龍牙百合在組織培養(yǎng)過程中的酶譜分析(doc 18頁).doc

本科生畢業(yè)設計(論文)中文題目龍牙百合在組織培養(yǎng)過程中的酶譜分析 外文題目 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture 學號 0507040099 姓名 彭 靜 學院生 命 科 學 學 院 專業(yè)生 物 科 學 指導教師 完成時間2009-4-30 江西師范大學教務處制目錄摘 要1Abstract21 文獻綜述31.1龍牙百合的生物學特征及價值31.1.1龍牙百合的生物學特征31.1.2龍牙百合的價值31.2龍牙百合在組織培養(yǎng)過程中過氧化物酶活性變化的研究現(xiàn)狀31.3國內(nèi)外同工酶研究現(xiàn)狀及應用41.4 研究的目的和意義42 實驗材料、主要儀器與試劑42.1實驗材料52.2實驗主要儀器52.3實驗試劑53 實驗方法53.1技術路線53.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件53.3確定上樣量63.4電泳64試驗結(jié)果及分析84.1組織培養(yǎng)過程中龍牙百合生長與分化情況84.2過氧化物酶同工酶與龍牙百合生長分化的關系95討論96對下一步工作的建議10參考文獻11附圖12致 謝15摘 要在組織培養(yǎng)過程中，為研究龍牙百合生長分化與過氧化物酶同工酶的關系，對龍牙百合進行組織培養(yǎng)并采用聚丙烯酰胺不連續(xù)體系盤狀電泳(垂直管電泳)分離不同階段過氧化物同工酶。結(jié)果：在龍牙百合生長分化過程及不同組織過氧化物酶同工酶酶譜有很大差異，過氧化物酶同工酶酶譜可作為判別龍牙百合生長分化進程的依據(jù)。關鍵詞：龍牙百合,非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,過氧化物酶同工酶 The zymography for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker in the process of the tissue culture PENG JingAbstractIn the process of the tissue culture, a study on the relationship between the growth and differentiation and Peroxidase isozyme of Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was carried out . Tissue Culture for Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker was taken , To separate Peroxidase isozyme under different stages , the discontinuous system of discoid spolyacrylamide gel electrophoresis (vertical tube gel electrophoresis) was used. And the result showed that there was a great difference of map of peroxidase isoenzyme in the process of the growth and differentiation and among different tissues. The map may be as a basis for determination of the course of differentiation.Key words：LilumbrowniiF.E Browh Var virdum baker, polyacrylamide gel electrophoresis, Peroxidase isozyme1 文獻綜述1.1龍牙百合的生物學特征及價值1.1.1龍牙百合的生物學特征龍牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker)為百合科百合屬中能形成鱗莖的栽培品種, 多年生宿根草本植物。鱗莖近球形, 橫莖24.5cm，鱗片披針形, 白色, 無節(jié), 味淡不苦。根系由肉質(zhì)根和纖維狀根組成, 肉質(zhì)根又叫“ 下盤根” , 著生于鱗莖下部；纖維狀根又叫“上盤根” , 著生在鱗莖上部。葉散生, 倒披針形?；ㄈ榘咨邢銡? 一般稱白花百合。龍牙百合喜涼爽, 耐蔭蔽, 喜濕潤, 怕水澇, 10以上可以萌發(fā)生苗, 生長適溫為1624, 土層深厚、PH值5.76.3。排水良好的砂質(zhì)壤土最適宜生長1。龍牙百合以其干品瓣形肥大微彎，色澤潔白至寶黃，形似龍牙而著稱。1.1.2龍牙百合的價值 龍牙百合是一類藥食同源、有較高經(jīng)濟價值的特產(chǎn)蔬菜和藥用植物。