2013.4丁芬—小容量注射劑藥液微生物污染水平測(cè)試及工藝時(shí)間限度確定.ppt

小容量注射劑藥液微生物污染水平測(cè)試及工藝時(shí)間限度確定 2013年1月 丁芬 一 概述二 試驗(yàn)?zāi)康娜?試驗(yàn)方案四 試驗(yàn)結(jié)果及討論五 污染菌鑒定六 注意事項(xiàng) 一 概述 在無菌藥品的生產(chǎn)中 防止微生物污染一直是生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注重點(diǎn) 無菌是注射劑的主要質(zhì)量要求和安全性指標(biāo)之一 按照藥典進(jìn)行無菌檢查是存在局限性的 污染率越低 同樣的取樣量誤將產(chǎn)品判為合格的概率越高 在同一個(gè)污染率下 取樣量越大 以無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷批產(chǎn)品無菌的可信度就越高 一 概述 但是 對(duì)于污染率極低 如1 的批產(chǎn)品 即使加大取樣數(shù) 提高的可信度也是微不足道的 同時(shí) 過多的取樣量也增加了實(shí)驗(yàn)過程的污染概率 對(duì)無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷同樣造成影響 從無菌藥品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)分析存在微生物污染的因素 有利于進(jìn)行微生物污染控制 從而保證藥品的無菌水平 一 概述 藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范 2010年修訂 無菌藥品附錄第五十七條應(yīng)當(dāng)盡可能縮短藥液從開始配制到滅菌 或除菌過濾 的間隔時(shí)間 應(yīng)當(dāng)根據(jù)產(chǎn)品的特性及貯存條件建立相應(yīng)的間隔時(shí)間控制標(biāo)準(zhǔn) 二 試驗(yàn)?zāi)康?在一定的條件下 微生物將根據(jù)時(shí)間成幾何級(jí)數(shù)的增長(zhǎng) 因此 微生物污染水平監(jiān)測(cè) 實(shí)質(zhì)也是一種時(shí)間間隔管理的實(shí)施方法 我們通過檢測(cè)藥液稀配后至滅菌前生產(chǎn)過程不同時(shí)段藥液的微生物數(shù)量 建立微生物隨時(shí)間的變化趨勢(shì)關(guān)系 找到達(dá)到污染控制限度的時(shí)間點(diǎn) 預(yù)留一定的安全時(shí)間作為內(nèi)部控制時(shí)限要求 二 試驗(yàn)?zāi)康?無菌藥品滅菌與滅菌前產(chǎn)品的微生物污染程度有關(guān) 對(duì)滅菌前微生物污染狀況進(jìn)行檢控是對(duì)產(chǎn)品作無菌評(píng)價(jià)的先決條件 本次試驗(yàn)?zāi)M生產(chǎn)品種 XX注射液 規(guī)格 5ml 生產(chǎn)批量 12萬支 灌裝時(shí)間 8h 滅菌 6柜次 二 試驗(yàn)?zāi)康?除了微生物相關(guān)要求外 必須指出 部分產(chǎn)品在溶液或其他狀態(tài)下存在不穩(wěn)定性 極易降解 產(chǎn)生新的雜質(zhì) 因此基于藥品化學(xué)穩(wěn)定性的時(shí)間管理 也是確定存放時(shí)限的制定依據(jù) 三 試驗(yàn)方案 一 成立試驗(yàn)小組 明確職責(zé)1 小組成員 組長(zhǎng) 質(zhì)量負(fù)責(zé)人成員 QA QC 針劑車間2 職責(zé)2 1組長(zhǎng)負(fù)責(zé)審批 三 試驗(yàn)方案 2 2QA負(fù)責(zé)起草試驗(yàn)方案和報(bào)告試驗(yàn)過程取樣和環(huán)境監(jiān)測(cè) 生產(chǎn)全過程沉降菌和生產(chǎn)前中后塵埃粒子 風(fēng)速 溫濕度 負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)工作 以保證按規(guī)定項(xiàng)目順利實(shí)施 負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督 負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核 三 試驗(yàn)方案 2 3QC微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備及測(cè)試工作 負(fù)責(zé)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果出具檢驗(yàn)報(bào)告單 2 4針劑車間負(fù)責(zé)指定操作人員和清潔人員 負(fù)責(zé)按照生產(chǎn)工藝規(guī)程和操作SOP進(jìn)行操作 三 試驗(yàn)方案 二 