細(xì)菌的培養(yǎng)及鑒定.ppt

細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 標(biāo)本采集原則 1 及時采集微生物標(biāo)本作病原學(xué)檢查2 在抗菌藥物使用前采集標(biāo)本3 采樣時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作4 標(biāo)本容器須無菌 但不得有消毒劑5 采樣后立即送檢6 送檢標(biāo)本應(yīng)注明來源和檢驗?zāi)康?咳痰方法 病人先漱口 清潔口腔 去除表面的菌群病人深咳 收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3 5 NaCl5ml霧吸約5min導(dǎo)痰以清晨第二口痰為佳標(biāo)本采集后放置時間不超過2小時 清潔中段尿液 盡量取早晨第一次尿液囑患者留取標(biāo)本的前一天晚上少飲水女性病人收集標(biāo)本前用肥皂水沖洗外陰 再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后 不停止尿流 采集中段尿男性病人翻轉(zhuǎn)包皮 清洗尿道口排出幾毫升后 不停止尿流 采集中段尿采集標(biāo)本后立即送檢 哥倫比亞血平板 營養(yǎng)要求高的細(xì)菌巧克力平板 含V X因子 主要培養(yǎng)嗜血桿菌 腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍 麥康凱平板 G 桿菌用SS平板 沙門氏菌和志賀氏菌用M H平板 細(xì)菌藥敏用TCBS平板 弧菌科細(xì)菌用沙包氏平板 真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板 真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基 分枝桿菌用 常用的培養(yǎng)基種類和用途 臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇 血 血培養(yǎng)瓶中斷尿 血平板 mac平板腦脊液 血培養(yǎng)瓶 血平板 巧克力平板穿刺液 血培養(yǎng)瓶 血平板 巧克力平板 mac平板膽汁 血平板 巧克力平板 mac平板大便 麥康凱 SS 血平板 細(xì)菌接種的基本程序 滅菌接種環(huán) 沾取標(biāo)本 接種 滅菌接種環(huán) 細(xì)菌接種法 平板劃線接種法 目的 使混合的細(xì)菌呈單個分散生長 形成單個菌落 以便獲得純菌 方法 分區(qū)劃線法 適用于含菌量較多的標(biāo)本 連續(xù)劃線法 適用于含菌量較少的標(biāo)本 分區(qū)劃線法 3區(qū) 第一區(qū)劃線 滅菌接種環(huán) 第二區(qū)劃線 滅菌接種環(huán) 第三區(qū)劃線 滅菌接種環(huán) 連續(xù)劃線法 細(xì)菌培養(yǎng)法 一般培養(yǎng) 需氧培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度 35 采用恒溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng)時間 18 24h二氧化碳培養(yǎng)法 燭缸法 二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法 厭氧培養(yǎng)箱 厭氧袋 厭氧罐 皰肉培養(yǎng)法 硫乙醇酸鹽法等 細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 菌落 定義 指單個細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖 形成單一肉眼可見的細(xì)菌集團 菌落特征 大小 形狀 邊緣 顏色 表面 透明度 濕潤度 黏度 溶血性 菌落類型 光滑型 S 粗糙型 R 黏液型 M 菌苔 指多個菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物 菌落 菌落與菌苔 菌落的三個類型 1 光滑型菌落 SmoothtypeColony 又稱S型2 粗糙型菌落 RoughtypeColony 又稱R型3 粘液型菌落 MucoidtypeColony 又稱M型 2020 3 8 16 S型菌落 R型菌落 M型菌落 革蘭染色 原理 通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后 在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物 革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚 肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密 故遇乙醇或丙酮脫色處理時 因失水反而使網(wǎng)孔縮小 再加上它不含類脂 故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙 因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi) 使其仍呈紫色 而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄 外膜層類脂含量高 肽聚糖層薄且交聯(lián)度差 在遇脫色劑后 以類脂為主的外膜迅速溶解 薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出 因此通過乙醇脫色后仍呈無色 再經(jīng)復(fù)紅等紅色染料復(fù)染 就使革蘭氏陰性菌呈紅色 革蘭染色步驟 涂片包括涂片 干燥 固定三步 涂片干燥固定 固定的目的 使細(xì)菌的細(xì)胞凝固 使菌體與玻片粘得更牢固 可改變菌體對染料的通透性 加熱固定可殺死細(xì)菌 比較安全 結(jié)晶紫1 碘液1 95 乙醇30 復(fù)紅1 沖洗濾紙干燥油鏡觀察 沖洗 沖洗 沖洗 革蘭染色程序 初染 媒染 脫色 復(fù)染 紫色 G 革蘭氏染色步驟示意圖 革蘭染色 甲菌 乙菌 初染 結(jié)晶紫 媒染 碘液 脫色 乙醇 復(fù)染 稀釋復(fù)紅 紫色 G 紅色 G 革蘭染色步驟示意圖 結(jié)果 細(xì)菌被染成紫色者 稱為革蘭陽性菌 而細(xì)菌染成紅色者 稱為革蘭陰性菌 