分子生物學(xué)筆記完全版.DOC

分子生物學(xué)筆記第一章 基因的結(jié)構(gòu)第一節(jié) 基因和基因組一、基因(gene)是合成一種功能蛋白或RNA分子所必須的全部DNA序列一個典型的真核基因包括編碼序列外顯子(exon)插入外顯子之間的非編碼序列內(nèi)合子(intron)5-端和3-端非翻譯區(qū)(UTR) 調(diào)控序列(可位于上述三種序列中)絕大多數(shù)真核基因是斷裂基因(split-gene)，外顯子不連續(xù)。二、基因組(genome)一特定生物體的整套(單倍體)遺傳物質(zhì)的總和，基因組的大小用全部DNA的堿基對總數(shù)表示。人基因組3X1 09(30億bp)，共編碼約10萬個基因。每種真核生物的單倍體基因組中的全部DNA量稱為C值，與進化的復(fù)雜性并不一致(C-value Paradox)。人類基因組計劃（human genome project, HGP）基因組學(xué)（genomics）,結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics）和功能基因組學(xué)（functional genomics）。蛋白質(zhì)組（proteome）和蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）第二節(jié) 真核生物基因組一、真核生物基因組的特點： ，真核基因組DNA在細胞核內(nèi)處于以核小體為基本單位的染色體結(jié)構(gòu)中真核基因組中，編碼序列只占整個基因組的很小部分(23)，二、真核基因組中DNA序列的分類 (一)高度重復(fù)序列(重復(fù)次數(shù)lO5)衛(wèi)星DNA(Satellite DNA)(二)中度重復(fù)序列1中度重復(fù)序列的特點重復(fù)單位序列相似，但不完全一樣，散在分布于基因組中序列的長度和拷貝數(shù)非常不均一，中度重復(fù)序列一般具有種屬特異性，可作為DNA標記中度重復(fù)序列可能是轉(zhuǎn)座元件(返座子)，2中度重復(fù)序列的分類長散在重復(fù)序列(long interspersed repeated segments) LINES短散在重復(fù)序列(Short interspersed repeated segments) SINESSINES：長度105如人Alu序列LINEs：長度1000bp(可達7Kb),拷貝數(shù)104-105，如人LINEl(三)單拷貝序列(Unique Sequence)包括大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列，三、基因家族(gene family)一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)經(jīng)重復(fù)(duplication)和突變產(chǎn)生?；蚣易宓奶攸c：基因家族的成員可以串聯(lián)排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串聯(lián)重復(fù)基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和組蛋白的基因；有些基因家族的成員也可位于不同的染色體上，如珠蛋白基因；有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這種基因稱為假基因 (Pseudogene)a1表示與a1相似的假基因假基因分類。加工過的假基因(processed pseudogene)。典型的基因家族1tRNA基因 單倍體人基因組中1300個tRNA基因，tRNA基因簇2rRNA基因l00copyrRNA基因簇(重復(fù)單元28S、18S、5.8s-rRNA)3組蛋白基因30-40copy定位：7q32-q36組蛋白基因簇(重復(fù)單位：H1，H2A，H2B，H3、H4)特點：無intron，Poly(A)- RNA 4珠蛋白基因類：16p13，基因簇(24Kb)：51213類：11p15，基因簇(60Kb)：5 GrAr3四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily)由基因家族和單基因組成的大基因家族，結(jié)構(gòu)上有程度不等的同源性，但功能不同五、人類基因組中的重復(fù)序列標記1、A1u序列單倍體人基因組50萬-100萬拷貝，平均每隔3-6Kb就有一個Alu序列，人A1u序列長300bp：2X130bp重復(fù)序列； +31bp間隔序列(中間)；兩側(cè)7-21bp正向重復(fù)(direct repeats)，返座子?Alu序列廣泛散布于人基因組，約90%巳克隆的人基因合有Alu序列Alu序列標志。2、可變數(shù)串聯(lián)重復(fù) ， Variable number tamdem repeat， VNTR又稱小衛(wèi)星DNA(minisatellite DNA)由短重復(fù)單位(6-40bp)串聯(lián)重復(fù)(6-100次以上)而成，多位于基因的非編碼區(qū)，廣泛分布。VNTR多態(tài)性分子標記DNA指紋圖（fingerprint）.小衛(wèi)星DNA突變與腫瘤，H-Ras。