龍牙百合以鱗莖入藥 ,為常用中藥 ,也可供提取淀粉或食用。龍牙百合含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、淀粉、磷脂、百合苷 A、B等抗癌性植物堿及維生素 B1、B2等營養(yǎng)物質(zhì) ,具有潤肺止咳、寧心安神、清熱解毒等作用 ,性微寒、味甘 ,是目前市場走俏的藥用保健食品2。具有養(yǎng)陰潤肺止咳，清心安神功用；主治陰虛燥咳，勞嗽咯血、肺瘺、虛熱、煩噪驚悸、失眠、多夢等；有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗疲勞、鎮(zhèn)靜、催眠、提高免疫力，升高外周白細胞等藥理作用。龍牙百合是最名貴的一種百合，它內(nèi)含豐富的生物堿，蛋白質(zhì)，礦質(zhì)元素等，是食品中的珍品，由開其價格昂貴，被奉為貴族食品。近幾年,我國百合產(chǎn)量增加較快,經(jīng)濟效益顯著3。1.2龍牙百合在組織培養(yǎng)過程中過氧化物酶活性變化的研究現(xiàn)狀在龍牙百合的組織培養(yǎng)過程中，植物過氧化物酶以其廣泛存在和特殊的生物學意義而引起日益深入的研究4。龍牙百合組培過程中對過氧化物酶活性變化的研究和其他百合屬植物一樣，一般都是通過測定植物發(fā)育不同時期內(nèi)的過氧化物酶活性變化規(guī)律,來研究植物的組織分化狀況5。過氧化物酶與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系6。在植物的代謝過程中它可以除去過多的H2O2，從而維持正常生理過程，避免了H2O2的毒害7。因此，研究過氧化物酶活性變化是非常必要。有許多公司、研究中心在過氧化物酶活性方面作了大量工作，并取得了較好的成就。1.3國內(nèi)外同工酶研究現(xiàn)狀及應用同工酶的研究得到了很大發(fā)展，同工酶在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)一定的代謝過程，因此，常被用于細胞分化、器官發(fā)生及個體發(fā)育過程中基因表達的研究，從同工酶的器官組織特異性也反映了基因表達的時空特異性。過氧化物同工酶在各種動物體內(nèi)廣泛存在9，而且在某些動物的不同器官組織內(nèi)酶譜存在一定的差異。研究分化進程及其與過氧化物酶同工酶的關系，可以進一步深入探索龍牙百合生長分化的基因表達差異，為龍牙百合生長分化調(diào)控提供理論指導。酶譜的變化已作為鑒定物種、研究分類與進化、遺傳與變異的重要指標10。而且由于同工酶是基因的產(chǎn)物，能直接反映基因的異同，易于觀察研究，目前已作為一種分化遺傳分化標志廣泛地應用于發(fā)育生物學、群體依次學、醫(yī)學、分類學等各個領域。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶，方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性強，測定結(jié)果便于觀察、記錄和保存11 12。但至今尚未見到有關龍牙百合生長分化狀況與過氧化物同工酶關系的研究。1.4 研究的目的和意義1.4.1研究目的在組織培養(yǎng)過程中，過氧化物酶同工酶不斷發(fā)生變化13。通過比較不同階段過氧化物同工酶譜的差異，來研究龍牙百合生長分化與過氧化物酶同工酶的關系。1.4.2研究意義作為基因表達的產(chǎn)物，測定同工酶譜是認識基因存在和表達的一種工具，在植物的生長分化研究中有重要的意義。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化，測定這種酶的同工酶14，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化，研究分化進程及其與過氧化物酶同工酶的關系，可以進一步深入探索龍牙百合生長分化的基因表達差異，為龍牙百合生長分化調(diào)控提供理論指導15 16。2 實驗材料、主要儀器與試劑2.1實驗材料涂藝聲教授細胞實驗室培養(yǎng)的龍牙百合(Lilumbrownii F.E Browh Var virdum baker)無菌苗。每隔10天對龍牙百合的莖段取一次樣。2.2實驗主要儀器垂直板電泳槽及附件（玻璃板、硅膠條、梳子、導線等）、穩(wěn)壓穩(wěn)流直流電泳儀、高速冷凍離心機、電子分析天平2.3實驗試劑見附表4 聚丙烯胺凝膠電泳貯液配制方法，但染色使用醋酸聯(lián)苯胺染色。醋酸聯(lián)苯胺染色：0.1g聯(lián)苯胺+5ml無水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸鈉+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的雙蒸水。溶解并過濾待用。膠片用雙蒸水沖洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶帶完全出現(xiàn)后（約20min），用自來水沖洗2-3次，再隔一天換一次水，總共換2-3次。