第二章天然產(chǎn)物有效成分的毒理學(xué)安全性與功能性評價 ppt課件

第二章天然產(chǎn)物有效成分的毒理學(xué)安全性和功能性評價 毒理學(xué)評價安全性評價功能性評價 毒理學(xué) toxicology 是研究化學(xué) 物理和生物因素對機體的損害作用 生物學(xué)機制 biologicmechanisms 危險度評價 riskassessment 和危險度管理 riskmanagement 的科學(xué) 毒理學(xué)主要分為三個研究領(lǐng)域 即描述毒理學(xué) 機制毒理學(xué)和管理毒理學(xué) 衛(wèi)生毒理學(xué) healthtoxicology 是利用毒理學(xué)的概念和方法 從預(yù)防醫(yī)學(xué)角度 研究人類生活和生產(chǎn)活動中可能接觸到的外來化合物對機體的生物學(xué)作用 特別是損害作用 亦即毒性作用及其機理的科學(xué) 衛(wèi)生毒理學(xué)屬于預(yù)防醫(yī)學(xué)的范疇 也是毒理學(xué)的一個分支學(xué)科 一 毒理學(xué)安全性評價 外源化學(xué)物 xenobiotics 是在人類生活的外界環(huán)境中存在 可能與機體接觸并進(jìn)入機體 在體內(nèi)呈現(xiàn)一定的生物學(xué)作用的一些化學(xué)物質(zhì) 又稱為 外源生物活性物質(zhì) 內(nèi)源化學(xué)物是指機體內(nèi)原已存在的和代謝過程中所形成的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物 毒理學(xué)研究外源化學(xué)物對機體的有害作用 而不是有益作用 如營養(yǎng)作用 治療作用等 一 毒理學(xué)概述 毒理學(xué)的目的任何一種化學(xué)物質(zhì)在一定條件下都可能是對機體有害的 毒理學(xué)的目的就在于研究外源化學(xué)物質(zhì)的毒性和產(chǎn)生毒性作用的條件 闡明劑量一效應(yīng) 反應(yīng) 關(guān)系 為制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及防治措施提供理論依據(jù) 毒理學(xué)研究的三個主要研究領(lǐng)域 描述毒理學(xué) descriptivetoxicology 采用實驗動物進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩拘栽囼?獲得用于評價人群和環(huán)境特定化學(xué)物暴露的危險度信息 為化學(xué)物的毒作用機制提供重要線索 通過形成假設(shè)為發(fā)展機制毒理學(xué)作出貢獻(xiàn) 機制毒理學(xué) mechanistictoxicology 證實與人類直接相關(guān)的實驗動物中所觀察到的損害作用 癌癥 出生缺陷等 驗證可能與人類無關(guān)的發(fā)生于實驗動物中的有害效應(yīng) 設(shè)計和生產(chǎn)較為安全的化學(xué)物以及合理治療化學(xué)中毒和臨床疾病 進(jìn)一步加深對基礎(chǔ)生理學(xué) 藥理學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)的了解 管理毒理學(xué) regulatorytoxicology 根據(jù)描述和機制毒理學(xué)的研究資料進(jìn)行科學(xué)決策 協(xié)助政府部門制定衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 相關(guān)法規(guī)條例和管理措施并付諸實施 以確?；瘜W(xué)物 藥品 食品等進(jìn)入市場足夠安全 達(dá)到保護(hù)人民群眾身心健康的目的 古代與中世紀(jì)毒理學(xué)毒理學(xué)一詞源于希臘文字 toxikon 公元前2735年 神農(nóng)編輯完成了40卷 本草 典籍公元前2650年 黃帝撰寫了 內(nèi)經(jīng) 古埃及 古希臘及古羅馬等有關(guān)文獻(xiàn)中都有關(guān)于有毒植物和礦物的描述 積累了關(guān)于有毒物質(zhì)及中毒的知識 二 毒理學(xué)簡史 啟蒙時代毒理學(xué)16世紀(jì)瑞士醫(yī)生Paracelsus 1493 1541 意大利內(nèi)科醫(yī)生Ramazzini 1633 1714 1775年英國外科醫(yī)生Pott 1714 1788 意大利內(nèi)科醫(yī)生Fontana 1720 