三、酵母菌的分離純化（1）分離源：果園土，水果表皮，腐爛水果，酸牛奶（2）培養(yǎng)基：乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g 乳酸 5ml葡萄糖 20g 水 1000ml馬鈴薯去皮，切塊，取200g,加水煮沸30min, 紗布過濾，補足水至1000ml，加入其他成分即可，條件為115，20min,pH自然。（3）富集培養(yǎng)將待分離樣品放入盛有無菌水與玻璃珠的三角瓶中，使樣品振蕩分散后取上清液，接種于乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，2528培養(yǎng)37天，培養(yǎng)液變混濁，產(chǎn)生菌膜或沉淀物，取富集液，經(jīng)適當稀釋，吸取0.2ml接入乳酸馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，用涂布器涂布，正放于2528，培養(yǎng)24h，表面水分吸干后再倒置培養(yǎng)。四、纖維素分解菌的分離純化（1） 分離源 草地表層土壤、堆腐爛植物體、湖水等。（2） 培養(yǎng)基： 蛋白胨 10g 酵母粉 10g 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10g NaCl