3 實驗方法3.1技術路線本實驗擬采取如下技術路線：無菌苗外植體接種培養(yǎng)不連續(xù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物酶同工酶酶譜分析(定期觀察龍牙百合的培養(yǎng)情況,看其生長勢態(tài)，同時測定過氧化物和硝酸還原酶活性,做紀錄)3.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件本試驗采用的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其配方查閱有關的資料，另外附加6一BA、NAA植物激素。蔗糖分別為每升培養(yǎng)基30g，瓊脂每升培養(yǎng)基 5.8 g，pH 為5.8 ，在容量為200ml的三角瓶中裝入50ml，并以高壓蒸汽滅菌鍋 在118下滅菌25分鐘，培養(yǎng)溫度為(25+2),光照度為1500lx,光照12 h/d。 表1 2種培養(yǎng)基成分Table 3 culture medium ingredient培養(yǎng)基編號培養(yǎng)基成分1號1/2MS基本培養(yǎng)基+BA 1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +20g/l 蔗糖2號1/2MS基本培養(yǎng)基+ BA1.5 mg/ml + NAA 0.05 mg/ml +30 g/l 蔗糖3.3確定上樣量 設置一系列量（ul）（5、7.5、10、12.5、15、17.5、20），點樣在一塊電泳板上，然后進行電泳，發(fā)現(xiàn)點樣量為12.5ul和15ul的圖譜最清晰，所以上樣量確定為12.515ul.3.4電泳17參照參考文獻13中聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物同工酶。用10倍pH8.3的Tris甘氨酸緩沖液，分離膠采用過硫酸銨TEMED催化系統(tǒng)，pH8.9，凝膠總濃度T7.1%，濃縮膠采用核黃素TEMED催化系統(tǒng)，pH6.7、T3.1%，電極緩沖液為pH8.3Tris甘氨酸系統(tǒng)。加樣量15ul，電泳在4度條件下進行，開始穩(wěn)壓為100v，指示劑溴酚藍進入分離膠后恒壓200v，電泳時間約一個半小時。3.4.1貯液配制按表2配制貯液。3.4.2電泳槽的安裝垂直板電泳槽的式樣很多，目前流行的是用有機玻璃做的兩個“半槽”組成的方形電泳槽，中間夾著凝膠模子，是由成套的兩塊玻璃板裝入一個用硅酮橡膠做成的模套而構(gòu)成，由硅酮橡膠套決定兩玻璃板之間距離約為1.5mm，形成一個“膠室”，膠就在這兩板之間的膠室內(nèi)聚合成平板膠。當凝膠模子與兩半槽固定在一起后，凝膠槽子兩側(cè)形成前后兩個槽，供裝電極緩沖液和冷凝管用。將兩塊玻璃板用去污劑洗凈，再用蒸餾水沖洗，直立干燥（勿用手指接觸玻璃板面，可用手夾住玻璃板的兩旁操作），然后正確放入硅膠條中。3.4.3凝膠的制備將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。按表3比例配制分離膠將分離膠沿長玻璃板加入膠室內(nèi)，小心不要產(chǎn)生氣泡，加至距短玻璃板頂端3cm處，立即覆蓋23mm的水層（或水飽和正丁醇），靜置待聚合（約40min），當膠與水層的界面重新出現(xiàn)時表明膠已聚合。按表4比例配制濃縮膠注：TEMED在灌膠前加。先倒掉分離膠上的水層，立即加入濃縮膠，插入梳子（即樣品槽模板），待膠凝后，小心取出梳子。將稀釋10倍的電極緩沖液倒入兩槽中，前槽（短板側(cè)）緩沖液要求沒過樣品槽，后槽（長板側(cè)）緩沖液要求沒過電極，備用。（放在有燈光處聚合）3.4.4樣品的制備稱取龍牙百合莖部0.5 g，放入研缽內(nèi)，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成勻漿，然后以2 mL提取液分幾次洗入離心管，在高速離心機上以6000r/min離心15min，倒出上清液，以等量40蔗糖及1/5體積溴酚藍指示劑混和，留作點樣用。3.4.5點樣去掉膠套。用微量注射器（50L）吸取少量樣液，在濃縮膠上層點樣，每個點樣槽1550L。點樣時須小心，防止樣品液的擴散。3.4.6電泳將電泳槽放入冰箱，接好電源線（前槽為負極）。打開電源開關，調(diào)節(jié)電流到100V(約50min)左右，樣品進入到分離膠后加大到200V，維持恒壓。待指示染料下行到距膠板末端1cm處，即可停止電泳。把調(diào)節(jié)旋扭調(diào)至零，關閉電源，電泳約一個半小時。3.4.7剝膠取出電泳膠板，掀開玻璃，去掉濃縮膠。3.4.8染色、記錄結(jié)果醋酸聯(lián)苯胺染色：0.1g聯(lián)苯胺+5ml無水乙醇+10ml 1.5mol/L乙酸鈉+10mol 1.5mol/L乙酸+75ml的雙蒸水。溶解并過濾待用。