3、短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat,STR）又稱微衛(wèi)星DNA（microstallite DNA）2-6個核苷酸組成的重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)(10-60次),兩側(cè)為特異的單拷貝序列，人基因組中每l0kb DNA序列至少一個STR序列。CA)n，50，000-100，000拷貝新一代遺傳標記，人類基因組研究，腫瘤，遺傳病第三節(jié) 線粒體基因組人線粒體基因組的特點：1、人線粒體基因組為16，569bp的雙鏈閉環(huán)分子，一條鏈為重鏈(H鏈)，一條鏈為輕鏈(L鏈)，兩條鏈均有編碼功能，每個mtDNA分于編碼13種蛋白質(zhì)和24種結(jié)構(gòu)RNA(22rRNA，2tRNA)2、線粒體DNA為母系遺傳3、結(jié)構(gòu)基因不含內(nèi)含子，部分區(qū)域有基因重疊，因此病理性mtDNA突變更易發(fā)生4、mtDNA突變頻率更高5、線粒體DNA突變的表型表達與核DNA不同。第四節(jié) 細菌和病毒基因組一、細菌基因組的特點。1功能相關(guān)的幾個結(jié)構(gòu)基因往往串聯(lián)在起，受它們上游的共同調(diào)控區(qū)控制，形成操縱子結(jié)構(gòu)，2結(jié)構(gòu)基因中沒有內(nèi)含子，也無重疊現(xiàn)象。3細菌DNA大部分為編碼序列。二、病毒基因組的特點1每種病毒只有一種核酸，或者DNA，或者RNA；2病毒核酸大小差別很大，3X103一3X106bp；3除逆病毒外，所有病毒基因都是單拷貝的。4大部份病毒核酸是由一條雙鏈或單鏈分子(RNA或DNA)，僅少數(shù)RNA病毒由幾個核酸片段組成 5真核病毒基因有內(nèi)含子，而噬菌體（感染細菌的病毒）基因中無內(nèi)含子6有重疊基因第五節(jié) 染色質(zhì)和染色體細胞分裂間期染色質(zhì)(chromatin)分裂期染色體(chromosome)一、染色質(zhì)的基本單位核小體(一)核小體(nucleosome)結(jié)構(gòu)DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對)核心外1.8周(146bp),形成核小體核心顆粒。兩個核小體核心顆粒之間有Linker DNA(0-80bp)，核小體核心顆粒+Linker=核小體(長180-210bp)核小 體DNA Ladder(二)組蛋白(histone)：一類小的帶有豐富正電荷5%的人基因可在不同的組織或生理狀態(tài)下，通過選擇性剪接產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，這是造成真接生物高度異質(zhì)性的基礎(chǔ)。第四節(jié) 翻譯水平調(diào)控一、翻譯起始因子(IF)的調(diào)節(jié)：可逆磷酸化的作用1eIF-4F的磷酸化激活蛋白質(zhì)的合成2eIF-2的磷酸化引起翻譯起始受阻，降低蛋白質(zhì)的生物合成水平二、mRNA結(jié)構(gòu)與翻譯控制 ，（一)5-UTR結(jié)構(gòu)1、mRNA5端m7G帽有增強翻譯水平的作用2、“上游AUG密碼子”(位于起始AUG上游的其他AUG密碼子)的存在往往抑制下游開放讀框的翻譯效率3、起始AUG旁側(cè)序列對翻譯效率的影響Kozak序列：GCCAUGG(二)3-UTR結(jié)構(gòu)1poly(A)尾增加翻譯效率2富含UA序列抑制翻譯。三、mRNA穩(wěn)定性與翻譯控制mRNA穩(wěn)定性主要取決于3UTR結(jié)構(gòu)1poly(A)尾增加mRNA穩(wěn)定性，23-UTR中UA序列導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定四、翻譯后修飾1、 氨基酸側(cè)鏈的共價修飾：乙?；⒘姿峄?、糖基化（N-、O-）；2、 蛋白質(zhì)前體的切割和成熟。Proproteinprotein.例：胰島素的成熟。五、蛋白質(zhì)的分泌和胞內(nèi)定位信號肽：作為蛋白質(zhì)定位信號的短肽序列，指導(dǎo)蛋白質(zhì)運輸?shù)秸_位置，定位結(jié)束后通常被特異的信號肽酶切除。常見幾種信號肽的特點：1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞分泌信號：N-端約20個左右氨基酸，疏水。2 線粒體定位信號：N-端，一面為正電殘基另一面為疏水殘基的兩親螺旋。3 核定位信號：內(nèi)部，常為堿性氨基酸加脯氨酸鏈兩部分構(gòu)成。如SV40 T 抗原：pro-lys-lys-lys-Arg-lys(127-132) 第四章 原癌基因與抑癌基因第一節(jié) 概述病毒致癌作用，病毒癌基因Viral oncogene，V-onc).。細咆癌基因(cellular oncogene ，c-onc)或原癌基因(protoncogene)正常細胞中與v-onc同源的基因，抑癌基因(tumor suppressor gene)：是指由于其存在和表達而抑制細胞癌變的基因。