中圖版選修一 測(cè)定微生物的數(shù)量 課件（23張）.ppt

測(cè)定微生物的數(shù)量 微生物的生長(zhǎng)通常以群體的生長(zhǎng)作為指標(biāo) 群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或者細(xì)胞物質(zhì)的增加 測(cè)定微生物數(shù)量的主要方法 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 不辨死活 平板菌落計(jì)數(shù)法 形成菌落的微生物 p32光電比濁法 不用于顏色太深的樣品 測(cè)定細(xì)胞重量法 測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量 測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量 適于濃度較高的樣品 目的要求 了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造 計(jì)數(shù)原理和計(jì)數(shù)方法 掌握顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的技能 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上 于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便 快速 直觀的方法 直接計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 直觀 快速 操作簡(jiǎn)單 缺點(diǎn) 不能區(qū)分死菌與活菌 所得為總數(shù) 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù) 常用計(jì)菌器 常用計(jì)數(shù)器有血球計(jì)數(shù)板 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 petroff hauser計(jì)菌器以及hawksley計(jì)菌器等 各種計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理相同 只是血球計(jì)數(shù)板較厚 不能使用油鏡觀察 只能計(jì)數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌 而后兩種計(jì)菌器細(xì)菌 可以使用油鏡觀察 因此可以直接計(jì)數(shù)細(xì)菌 血球計(jì)數(shù)板petroff hauser計(jì)菌器 hawksley計(jì)菌器 血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片 其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái) 中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半 每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng) 血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片 其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái) 中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半 每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng) 每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格 中間的大方格即為計(jì)數(shù)室 血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片 其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái) 中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半 每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng) 每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格 中間的大方格即為計(jì)數(shù)室 計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格 一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格 而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格 另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格 而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格 血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片 其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái) 中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半 每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng) 每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格 中間的大方格即為計(jì)數(shù)室 計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格 一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格 而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格 另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格 而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格 無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板 每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè) 每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm 則每一個(gè)大方格的面積為lmm2 蓋上蓋玻片后 蓋玻片與載玻片之間的高度為0 lmm 所以計(jì)數(shù)室的容積為0 lmm3 萬(wàn)分之一毫升 計(jì)數(shù)方法 計(jì)算 1ml菌液中總菌數(shù) a 5 25 104 b 50000 a b1ml菌液中總菌數(shù) a 5 16 104 b 32000 a b其中b為稀釋倍數(shù) 使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí) 通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)a 然后求每個(gè)中方格的平均值 再乘上大方格 計(jì)數(shù)室 中方格的數(shù)量 就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù) 數(shù)兩個(gè)大方格總菌數(shù) 平均后 再換算成每毫升菌液中微生物細(xì)胞的數(shù)量 注意事項(xiàng) 對(duì)于出芽的酵母菌 芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí) 即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算 對(duì)于壓線酵母 按照數(shù)上不數(shù)下 數(shù)左不數(shù)右的原則計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)器材 活材料 釀酒酵母 saccharomycescerevisiae 培養(yǎng)液 其他器材 顯微鏡 血球計(jì)數(shù)板 電吹風(fēng) 蓋玻片 22mm 22mm 吸水紙 計(jì)數(shù)器 滴管 擦鏡紙 實(shí)驗(yàn)方法 1 用無(wú)菌生理鹽水將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液 以每個(gè)小方格中5 10個(gè)菌為宜 2 取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊 事先鏡檢 蓋上一塊蓋玻片 3 將菌懸液搖勻 用無(wú)菌滴管吸取少許 沿蓋玻片邊緣摘入一小滴 讓菌懸液利用毛細(xì)滲透作用充滿計(jì)數(shù)區(qū) 4 加樣后靜止5min 將計(jì)數(shù)板置顯微鏡載物臺(tái)上 先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)區(qū) 然后換高倍鏡計(jì)數(shù) 光不宜太強(qiáng) 5 計(jì)數(shù)完畢 將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈 用電吹風(fēng)吹干 鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無(wú)殘留菌體或其它沉淀 作業(yè) 結(jié)果 填表 p55 了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理 學(xué)習(xí) 掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法 目的要求 基本原理 當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí) 由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低 在一定范圍內(nèi) 微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比 與光密度成正比 而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出 因此 可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度 作出光密度 菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 然后 以樣品液所測(cè)得的光密度 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù) 光電比濁計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)便 快速 連續(xù)測(cè)定 適合自動(dòng)化 缺點(diǎn) 光密度受細(xì)胞大小 形態(tài) 培養(yǎng)液成分以及選用的波長(zhǎng)的影響 對(duì)于不同微生物的菌懸液要選擇相應(yīng)的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)于顏色太深的樣品或含其它具有吸光值的物質(zhì)不能用此法 器材 菌種釀酒酵母培養(yǎng)液儀器或其他用具分光光度計(jì) 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 顯微鏡 試管 吸水紙 無(wú)菌吸管 無(wú)菌生理鹽水等 操作步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作樣品測(cè)定 每毫升細(xì)胞數(shù) 光密度值 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 1 血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù) 首先采用血球計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)釀酒酵母菌懸液 2 108菌 ml 2 稀釋菌液 將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行兩倍梯度稀釋 共稀釋6個(gè)濃度 1 108 5 107 2 5 107 1 25 107 6 25 106 3 125 106 3 測(cè)od值 以無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照 于波長(zhǎng)560nm處用1cm比色杯測(cè)定上述各菌液的od值 4 以od值為縱坐標(biāo) 每毫升菌數(shù)為橫坐標(biāo) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品測(cè)定 1 稀釋樣品 將待測(cè)菌懸液用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋 2 在560nm波長(zhǎng)用1cm比色皿測(cè)定稀釋后菌懸液的光密度 3 計(jì)算 根據(jù)所測(cè)得的光密度值 從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù) 乘以稀釋倍數(shù)就得到原液中細(xì)菌數(shù) 721型分光光度計(jì)操作方法 接通電源 打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān) 掀開(kāi)樣品室暗箱蓋 預(yù)熱10至15分鐘 將靈敏度開(kāi)關(guān)調(diào)至 1 檔 若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到 0 時(shí) 需選用較高檔 根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕 將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯3 4處 用擦鏡紙擦清外壁 放入樣品