膠片用雙蒸水沖洗3次后，在染液中加入0.14ml 30% H2O2。待酶帶完全出現(xiàn)后（約20min），用自來水沖洗2-3次，再隔一天換一次水，總共換2-3次。倒掉染色液，重新加入7的乙酸溶液，于日光燈下觀察記錄酶譜，繪圖或照相。4試驗結(jié)果及分析4.1組織培養(yǎng)過程中龍牙百合生長與分化情況 4.1.接種20天后生長分化情況接種20天后，小塊近軸面基部稍有膨大、生長。4.1.2接種30天后生長分化情況接種30天后，無菌小鱗莖的獲得。小塊近軸面基部經(jīng)過膨大、生長,成為小鱗莖,同時有生根現(xiàn)象,一般每一小塊可產(chǎn)生23個小鱗莖。(附圖1)4.1.3接種40天后生長分化情況接種40天后，在小鱗片基部出現(xiàn)小突起,以后長大。多數(shù)生長出細長葉片,造成小鱗莖不飽滿;不抽生葉片的小鱗莖相對要肥厚。(附圖2)4.1.4接種50天后生長分化情況接種50天后，小鱗片基部出現(xiàn)白色愈傷組織,表面出現(xiàn)許多圓形突起,這些突起中有一部分隨愈傷組織發(fā)育為次生小鱗莖。在鱗莖盤基部產(chǎn)生大量根系,形成一顆完整植株。(附圖3)4.2過氧化物酶同工酶與龍牙百合生長分化的關系遷移率（Rf）= 酶帶移動距離/指示劑移動距離。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離過氧化物酶同工酶實驗中，發(fā)現(xiàn)龍牙百合組織培養(yǎng)過程不同生長分化階段出現(xiàn)不同的過氧化物酶酶譜。發(fā)現(xiàn)生長分化期龍牙百合莖段的POD同工酶（染色最深）且表達的酶譜條帶最多。而生長分化前期龍牙百合莖段的POD同工酶的活性很低（染色最淺），且條帶最少。在各酶帶中，相對遷移率為0.188的酶帶2為生長分化階段的共有酶帶。但隨著分化進程的加深，會逐漸出現(xiàn)3條酶帶，其相對遷移率分別為0.245、0.126、0.061，可作為判定生長分化進程的特征帶。在龍牙百合生長分化的未分化期酶帶較弱或缺失，但隨著花芽分化進程的加深而出現(xiàn)，酶活性也有所加強。說明組織培養(yǎng)過程中過氧化物酶同工酶的表達和活性與不同生長分化階段有關。如圖所示（附圖4）。5討論盡管目前對過氧化物酶的生理功能還認識不夠，但根據(jù)其與植物生長發(fā)育及組織分化之間所表現(xiàn)的比較穩(wěn)定的關系，可以用它作一般組織分化的指標之一。過氧化物酶普遍存在于高等植物并在植物的生長發(fā)育中起重要作用。過氧化物酶是遺傳信息表達的較好標志，它的合成受一系列基因所調(diào)控?；虮磉_的時空差異決定了同工酶在細胞分化、組織器官的形成及個體發(fā)育中酶譜的某種變化和同工酶譜的器官和組織的特異性，也即同工酶的可變性。本實驗以龍牙百合的莖段為材料進行過氧化物酶同工酶分析發(fā)現(xiàn)，龍牙百合生長分化階段過氧化物酶同工酶譜有明顯差別，龍牙百合莖段生長分化期的過氧化物酶同工酶酶譜比生長分化期多3條酶帶，表明利用過氧化物酶同工酶分析鑒別作一般組織分化的指標是可行的。因此，可以通過酶譜的變化判斷龍牙百合生長分化的進程。經(jīng)過對組織培養(yǎng)過程不同生長分化階段的反復實驗，得出不同的酶譜，可以初步認定生長分化的不同階段，酶的種類與含量是時刻發(fā)生改變的。實驗受如下因子的限制，所得出的結(jié)論仍需要進一步研究：僅試植物材料莖段，沒有對其它不同部位進行實驗，如葉子等。因?qū)嶒灂r間所限，僅對過氧化物酶同工酶進行了分析，而未對其它同工酶如超氧化物進行分析 。6對下一步工作的建議本試驗只對過氧化物酶同工酶（POD）酶譜進行了分析，還應多對幾種酶，如過氧化氫酶同工酶（CAT）、酯酶、超氧化物歧化酶（SOD）等的酶譜進行生理指標分析,以便能更好地說明問題。參考文獻1 夏鎮(zhèn)澳.植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)J.植物生理學通訊,1995,31 (1):62-642 Zhuping Gu,Arditti J.et al.The effects of BA,2,4-Dand IAA on sboot-tip cultures of CymbidiumJ.Lindleyana,1987,2(2):88-903 Thomas J.Shcchen,Orchide.In introduction for flori-cultureJ.Roy A.Laraen,1980:133-1634 蔣小滿,趙建萍,畢可華.“艾西絲”南瓜誘導生根過程中過氧化物酶活性及同工酶的研究J. 1998,18(3):397-4005 Anderson W.C Propagation of Rhododendrons by Tissue Culture:Part I.Development of a CultureMedium for Multiplication of ShootsJ.Proc.Intl.Plant Prop. 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