1853 進(jìn)一步發(fā)展了靶器官毒性概念 西班牙醫(yī)生Orfila被認(rèn)為是現(xiàn)代毒理學(xué)的奠基人 他是系統(tǒng)利用實驗動物的第一個科學(xué)家 并發(fā)展了在組織和體液中鑒定毒物的化學(xué)分析方法 19世紀(jì)的Megendie Bernard對依米丁 士的寧和箭毒 CO中毒的作用機制進(jìn)行了研究 現(xiàn)代毒理學(xué)1930年實驗毒理學(xué)的第一本雜志 創(chuàng)刊 同年在美國成立了NIH1937年引起急性腎衰竭和死亡的 磺胺事件 促使了美國FDA的成立1955年 Lehman和他的同事共同出版了 食品 藥品和化妝品中化學(xué)物的安全性評價 通過了許多新的法規(guī) 創(chuàng)辦了許多新的雜志 成立了國際毒理學(xué)協(xié)會 1965 重大公共衛(wèi)生事件 中國上海甲肝暴發(fā)中國山西朔州毒酒事件中國南京湯山中毒事件中國河北自溝苯中毒事件日本O 157事件印度博帕爾災(zāi)難德法荷比二惡英事件英國瘋牛病 上海甲肝暴發(fā) 自1988年1月19日起 上海市民中突然發(fā)生不明原因的發(fā)熱 嘔吐 反食 乏力和黃疸等癥狀的病例 數(shù)日內(nèi)成倍增長 截止到當(dāng)年的3月18日 共發(fā)生29230例 山西朔州毒酒事件 1998年春節(jié)前 山西文水縣一不法分子用甲醇勾兌散裝白酒 批發(fā)給外地個體戶 從1月26日開始 先后發(fā)現(xiàn)數(shù)百名群眾飲假酒中毒住院 其中近30人死亡 南京湯山中毒事件 2002年9月14日 南京湯山發(fā)生一起特大投毒案 犯罪分子陳正平將所攜帶的劇毒鼠藥 毒鼠強 投放到 正武 面食店食品原料內(nèi) 造成395人因食用有毒食品而中毒 死亡42人 河北白溝苯中毒事件 2002年初 在河北省高碑店市白溝鎮(zhèn)箱包生產(chǎn)加工企業(yè)打工的幾名外地務(wù)工者 陸續(xù)出現(xiàn)了中毒癥狀 并有6人相繼死亡 后經(jīng)衛(wèi)生部門調(diào)查確定為苯中毒事件 日本O 157事件 日本O 157事件 自1996年6月從日本多所小學(xué)發(fā)生集體食物中毒事件而發(fā)現(xiàn)元兇為 O 157 大腸桿菌以來 日本全國至當(dāng)年8月患者已達(dá)9000多人 其中7人死亡 數(shù)百人住院治療 印度博帕爾災(zāi)難 1984年12月3日 美國的跨國公司聯(lián)合碳化物公司在印度中央聯(lián)邦首府博帕爾開辦的一家農(nóng)藥廠 發(fā)生了一起嚴(yán)重的毒氣泄漏事故 給當(dāng)?shù)鼐用駧砭薮蟮臑?zāi)難 據(jù)報道 共有3600多人死于這次事故 德法荷比二惡英事件 1999年 比利時 荷蘭 法國 德國相繼發(fā)生因二惡英污染導(dǎo)致畜禽類產(chǎn)品及乳制品含高濃度二惡英的事件 二惡英事件使當(dāng)年比利時損失超過10億歐元 英國瘋牛病 瘋牛病在人類中的表現(xiàn)為新型克雅氏癥 患者腦部會出現(xiàn)海綿狀空洞 導(dǎo)致記憶喪失 身體功能失調(diào) 最終神經(jīng)錯亂甚至死亡 1997年 英國科學(xué)家曾經(jīng)預(yù)計 在最糟糕的情況下 可能會有1000萬人最終死于新型克雅氏癥 2002年這一預(yù)計數(shù)字降為5萬人 2000年7月 在英國有超過34000個牧場的17萬多頭牛感染了瘋牛病 毒理學(xué)主要是借助于動物模型模擬引起人體中毒的各種條件 觀察實驗動物的毒性反應(yīng) 再外推到人 由于動物 特別是哺乳動物和人體在解剖 生理和生化代謝過程方面有很多相似之處 這就是利用動物實驗的結(jié)果可以外推到人的基礎(chǔ) 毒理學(xué)實驗可采用整體動物 游離的動物臟器 組織 細(xì)胞進(jìn)行 根據(jù)所采用的方法不同 可分為體內(nèi)試驗 invivotest 和體外試驗 invitrotest 毒理學(xué)還利用限定人體試驗和流行病學(xué)調(diào)查直接研究外源化學(xué)物對人體和人群健康的影響 三 毒理學(xué)的研究方法 1 體內(nèi)試驗也稱為整體動物試驗 可嚴(yán)格控制接觸條件 測定多種類型的毒作用 實驗多采用哺乳動物 例如大鼠 小鼠 脈鼠 家兔 倉鼠 hamster 狗和猴等 在特殊需要情況下 也采用魚類或其他水生生物 鳥類 昆蟲等 檢測外源化學(xué)物的一般毒性 多在整體動物進(jìn)行 例如急性毒性試驗 亞急性毒性試驗 亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗等 哺乳動物體內(nèi)試驗是毒理學(xué)的基本研究方法 其結(jié)果原則上可外推到人 但體內(nèi)試驗影響因素較多 難以進(jìn)行代謝和機制研究 2 體外試驗利用游離器官 培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行毒理學(xué)研究 多用于外源化學(xué)物對機體急性毒作用的初步篩檢 作用機制和代謝轉(zhuǎn)化過程的深入觀察研究 體外試驗系統(tǒng)缺乏整體毒物動力學(xué)過程 并且難以研究外源化學(xué)物的慢性毒作用 1 游離器官 利用器官灌流技術(shù)將特定的液體通過血管流經(jīng)某一離體的臟器 肝臟 腎臟 肺 腦等 借此可使離體臟器在一定時間內(nèi)保持生活狀態(tài) 與受試化學(xué)物接觸 觀察在該臟器出現(xiàn)有害作用 以及受試化學(xué)物在該臟器中的代謝情況 2 細(xì)胞 利用從動物或人的臟器新分離的細(xì)胞 原代細(xì)胞 primarycell 或經(jīng)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞如細(xì)胞株 cellstrain 及細(xì)胞系 cellline 3 細(xì)胞器 organelle 將細(xì)胞制作勻漿 進(jìn)一步離心分離成為不同的細(xì)胞器或組分 例如線粒體 微粒體 核等 用于實驗 體內(nèi)試驗和體外試驗各有其優(yōu)點和局限性 應(yīng)主要根據(jù)實驗研究的目的要求 采用最適當(dāng)?shù)姆椒?并且互相驗證 3 人體觀察通過中毒事故的處理或治療 可以直接獲得關(guān)于人體的毒理學(xué)資料 這是臨床毒理學(xué)的主要研究內(nèi)容 有時可設(shè)計一些不損害人體健康的受控的實驗 但僅限于低濃度 短時間的接觸 并且毒作用應(yīng)有可逆性 4 流行病學(xué)研究對于在環(huán)境中已存在的外源化學(xué)物 可以用流行病學(xué)方法 將動物實驗的結(jié)果進(jìn)一步在人群調(diào)查中驗證 可從對人群的直接觀察中 取得動物實驗所不能獲得的資料 優(yōu)點是接觸條件真實 觀察對象包括全部個體 可獲得制訂和修訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的資料 以及制定預(yù)防措施的依據(jù) 利用流行病學(xué)方法不僅可以研究已知環(huán)境因素 外源化學(xué)物 對人群健康的影響 從因到果 而且還可對已知疾病的環(huán)境病因進(jìn)行探索 從果到因 但流行病學(xué)研究干擾因素多 測定的毒效應(yīng)還不夠深入 有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志還有待于發(fā)展 四 安全毒理學(xué)評價試驗的四個階段與試驗原則 1 試驗的四個階段第一階段 急性毒性試驗 包括經(jīng)口急性毒性 LD50 和聯(lián)合急性毒性 第二階段 遺傳毒性試驗 傳統(tǒng)致畸試驗 短期喂養(yǎng)試驗 第三階段 亞慢性毒性試驗 90天喂養(yǎng)試驗 繁殖試驗和代謝試驗 第四階段 慢性毒性實驗 包括致癌試驗 第一階段 急性毒性試驗?zāi)康?通過測定獲得LD50 半致死劑量 了解受試物的毒性強度 性質(zhì)和可能的靶器官 為進(jìn)一步進(jìn)行毒性試驗的劑量和毒性判定指標(biāo)的選擇提供依據(jù) 試驗內(nèi)容 口急性毒性 LD50 試驗 聯(lián)合急性毒性試驗 第二階段 遺傳毒性試驗 傳統(tǒng)致畸試驗 短期喂養(yǎng)試驗 目的 1 遺傳毒性試驗 對受試物的遺傳毒性以及是否具有潛在致癌作用進(jìn)行篩選 2 傳統(tǒng)致畸試驗 了解受試物對胎仔是否具有致畸作用 3 短期喂養(yǎng)試驗 對只需進(jìn)行第一 二階段毒性試驗的受試物 在急性毒性試驗的基礎(chǔ)上 通過短期 30d 喂養(yǎng)試驗 進(jìn)一步了解其毒性作用 并可初步估計最大無作用劑量 試驗內(nèi)容 1 細(xì)菌致突變試驗 鼠傷寒沙門氏菌 哺乳動物微粒體酶試驗 Ames試驗 為首選項目 必要時可另選和加選其他試驗 2 小鼠骨髓微核率測定或骨髓細(xì)胞染色體畸變分析 3 小鼠精子畸形分析和睪丸染色體畸變分析 第三階段 亞慢性毒性試驗 90天喂養(yǎng)試驗 繁殖試驗和代謝試驗 目的 