原癌基因與抑癌基因生物學(xué)性質(zhì)差異：1功能：抑癌基因在細胞生長中起負調(diào)節(jié)作用，抑制增殖、促進分化成熟與衰老，或引導(dǎo)多余細胞進入程序性細胞死亡(PCD)，原癌基因的作用則相反2遺傳方式：原癌基因是顯性的，激活后即參與促進細胞增殖和癌變過程，而抑癌基因為隱性，只有發(fā)生純合失活時才失去抑癌功能3突變的細胞類型：抑癌基因突變不僅可發(fā)生在體細胞中，也可發(fā)生在生殖系(germ 1ine)細胞中，并通過其遺傳突變，而原癌基因只在體細胞中產(chǎn)生突變。第二節(jié) 原癌基因原癌基因是細胞的正?；?，其表達產(chǎn)物對細胞的生理功能極其重要，只有當(dāng)原癌基因發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或過度表達時，才有可能導(dǎo)致細胞癌變。一、原癌基因表達的特點：l、正常細胞中原癌基因的表達水平一般較低，而且是受生長調(diào)節(jié)的，其表達主要有三個特點：具有分化階段特異性；細胞類型特異性； 細胞周期特異性。2、腫瘤細胞中原癌基因的表達有2個比較普遍和突出的特點：一些原癌基因具有高水平的表達成過度表達原癌基因的表達程度和次序發(fā)生紊亂，不再具有細胞周期特異性。3、細胞分化與原癌基因表達 在分化過程中，與分化有關(guān)的原癌基因表達增加，而與細胞增殖有關(guān)的原癌基因表達受抑制。二，原癌基因的結(jié)構(gòu)改變與其表達激活(一)點突變C-ras：12、13、61位密碼子點突變，存在于多種腫瘤C-ras編碼蛋白(21kD,P21)：RAS，是一種GTP結(jié)合蛋白，具GTP酶活性，是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(二)染色體易位染色體易位(translocation)：是染色體的一部分因斷裂脫離，并與其它染色體聯(lián)結(jié)的重排過程。因染色體易位造成的原癌基因激活：1、 因易位使原癌基因與另一基因形成融合基因，產(chǎn)生一個具有致癌活性的融合蛋白，如t(9：22)使c-abl與bcr融合，產(chǎn)生一個致癌的P210蛋白2、因易位面使原癌基因表達失控，如t(8：14)易位使c-myc表達失控(三)基因擴增基因擴增(gene amplification)即基因拷貝數(shù)增加如HL-60和其它白血病細胞，C-myc擴增8-22倍其它：c-erb B，c-net(四)LTR插入LTR是逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組兩端的長末端重復(fù)(long terminal repeat)，其中含有強啟動子序列。三、原癌基因產(chǎn)物的功能大多數(shù)原癌基因編碼的蛋白質(zhì)都是復(fù)雜的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的成份，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有著重要的作用原癌基因產(chǎn)物可作為：1、生長因子，如sis(PDGF-)，fgf家族(int-2，csf-1等)2、生長因子受體(質(zhì)膜)：具酪氨酸蛋白激酶活性，如neu，ht，met，erbB，trk，fms，ros-1等。 3、非受體酪氨酸蛋白激酶(質(zhì)膜胞質(zhì))如src家族：src，syn，fyn，abl，lck，ros，yes，fes，ret等4、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(胞質(zhì))：如raf，raf-1，mos，pim-1，5、G蛋白(質(zhì)膜內(nèi)側(cè))，具GTP結(jié)合作用和GTP酶活性，如ras家族中的 H-ras，K-ras，N-ras，以及mel和ral等 ，6核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)如myc家族，fos家族，Jun家族，ets家族，rel，erb A(類固醇激素受體)第三節(jié) 抑癌基因一、抑癌基因失活與雜合性丟失抑癌基因為隱性癌基因，只有發(fā)生純合失活時才對腫瘤形成起作用，通常的表現(xiàn)為抑癌基因的一個等位基因丟失，面另一個存留的等位基因發(fā)生突變(點突變、微缺失，重排等)，等位基因丟失常伴有抑癌基因相鄰區(qū)域的雜合性丟失(Loss of heterozygosity，LOH)，LOS指腫瘤中特定染色體上某種DNA多態(tài)性標志(如RFLP，VNTR、STR或SSCP等)的等位基因片段在同一患者中由正常組織基因組中的兩種變?yōu)橐环N，即等位基因型由雜合子變?yōu)榧兒献?。LOH是腫瘤細胞中部分染色體區(qū)域缺失的表現(xiàn)。二、抑癌基因產(chǎn)物的功能巳知的腫瘤抑制基因及其蛋白產(chǎn)物功能基因 相關(guān)癌 產(chǎn)物胞內(nèi)定位 作用p53 Rb WT-1 APC DCC NF l RET VHL P16(MTS-1) WAFCIPl BRCAl 肺癌、乳腺癌等（51種） 視網(wǎng)膜細胞瘤等wilm腫瘤 結(jié)腸癌 結(jié)腸癌 神經(jīng)纖維 瘤甲狀腺癌 腎癌 黑素瘤等(多種) 多種乳腺癌、宮頸癌等 核胞質(zhì)？ 