確定風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)無菌檢查并不能保證最終滅菌產(chǎn)品的無菌狀態(tài) 應(yīng)當(dāng)把成品的無菌檢查看做確保無菌的一系列控制措施中的最后一項(xiàng)措施 因此 滅菌前產(chǎn)品的微生物控制應(yīng)當(dāng)作為生產(chǎn)中最重要的質(zhì)量保證措施和正常生產(chǎn)的先決條件 三 試驗(yàn)方案 我公司XX小容量注射劑為最終滅菌制劑 5ml生產(chǎn)線關(guān)鍵生產(chǎn)工藝流程為 稱量 濃配 超濾 稀配定容 過濾 微生物負(fù)載濾器 除菌過濾 灌裝 滅菌檢漏 三 試驗(yàn)方案 三 試驗(yàn)方案 經(jīng)過分析 對(duì)成品無菌可能產(chǎn)生影響的關(guān)鍵點(diǎn)為稀配液微生物污染水平 包括稀配結(jié)束時(shí)的稀配液 灌裝完成過程的稀配液 灌裝即將結(jié)束時(shí)的稀配液 灌裝液微生物污染水平 包括灌裝開始時(shí)的灌裝藥液 灌裝過程的灌裝藥液 灌裝即將完成時(shí)的灌裝藥液 滅菌前藥液微生物污染水平 三 試驗(yàn)方案 三 制定取樣計(jì)劃本次試驗(yàn)計(jì)劃模擬灌裝的時(shí)間為8小時(shí) 根據(jù)灌裝機(jī)的灌裝能力 確定生產(chǎn)批量為12萬支 滅菌6柜次 按照xx注射液工藝規(guī)程組織生產(chǎn) 對(duì)生產(chǎn)當(dāng)天的注射用水進(jìn)行微生物限度檢查 生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè) 溫度 濕度 塵埃粒子 生產(chǎn)前 生產(chǎn)過程 生產(chǎn)結(jié)束 風(fēng)速 生產(chǎn)前 生產(chǎn)結(jié)束 沉降菌 生產(chǎn)全過程 人員5指手套 接觸碟表面微生物 生產(chǎn)結(jié)束 三 試驗(yàn)方案 1 取樣點(diǎn)及取樣頻次樣品1 稀配罐內(nèi)的稀配液 自稀配定容結(jié)束后至生產(chǎn)結(jié)束 每隔1小時(shí)取樣檢測(cè)一次微生物量樣品2 除菌過濾之前的藥液 即自微生物負(fù)載濾器過濾后的藥液 自灌裝開始至灌裝結(jié)束 每隔1小時(shí)取樣檢測(cè)一次微生物量 三 試驗(yàn)方案 樣品3 灌裝后的藥品 即除菌過濾后的藥液 自灌裝開始至灌裝結(jié)束 每隔1小時(shí)取樣檢測(cè)一次微生物量樣品4 滅菌前藥液 即滅菌前放置時(shí)間最長(zhǎng)的藥液 取第一鍋和最后一鍋分別檢測(cè)微生物量樣品5 待滅菌藥液放置1小時(shí)后 取第一鍋和最后一鍋待滅菌時(shí)間最長(zhǎng)的藥液 滅菌程序啟動(dòng)后再放置一小時(shí)后檢測(cè)微生物量 三 試驗(yàn)方案 三 試驗(yàn)方案 三 試驗(yàn)方案 2 樣品標(biāo)簽 三 試驗(yàn)方案 3 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文件 藥品GMP指南 無菌藥品 藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南 2003年版 中華人民共和國(guó)藥典 2010年版 XX注射液工藝規(guī)程 三 試驗(yàn)方案 現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與驗(yàn)證技術(shù) 4 取樣器具取樣瓶為250ml無菌玻璃磨口瓶 三 試驗(yàn)方案 四 檢驗(yàn)方法采用薄膜過濾法進(jìn)行藥液的微生物限度檢查 取濾膜孔徑0 45 m 直徑為75mm的一次性全封閉薄膜過濾器 北京牛牛基因技術(shù)有限公司 濾器類型 NS01 75D1 將過濾器逐一插放在濾液槽座上 將其塑膠軟管裝入集菌儀的蠕動(dòng)泵的管槽內(nèi) 注意定位準(zhǔn)確 軟管走勢(shì)順暢 三 試驗(yàn)方案 其進(jìn)液軟管的雙芯針頭插入供試液容器的塞上 開啟集菌儀 將供試液容器倒置 使藥液均勻通過濾器 濾凈 打開過濾器菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng) 每種培養(yǎng)基制備一張濾膜 細(xì)菌培養(yǎng)3天 霉菌 酵母菌培養(yǎng)5天 逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況 點(diǎn)計(jì)菌落數(shù) 必要時(shí) 可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 一 微生物污染水平檢測(cè)結(jié)果見下表 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 樣品1 稀配罐內(nèi)的稀配液 稀配定容后至生產(chǎn)結(jié)束 每隔1小時(shí)取樣檢測(cè)一次微生物量 