觀察受試物以不同劑量水平經(jīng)較長期喂養(yǎng)后對動物的毒性作用性質(zhì)和靶器官 并初步確定最大作用劑量 了解受試物對動物繁殖及對仔代的致畸作用 為慢性毒性和致癌試驗的劑量選擇提供依據(jù) 試驗內(nèi)容 90d喂養(yǎng)試驗 繁殖試驗 代謝試驗 了解受試物在體內(nèi)的吸收 分布和排泄速度以及蓄積性 尋找可能的靶器官 為選擇慢性毒性試驗的合適動物種系提供依據(jù) 了解有無毒性代謝產(chǎn)物的形成 第四階段 慢性毒性試驗 包括致癌試驗 目的 了解經(jīng)長期接觸受試物后出現(xiàn)的毒性作用 尤其是進(jìn)行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用 最后確定最大無作用劑量 為受試物能否應(yīng)用于食品的最終評價提供依據(jù) 五 食品毒理學(xué)試驗結(jié)果的判定 1 急性毒性試驗 如LD50劑量小于人的可能攝入量的10倍 則放棄該受試物用于食品 不再繼續(xù)其他毒理學(xué)試驗 如大于10倍者 可進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗 凡LD50在人的可能攝入量的10倍左右時 應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗 或用另一種方法進(jìn)行驗證 2 遺傳毒性試驗 根據(jù)受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu) 理化性質(zhì)以及對遺傳物質(zhì)作用終點的不同 并兼顧體外和體內(nèi)試驗以及體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的原則 鼠傷寒沙門氏菌 哺乳動物微粒體酶試驗 Ames試驗 小鼠骨髓微核率測定骨髓細(xì)胞染色體畸變分析小鼠精子畸形分析睪丸染色體畸變分析試驗 選擇四項試驗 結(jié)果判斷原則 其中三項試驗為陽性 則表示該受試物很可能具有遺傳毒性作用和致癌作用 一般應(yīng)放棄該受試物應(yīng)用于食品 毋需進(jìn)行其他項目的毒理學(xué)試驗 其中兩項試驗為陽性 而且短期喂養(yǎng)試驗顯示該受試物具有顯著的毒性作用 一般應(yīng)放棄該受試物用于食品 如短期喂養(yǎng)試驗顯示有可疑的毒性作用 則經(jīng)初步評價后 根據(jù)受試物的重要性和可能攝入量等 綜合權(quán)衡利弊再作出決定 其中一項試驗為陽性 則再選擇V79 HGPRT基因突變試驗 顯性致死試驗 果蠅伴性隱性致死試驗 程序外DNA修復(fù)合成 UDS 試驗中的兩項遺傳毒性試驗 如再選的兩項試驗均為陽性 則無論短期喂養(yǎng)試驗和傳統(tǒng)致畸試驗是否顯示有毒性與致畸作用 均應(yīng)放棄該受試物用于食品 如有一項為陽性 而在短期喂養(yǎng)試驗和傳統(tǒng)致畸試驗中未見有明顯毒性與致畸作用 則可進(jìn)入第三階段毒性試驗 如四項試驗均為陰性 則可進(jìn)入第三階段毒性試驗 3 短期喂養(yǎng)試驗 在只要求進(jìn)行兩階段毒性試驗時 若短期喂養(yǎng)試驗未發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用 綜合其他各項試驗即可作出初步評價 若試驗中發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用 尤其是有劑量 反應(yīng)關(guān)系時 則考慮進(jìn)一步的毒性試驗 4 90d喂養(yǎng)試驗 繁殖試驗 傳統(tǒng)致畸試驗 根據(jù)三項試驗中所采用的最敏感指標(biāo)所得的最大無作用劑量進(jìn)行評價 最大無作用劑量小于或等于人的可能攝入量的100倍者表示毒性較強 應(yīng)放棄該受試物用于食品 最大無作用劑量大于100倍而小于300倍者 應(yīng)進(jìn)行毒性試驗 大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性毒性試驗 可進(jìn)行安全性評價 5 慢性毒性 包括致癌 試驗 根據(jù)慢性毒性試驗所得的最大無作用劑量進(jìn)行評價 最大無作用劑量小于或等于人的可能攝入量的50倍者 表示毒性較強 應(yīng)放棄該受試物用與食品 最大無作用劑量大于50倍而小于100倍者 經(jīng)安全性評價后 決定該受試物可否用于食品 最大無作用劑量大于或等于100倍者 則可考慮允許使用于食品 新資源食品 復(fù)合配方的飲料等在試驗中 若試樣的最大加入量 一般不超過飼料的5 