粘附分子GTP酶激活劑受體酪氨酸激酶 轉(zhuǎn)錄延伸因子 CDK抑制劑 CDK抑制劑 轉(zhuǎn)錄因子 抑癌基因p53人P53基因定位：17P13，11個外顯子編碼393個氨基酸。p53基因突變：存在于一半以上的人腫瘤中，多為點突變，主要發(fā)生于外顯子5-8,如肝癌中的249號密碼子第3堿基GT ,與黃曲霉素B1有關(guān)。 P53蛋白結(jié)構(gòu)和功能：P53蛋白為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，包括核心區(qū)的DNA結(jié)合域；N端轉(zhuǎn)錄激活域；C端介導(dǎo)寡聚體化的結(jié)構(gòu)域。1、 P53的中央域識別和結(jié)合一個10bp的啟動子序列，可激活轉(zhuǎn)錄（通過N-端的反式激活域）。P53突變大多發(fā)生于中央DNA結(jié)合域。2、 P53也可結(jié)合DNA損傷時產(chǎn)生的單鏈區(qū)域。3、 P53是四聚體，寡聚化需要C-端域4、P53激活cki p21, 后者抑制細胞周期于G1期. 5、 p53 激活與負責(zé)輻身損傷的修復(fù)蛋白GADD45，維持基因組穩(wěn)定性。 6、P53誘導(dǎo)凋亡的機制尚不清楚。 7、正常情況下p53以低水平存在，半衰期短。DNA損傷穩(wěn)定P53并增加其轉(zhuǎn)錄活性8、Mdm2使p53不穩(wěn)定，易被降解，并能直接抑制其反式激活活性（Mdm2是癌基因） 第五章 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞外信號通過與細胞表面的受體相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號并在細胞內(nèi)傳遞的過程稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程包括：1，胞外信號被質(zhì)膜上的特異性受體蛋白識別，受體被活化；2，通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用傳遞信號；3，信號導(dǎo)致效應(yīng)物蛋白的活化，引發(fā)細胞應(yīng)答（如激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達）。第一節(jié) 胞內(nèi)信使細胞內(nèi)信使(intracellular messenger)是具有信息傳遞作用的一些小分子，也稱為第二信使(second messengers)。一、cAMP環(huán)磷酸腺苷) ，生成： 腺苷酸環(huán)化酶催化ATP生成cAMP;代謝： cAMP磷酸二酯酶水解cAMP產(chǎn)生5-AMP功能： ，激活蛋白激酶A抑制蛋白磷酸酯酶二、cGMP(環(huán)磷酸鳥苷)生成酶：鳥苷酸環(huán)化酶代謝酶：cGMP磷酸二酯酶功能：激活蛋白激酶G 調(diào)控細胞膜離子通道三、三磷酸肌醇（inositol triphosphate,IP3）和甘油二酯（diacyglycerol, DAG）G-蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C生成IP3及DAG功能：1、IP3：開放胞內(nèi)鈣庫，激活Ca2+途徑2、DAD：在Ca2+和磷脂酰絲氨酸存在下，激活蛋白激酶C，四、鈣離子細胞內(nèi)鈣離子主要貯存于胞內(nèi)鈣庫(如肌細胞的肌漿網(wǎng)，SR)和線粒體中。細胞質(zhì)膜兩鍘Ca2+跨膜梯度：細胞外液胞漿胞漿內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)一通過(質(zhì)膜和鈣庫膜上的)鈣離子通道(進入)和鈣泵(出)，鈣通道開放的條件：質(zhì)膜或鈣庫膜去極化(可興奮細胞)；成IP3介導(dǎo)鈣庫膜上鈣通道開放(任何細胞)鈣泵激活線粒體鈣泵的作用Ca2+功能：與鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)結(jié)合形成Ca2+CaM復(fù)合物：激活腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶，激活Ca2+CaM依賴蛋白激酶鈣通道阻斷劑及其臨床應(yīng)用。五、一氧化氮(NO)NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸NO合成酶(NOS)分類：神經(jīng)元型(nNOS)內(nèi)皮細胞型(ecNOS)誘導(dǎo)型（iNOS)功能：激活烏苷酸環(huán)化酶，刺激cGMP合成。NO的生理病理作用第二節(jié) 蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶蛋白激酶(Protein kinase，PK)催化蛋白質(zhì)的含羥基氨基酸(絲蘇和酪)的側(cè)鏈羥基形成磷酸酯（ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移至氧）蛋白質(zhì)磷酸酯酶(Protein phosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯鍵水解而去磷酸化。