陽性菌 紫色 G b 陰性菌 紅色 G b G 球菌 顯微鏡下的桿菌 G 桿菌 Figure2 GramstainofGram E colicells 痰標(biāo)本涂片染色低倍鏡下分類 分級白細(xì)胞 個 上皮細(xì)胞 個 A 252525A B兩種情況的痰適合做培養(yǎng) C不合格 應(yīng)重新留標(biāo)本 革蘭染色注意事項 標(biāo)本涂片不宜太厚固定不宜過熱脫色不宜過度選用培養(yǎng)18 24小時菌齡的細(xì)菌為宜 抗酸染色 原理 分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多 其中主要成分為分枝菌酸 此物具有抗酸性 染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固 能抵抗酸性乙醇的脫色作用 因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色 達到染色目的 抗酸染色步驟 1 涂片包括涂片 干燥 固定三步 涂片干燥固定 抗酸染色步驟 2 染色包括初染 脫色 復(fù)染三步 石炭酸復(fù)紅維持3 5 3 鹽酸酒精30 1 美藍復(fù)染1 沖洗干燥油鏡觀察 沖洗 沖洗 初染 脫色 復(fù)染 抗酸染色結(jié)果 抗酸菌呈紅色 常堆積成團 排列無序 偶呈分枝狀生長 背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色 抗酸桿菌報告 300個視野僅見到1 8條抗酸桿菌填寫條數(shù)1 鏡檢查見3 9條抗酸桿菌 100高倍鏡視野2 鏡檢查見1 9條抗酸桿菌 10高倍鏡視野3 鏡檢查見1 9條抗酸桿菌 高倍鏡視野4 鏡檢查見 9條抗酸桿菌 高倍鏡視野 抗酸染色注意事項 染色充分脫色時間寧長勿短在涂抹痰標(biāo)本時嚴(yán)禁對載玻片進行加熱 臨床標(biāo)本培養(yǎng)基選擇 生殖道標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗項目接種相應(yīng)的平板及操作 淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板 念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基 支原體培養(yǎng)則按 支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程 操作 作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板 觀察細(xì)菌在平板上的生長現(xiàn)象 血平板 大小 形狀 邊緣 顏色 表面 透明度 濕潤度 黏度 溶血性mac平板 大小 形狀 顏色 透明度 濕潤度 黏度巧克力平板 大小 形狀 顏色 透明度 濕潤度 黏度 2020 3 8 37 革蘭陰性菌葡萄球菌 細(xì)菌的初步分類 細(xì)菌的分離與純化 自血平板挑出待檢菌株的單菌落進行初步的鑒定 如果混有雜菌 應(yīng)該重新轉(zhuǎn)種分純 染色與鏡檢 首先通過革蘭氏染色確定基本的分類 1 G 球菌 2 G 球菌 3 G 桿菌 4 G 桿菌 此外 如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性 橢圓形 有芽孢狀的較大菌體 可能是真菌 金黃色葡萄球菌 最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯 溶血環(huán) 顏色呈金黃色 灰白色或檸檬色分解葡萄糖 麥芽糖 蔗糖和甘露醇血漿凝固酶和DNA酶陽性 2020 3 8 41 葡萄球菌 念珠菌顯色培養(yǎng)基 綠色 白色念珠菌藍色 熱帶念珠菌白色 其他 細(xì)菌被抑制紫色 光滑粉色 克柔假絲酵母菌 嗜血桿菌的鑒定途徑 只能在營養(yǎng)條件高的巧克力平板上生長 菌落為中等大小 圓形 灰白色 透明革蘭染色 G 小桿菌衛(wèi)星實驗就可以幫助初步鑒定 2020 3 8 48 嗜血桿菌 奈瑟氏菌屬鑒定 在血平板和巧克力平板上生長 mac上不生長血平板形成灰色 濕潤 透明或半透明 不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形 灰藍色的似露滴狀菌落革蘭染色 G 雙球菌 呈腎形或咖啡豆形 凹面相對氧化酶和觸酶都均為陽性 奈瑟氏菌屬有11個種 臨床就淋病奈菌和腦膜炎奈瑟菌最為重要 奈瑟氏菌屬鑒定流程 菌落觀察 灰色 濕潤 透明或半透明 不溶血涂片染色 G 雙球菌 呈腎形或咖啡豆?fàn)钛趸冈囼?觸酶 麥芽糖 腦膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌 細(xì)菌的鑒定與藥敏 衛(wèi)生部重點監(jiān)控的6種MDRO MASA 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 判斷標(biāo)準(zhǔn) 對苯唑西林耐藥或頭孢西丁誘導(dǎo)實驗陽性CRAB 耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌 判斷標(biāo)準(zhǔn) 對亞胺培南或美羅培南耐藥VER 耐萬古霉素腸球菌 判斷標(biāo)準(zhǔn) 對萬古霉素耐藥 ESBLs 產(chǎn)超廣譜 內(nèi)酰胺酶細(xì)菌 包括 大腸埃希菌 肺炎克雷伯菌 產(chǎn)酸克雷伯菌等 判斷標(biāo)準(zhǔn) 對第3代和第4代頭孢菌素和氨曲南耐藥CRE 耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌 判斷標(biāo)準(zhǔn) 對亞胺培南等碳青霉烯類耐藥MDR XDROA 多重耐藥 泛耐藥銅綠假單胞菌 判斷標(biāo)準(zhǔn) 對亞胺培南等碳青霉烯類耐藥 臨床常見問題 痰涂片與痰培養(yǎng)結(jié)果不一致 培養(yǎng)和涂片選擇的痰液不同 標(biāo)本采集時間過長 部分苛養(yǎng)菌死亡 選擇藥敏結(jié)果敏感的藥物 臨床治療無效 體外藥敏試驗只能預(yù)測體內(nèi)治療效果 并不等同 一般來說 耐藥 治療無效 敏感 治療有效 今天培養(yǎng)結(jié)果與前天結(jié)果不一樣 1 取材是否規(guī)范 2 痰標(biāo)本有時候選擇優(yōu)勢菌做 可能結(jié)果不一樣3 抗生素的使用鑒定結(jié)果為四聯(lián)球菌