或液體試樣最大可能的濃縮物加入量仍不能達(dá)到最大無作用劑量為人的可能攝入量的規(guī)定倍數(shù)時 則可以綜合其他的毒性試驗結(jié)果和實際食用或飲用量進(jìn)行安全性評價 六 食品安全性評價時需要考慮的因素 1 人的可能攝入量除一般人群的攝入量外 還應(yīng)考慮特殊和敏感人群 如兒童 孕婦及高攝入量人群 2 人體資料由于存在著動物與人之間的種族差異 在將動物試驗結(jié)果推論到人時 應(yīng)盡可能收集人群接觸受試物后反應(yīng)的資料 如職業(yè)性接觸和意外事故接觸等 志愿受試者體內(nèi)的代謝資料對于將動物試驗結(jié)果推論到人具有重要意義 在確保安全的條件下 可以考慮按照有關(guān)規(guī)定進(jìn)行必要的人體試食試驗 4 安全系數(shù) 由動物毒性試驗結(jié)果推論到人時 鑒于動物 人的種屬和個體之間的生物特性差異 一般采用安全系數(shù)的方法 以確保對人的安全性 安全系數(shù)通常為100倍 但可根據(jù)受試物的理化性質(zhì) 毒性大小 代謝特點 接觸的人群范圍 食品中的使用量及使用范圍等因素 綜合考慮增大或減小安全系數(shù) 3 動物毒性試驗和體外試驗資料各項動物毒性試驗和體外試驗系統(tǒng)雖然仍有待完善 卻是目前水平下所得到的最重要的資料 也是進(jìn)行評價的主要依據(jù) 在試驗得到陽性結(jié)果 而且結(jié)果的判定涉及到受試物能否應(yīng)用于食品時 需要考慮結(jié)果的重要性和劑量 反應(yīng)關(guān)系 5 代謝試驗的資料 代謝研究是對化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)評價的一個重要方面 因為不同化學(xué)物質(zhì) 劑量大小 在代謝方面的差別往往對毒性作用影響很大 在毒性試驗中 原則上應(yīng)盡量使用與人具有相同代謝途徑和模式的動物種系來進(jìn)行試驗 研究受試物在實驗動物和人體內(nèi)吸收 分布 排泄和生物轉(zhuǎn)化方面的差別 對于將動物試驗結(jié)果比較正確地推論到人具有重要意義 6 綜合評價 在進(jìn)行最后評價時 必須在受試物可能對人體健康造成的危害以及其可能的有益作用之間進(jìn)行權(quán)衡 評價的依據(jù)不僅是科學(xué)試驗資料 而且與當(dāng)時的科學(xué)水平 技術(shù)條件 以及社會因素有關(guān) 因此 隨著時間的推移 很可能結(jié)論也不同 隨著情況的不斷改變 科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和研究工作的不斷進(jìn)展 對已通過評價的化學(xué)物質(zhì)需進(jìn)行重新評價 作出新的結(jié)論 一 功能學(xué)評價的基本要求 1 對受試樣品的要求化學(xué)性質(zhì) 包括化學(xué)結(jié)構(gòu) 純度 穩(wěn)定性等 有關(guān)資料 受試樣品必須是規(guī)格化的定型產(chǎn)品 即符合既定的配方 生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 提供受試樣品的安全性毒理學(xué)評價的資料以及衛(wèi)生學(xué)檢驗報告 受試樣品必須是已經(jīng)過食品安全性毒理學(xué)評價確認(rèn)為安全的食品 功能學(xué)評價的樣品與安全性毒理學(xué)評價 衛(wèi)生學(xué)檢驗的樣品必須為同一批次 安全性毒理學(xué)評價和功能學(xué)評價實驗周期超過受試樣品保質(zhì)期的除外 應(yīng)提供功效成分或特征成分 營養(yǎng)成分的名稱及含量 如需提供受試樣品違禁藥物檢測報告時 應(yīng)提交與功能學(xué)評價同一批次樣品的違禁藥物檢測報告 二 功能性評價 2 對實驗動物的要求 根據(jù)各項實驗的具體要求 合理選擇實驗動物 常用大鼠和小鼠 品系不限 推薦使用近交系動物 動物的性別 年齡依實驗需要進(jìn)行選擇 實驗動物的數(shù)量要求為小鼠每組10 15只 單一性別 大鼠每組8 12只 單一性別 動物應(yīng)符合國家對實驗動物的有關(guān)規(guī)定 3 對給受試樣品劑量及時間的要求 各種動物實驗至少應(yīng)設(shè)3組 必要時可設(shè)陽性對照組或空白對照組 劑量選擇應(yīng)合理 盡可能找出最低有效劑量 在3個劑量組中 其中一個劑量應(yīng)相當(dāng)于人體推薦攝入量 折算為每公斤體重的劑量 的5倍 大鼠 或10倍 小鼠 且最高劑量不得超過人體推薦攝入量的30倍 