細胞內(nèi)任何一種蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的兩種相反酶活性之間的平衡決定的。蛋白質(zhì)可逆磷酸化的調(diào)節(jié)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要作用，是細胞生命活動的調(diào)控中心。一、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的蛋白激酶一)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(SerThr PK)是一大類特異地催化蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的激酶家族，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。1、蛋白激酶A（PKA)-cAMP依賴性蛋白激酶.PKA由兩個催化亞基C和兩個調(diào)節(jié)亞基R所構(gòu)成PKA參與cAMP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。PKA的其它(下游)底物：多種代謝相關(guān)酶核內(nèi)組蛋白和非組蛋白膜蛋白等。2、蛋白激酶C(PKC)-Ca2+激活的磷脂依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)：可被Ca2+，DAG和磷脂酰絲氨酸激活TPA(佛波酯)也可激活PKC分子由N-端的調(diào)節(jié)區(qū)和C端催化區(qū)（親水的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）所組成。 PKC有多種亞型(12種)PKC可激活：受體，如EGFR，胰島素受體，細胞因子受體等。細胞骨架蛋白如Map，Tau膜蛋白，如Na+-H+交換蛋白，Ca2+-ATP酶等核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，起始因子等，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物如鳥苷酸環(huán)化酶，Raf-1等3、Ca2+鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(Cam-PK)Cam-PKII是一種多功能的蛋白激酶4。cGMP依賴的蛋白激酶(PKG)功能：調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子5，DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)調(diào)節(jié)：結(jié)合游離DNA片段后被激活，底物：核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，如SPl，F(xiàn)osJun，Myc和P53，作用：參與DNA修復(fù)和重組,通過激活TF調(diào)節(jié)基因表達;參與細胞周期的關(guān)卡機制(Checkpoint).6絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK)調(diào)節(jié)：MAPK激酶-MAPKK（MEK）。下游底物：核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如Myc，Jun，Ets及其它胞內(nèi)蛋白(二)酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase，TPK)特異地催化蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基磷酸化，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化在細胞生長，分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)中起重要作用。1、經(jīng)典的src激酶家族原癌基因c-src蛋白產(chǎn)物Src是一種酪氨酸蛋白激酶，它有三個基本結(jié)構(gòu)域：從C-端至N-端依次為SH1、SH2，SH3(SH=src homolog)。SHl結(jié)構(gòu)域：具酪氨酸激酶活性，SH2結(jié)構(gòu)域：能識別并結(jié)合含磷酸化酪氨酸的短序列，SH結(jié)構(gòu)域：通過脯氨酸和疏水性氨基酸殘基與靶蛋白結(jié)合，Src家族：包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd和yrk編碼蛋白，它們都有TPK活性共同參與細胞轉(zhuǎn)化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程SH2結(jié)構(gòu)域在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要作用：由于含SH2結(jié)構(gòu)域的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可以識別和結(jié)