特殊情況除外 受試樣品的功能實驗劑量必須在毒理學(xué)評價確定的安全劑量范圍之內(nèi) 給受試樣品的時間應(yīng)根據(jù)具體實驗而定 一般為30天 當(dāng)給予受試樣品的時間已達(dá)30天而實驗結(jié)果仍為陰性時 則可終止實驗 4 對受試樣品處理的要求 受試樣品推薦量較大 超過實驗動物的灌胃量 摻入飼料的承受量等情況時 可適當(dāng)減少受試樣品的非功效成分的含量 對于含乙醇的受試樣品 原則上應(yīng)使用其定型的產(chǎn)品進(jìn)行功能實驗 其三個劑量組的乙醇含量與定型產(chǎn)品相同 如受試樣品的推薦量較大 超過動物最大灌胃量時 允許將其進(jìn)行濃縮 但最終的濃縮液體應(yīng)恢復(fù)原乙醇含量 如乙醇含量超過15 允許將其含量降至15 調(diào)整受試樣品乙醇含量應(yīng)使用原產(chǎn)品的酒基 液體受試樣品需要濃縮時 應(yīng)盡可能選擇不破壞其功效成分的方法 一般可選擇60 70 減壓進(jìn)行濃縮 濃縮的倍數(shù)依具體實驗要求而定 對于以沖泡形式飲用的受試樣品 如袋泡劑 可使用該受試樣品的水提取物進(jìn)行功能實驗 提取的方式應(yīng)與產(chǎn)品推薦飲用的方式相同 如產(chǎn)品無特殊推薦飲用方式 則采用下述提取的條件 常壓 溫度80 90 時間30 60分鐘 水量為受試樣品體積的10倍以上 提取2次 將其合并濃縮至所需濃度 5 對給受試樣品方式的要求必須經(jīng)口給予受試樣品 首選灌胃 如無法灌胃則加入飲水或摻入飼料中 計算受試樣品的給予量 6 對合理設(shè)置對照組的要求以載體和功效成分 或原料 組成的受試樣品 當(dāng)載體本身可能具有相同功能時 應(yīng)將該載體作為對照 7 人體試食試驗規(guī)程 評價食品保健作用時要考慮的因素人的可能攝入量除一般人群的攝入量外 還應(yīng)考慮特殊的和敏感的人群 如兒童 孕婦及高攝入量人群 人體資料由于存在動物與人之間的種屬差異 在將動物試驗結(jié)果外推到人時 應(yīng)盡可能收集人群服用受試物的效應(yīng)資料 若體外或體內(nèi)動物試驗未觀察到或不易觀察到食品的保健效應(yīng)或觀察到不同效應(yīng) 而有關(guān)資料提示對人有保健作用時 在保證安全的前提下 應(yīng)進(jìn)行必要的人體試食試驗 結(jié)果的重復(fù)性和劑量反應(yīng)關(guān)系在將評價程序所列試驗的陽性結(jié)果用于評價食品的保健作用時 應(yīng)考慮結(jié)果的重復(fù)性和劑量反應(yīng)關(guān)系 并由此找出其最小有作用劑量 二 試驗項目 試驗原則及結(jié)果判定 1 免疫調(diào)節(jié)作用 1 試驗項目 動物試驗 臟器 體重比值 a 胸腺 體重比值b 脾臟 體重比值 細(xì)胞免疫功能測定a 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗 b 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 體液免疫功能測定a 抗體生成細(xì)胞檢測 b 血清溶血素測定 單核 巨噬細(xì)胞功能測定 a 小鼠碳廓清試驗 b 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗 NK細(xì)胞活性測定 人體試驗 細(xì)胞免疫功能測定外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 體液免疫功能試驗單向免疫擴(kuò)散法測定IgG IgA IgM 非特異性免疫功能測定 吞噬與殺菌試驗 NK細(xì)胞活性測定 2 試驗原則 要求選擇一組能夠全面反映免疫系統(tǒng)各方面功能的試驗 其中細(xì)胞免疫 體液免疫和單核 巨噬細(xì)胞功能三個方面至少各選擇1種試驗 在確保安全的前提下盡可能進(jìn)行人體試食試驗 3 結(jié)果判定 在一組試驗中 受試物對免疫系統(tǒng)某方面的試驗具有增強作用而對其他試驗無抑制作用 可以判定該受試物具有該方面的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng) 對任何一項免疫試驗具有抑制作用可判定該受試物具有免疫抑制效應(yīng) 在細(xì)胞免疫功能 體液免疫功能 單核 巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞功能檢測中 如有兩個以上 含兩個 功能檢測結(jié)果陽性 即可判定該受試物具有免疫調(diào)節(jié)作用 2 延緩衰老作用 1 試驗項目動物試驗 生存試驗a 小鼠生存試驗b 大鼠生存試驗c 果蠅生存試驗 過氧化脂質(zhì)含量測定a 血 或組織 中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛 MDA 含量測定組織中脂褐質(zhì)含量測定 抗氧化活力測定a 血 或組織 中超氧化物歧化酶 SOD 活力測定b 血 或組織 中谷胱甘肽過氧化物酶 GSH PX 活力測定 血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛 MDA 含量測定血中超氧化物歧化酶 SOD 活力測定丙二醛 MDA 是氧自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物 間接反映機體細(xì)胞受自由基損傷的程度 超氧化物歧化酶 SOD 是一種存在于細(xì)胞液中的抗氧化酶 它可清除超氧陰離子 保護(hù)機體免受超氧陰離子的損傷 因而SOD活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力 因此氧自由基對機體的損傷程度可以通過檢測MDA含量的變化及內(nèi)源性抗氧化酶 SOD 活性間接評定 人體試驗 2 試驗原則 衰老機制比較復(fù)雜 迄今尚無一種公認(rèn)的衰老機制學(xué)說 因而無單一 簡便 實用的衰老指標(biāo)可供應(yīng)用 應(yīng)采用盡可能多的試驗方法 以保證試驗結(jié)果的可信性 動物試驗 除上述生存試驗 過氧化脂質(zhì)含量測定 抗氧化酶活力測定3個方面各選一項必做外 可能時應(yīng)多選擇一些指標(biāo) 如腦 肝組織中單胺氧化酶 MAO B 活力測定等 加以輔助 生存試驗是最直觀 最可靠的實驗方法 果蠅具有自下而上期短 繁殖快 飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點 通常多選果蠅作生存試驗 但果蠅種系分類地位與人較遠(yuǎn) 故必須輔助過氧化脂質(zhì)含量測定及抗氧化活力測定才能判斷是否具有延緩衰老作用 生化指標(biāo)測定應(yīng)選用老齡鼠 除設(shè)老齡對照外 最好同時增設(shè)少齡對照 以比較受試物抗氧化的程度 必要時可將動物試驗與人體試食試驗相結(jié)合綜合評價 3 結(jié)果判定 若大鼠或小鼠生存試驗為陽性 即可判定該受試物具有延緩衰老的作用 若果蠅生存試驗 過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶三項指標(biāo)均為陽性 即可判定該受試物具有延緩衰老的作用 若過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶兩項為陽性 可判定該受試物具有抗氧化作用 并提示可能具有延緩衰老作用 3 改善記憶作用 1 試驗項目動物試驗 跳臺試驗 避暗試驗 穿梭箱試驗 水迷宮試驗人體試驗 韋氏記憶量表 臨床記憶量表 2 試驗原則 試驗應(yīng)通過訓(xùn)練前 訓(xùn)練后及重測驗前3種不同的給予受試物方法觀察其對記憶全過程的影響 應(yīng)采用一組 2個以上 行為學(xué)試驗方法 以保證實驗結(jié)果的可靠性 人體試食試驗為必做項目 并應(yīng)在動物試驗有效的前提下進(jìn)行 除上述試驗項目外 還可以選用嗅覺厭惡試驗 味覺厭惡試驗 操作式條件反射試驗 連續(xù)強化程序試驗 比率程序試驗 間隔程序試驗 3 結(jié)果判定 動物試驗2項或2項以上的指標(biāo)為陽性 且2次或2次以上的重復(fù)測試結(jié)果一致 可以認(rèn)為該受試物具有改善該類動物記憶作用 人體試食試驗結(jié)果陽性 則可認(rèn)為該受試物具有改善人體記憶作用 4 促進(jìn)生長發(fā)育作用 1 試驗項目本功能試驗研究是以動物學(xué)試驗為研究基礎(chǔ)胎仔情況包括活胎數(shù) 雌雄比例 死胎數(shù) 分娩胎仔總數(shù) 體重及食物利用率記錄出生時及生后4 7 14 21 30 60d幼鼠的體重 計算斷乳后幼鼠的食物利用率 生理發(fā)育指標(biāo)記錄耳廓分離 門齒萌出 開眼 長毛時間 陰道開放 睪丸下降時間 神經(jīng)反射指標(biāo)平面翻正 前肢抓力 懸崖回避 嗅覺定位 聽覺警戒 負(fù)趨地性 回旋運動 視覺發(fā)育 空中翻正 游泳發(fā)育 2 試驗原則 給受試物的時間可根據(jù)具體情況選擇在母鼠孕期或哺乳期至成年期 在神經(jīng)反射指標(biāo)中應(yīng)選擇一組 5個以上 的行為學(xué)試驗方法 以保證結(jié)果的可靠性 3 結(jié)果判定 在胎仔情況 體重及食物利用率 生理發(fā)育 神經(jīng)反射4類指標(biāo)中有3類以上 含3類 指標(biāo)為陽性 可認(rèn)為受試物有促進(jìn)生長發(fā)育的作用 5 抗疲勞作用 本功能試驗研究是以動物學(xué)試驗為研究基礎(chǔ) 1 試驗項目運動試驗a 負(fù)重游泳試驗b 爬桿試驗 2 生物化學(xué)指標(biāo)測定a 血乳酸含量b 血清尿素氮含量c 肝 肌糖原比值測定 2 試驗原則運動試驗與生化指標(biāo)檢測相結(jié)合 在進(jìn)行游泳或爬桿試驗前 動物應(yīng)進(jìn)行初篩 除以上生化指標(biāo)外 還可檢測血糖 乳酸脫氫酶 血紅蛋白以及磷酸肌酸等指標(biāo) 3 結(jié)果判定若1項以上 含1項 運動試驗和2項以上 含2項 生化指標(biāo)為陽性 即可以判斷該受試物具有抗疲勞作用 6 減肥作用 1 減肥原則減除體現(xiàn)人多余的脂肪 不單純以減輕體重為標(biāo)準(zhǔn) 每日營養(yǎng)素的攝入量應(yīng)基本保證機體正常生命活動的要求 對機體健康無明顯損害 2 試驗項目 動物試驗 首先建立動物肥胖模型 體重測定 體內(nèi)脂肪重量測定人體試食試驗 主要測定指標(biāo) 體重 體重指數(shù) 腰圍 腹圍 臀圍 體內(nèi)脂肪含量 3 試驗原則 在進(jìn)行減肥試驗時 除上述指標(biāo)必測外 還應(yīng)進(jìn)行機體營養(yǎng)狀況檢測 運動耐力測試以及與健康有關(guān)的其它指標(biāo)的觀察 該功能的人體試食試驗為必做項目 動物試驗與人體試食試驗相結(jié)合 綜合進(jìn)行評價 4 結(jié)果判定 在動物試驗中 體重及體內(nèi)脂肪重量2個指標(biāo)均陽性 并且對機體健康無明顯損害 即可初步判定該受試物具有減肥作用 在人體試食試驗中 體內(nèi)脂肪量顯著減少 且對機體健康無明顯損害 可判定該受試物具有減肥作用 7 耐缺氧作用 本功能試驗研究是以動物學(xué)試驗為研究基礎(chǔ) 1 試驗項目小鼠常壓耐缺氧實驗 2 結(jié)果判定耐缺氧實驗陽性 說明該受試物具有耐缺氧作用 8 抗輻射作用 本功能試驗研究是以動物學(xué)試驗為研究基礎(chǔ) 1 試驗項目亞急性試驗 30天存活率或平均存活時間 白細(xì)胞總數(shù)亞慢性或慢性試驗 小鼠睪丸染色體畸變試驗 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 2 試驗原則 較高劑量一次輻射 選擇亞急性試驗 小劑量多次輻射 選擇亞慢性或慢性試驗 3 結(jié)果判定 亞急性試驗項目中2項結(jié)果為陽性 則可判定該受試物對較高劑量一次輻射有拮抗作用 亞慢性或慢性試驗中2項結(jié)果為陽性 則可判定該受試物對小劑量多次輻射有拮抗作用 9 抗突變作用 1 試驗項目Ames試驗或V79細(xì)胞基因突變試驗小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗小鼠睪丸染色體畸變試驗 2 試驗原則Ames試驗與V79細(xì)胞基因突變試驗任選一項 采用體內(nèi)與體外試驗相結(jié)合的原則 3 結(jié)果判定抗突變?nèi)椩囼炛杏袃身棡殛栃詴r 則可判定該受試物具有抗突變作用 10 抑制腫瘤作用 1 試驗項目動物誘發(fā)性腫瘤試驗動物移植性腫瘤試驗免疫功能試驗NK細(xì)胞活性測定單核 巨噬細(xì)胞功能測定 2 試驗原則動物誘發(fā)性腫瘤試驗及動物移植性腫瘤試驗兩項中任選一項 同時必做2項免疫功能試驗 3 結(jié)果判定動物誘發(fā)性腫瘤試驗及動物移植性腫瘤試驗兩項試驗中有一項為陽性 并且對免疫功能無抑制作用 則可判定該受試物具有抑制腫瘤的作用 11 調(diào)節(jié)血脂作用 1 試驗項目動物實驗 體重 血清總膽固醇 甘油三酯 高密度脂蛋白膽固醇人體試驗 血清總膽固醇 甘油三酯 高密度脂蛋白膽固醇 人體試食試驗 血清總膽固醇 甘油三酯 高密度脂蛋白膽固醇三項指標(biāo)檢測中 血清總膽固醇和甘油三酯二項指標(biāo)陽性 可判定該受試樣品具有輔助降血脂作用 血清總膽固醇 甘油三酯兩項指標(biāo)中任一項指標(biāo)陽性 同時高密度脂蛋白膽固醇結(jié)果陽性 可判定該受試樣品具有輔助降低血清總膽固醇或輔助降低甘油三酯作用 2 試驗原則 動物實驗和人體試食試驗所列指標(biāo)均為必測項目 動物實驗選用脂代謝紊亂模型法 預(yù)防性或治療性任選