微生物量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖如下 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 討論 第0 1 2 3 4 5 6 7 8小時(shí)在稀配罐分別取樣進(jìn)行微生物限度檢查 在第5小時(shí)后開始檢出微生物 數(shù)量為8cfu 100ml 隨時(shí)間增長(zhǎng)微生物數(shù)量呈上升趨勢(shì) 在生產(chǎn)即將結(jié)束時(shí)檢測(cè)藥液的微生物數(shù)為369cfu 100ml 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 根據(jù)頗爾的除菌過濾器的過濾效果的驗(yàn)證 理論上定容后的藥液的載菌量為 6 0 1010cfu 除菌過濾器至少能達(dá)到107 cm2過濾面積濃度的缺陷假單胞菌 過濾面積為0 6m2 在除菌過濾器的除菌能力范圍內(nèi) 我公司工藝驗(yàn)證規(guī)定微生物限度檢查結(jié)果應(yīng)小于10cfu ml 我們通過檢測(cè)稀配罐藥液在生產(chǎn)過程不同時(shí)段藥液的微生物數(shù)量 8小時(shí)可以作為稀配液污染控制限度的時(shí)間點(diǎn) 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 樣品2 除菌過濾之前的藥液 即自微生物負(fù)載濾器過濾后的藥液 自灌裝開始至灌裝結(jié)束 每隔1小時(shí)取樣檢測(cè)一次微生物量 微生物量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖如下 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 討論 第0 1 2 3 4 5 6 7 8小時(shí)對(duì)0 22 m微生物負(fù)載過濾器過濾后的藥液分別取樣進(jìn)行微生物限度檢查 在第6小時(shí)后開始檢出微生物 并隨時(shí)間增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì) 在生產(chǎn)即將結(jié)束時(shí)檢測(cè)藥液的微生物量為7cfu 100ml 符合除菌過濾前藥液小于10cfu 100ml微生物負(fù)荷要求 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 我們通過檢測(cè)除菌過濾前的藥液在生產(chǎn)過程不同時(shí)段的微生物數(shù)量 8小時(shí)可以作為除菌過濾前藥液污染控制限度的時(shí)間點(diǎn) 可以將7小時(shí)作為預(yù)留的安全時(shí)間作為內(nèi)部控制時(shí)限要求 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 樣品3 灌裝后的藥品 即除菌過濾后的藥液 自灌裝開始至灌裝結(jié)束 每隔1小時(shí)取樣檢測(cè)一次微生物量 微生物量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖如下 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 討論 第0 1 2 3 4 5 6 7 8小時(shí)灌裝藥液分別取樣進(jìn)行微生物限度檢查 在第7小時(shí)后開始檢出微生物 并隨時(shí)間增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì) 在生產(chǎn)即將結(jié)束時(shí)檢測(cè)藥液的微生物數(shù)為50cfu 100ml 藥品的載菌量為2cfu 支 符合100cfu 100ml的滅菌前藥液的微生物數(shù)量 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 我們通過檢測(cè)灌裝藥液在生產(chǎn)過程不同時(shí)段的微生物數(shù)量 8小時(shí)可以作為灌裝藥液污染控制限度的時(shí)間點(diǎn) 可以將6小時(shí)作為預(yù)留的安全時(shí)間作為內(nèi)部控制時(shí)限要求 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 樣品4 滅菌前藥液 即滅菌前放置時(shí)間最長(zhǎng)的藥液 第一鍋滅菌前藥液微生物數(shù)量為0 第六鍋滅菌前藥液微生物數(shù)量為37cfu 100ml 符合100cfu 100ml的滅菌前藥液的微生物數(shù)量 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 樣品5 待滅菌藥液放置1小時(shí)后 取第一鍋和最后一鍋待滅菌時(shí)間最長(zhǎng)的藥液 滅菌程序啟動(dòng)后再放置一小時(shí)后檢測(cè)微生物量 第一鍋待滅菌放置1小時(shí)后微生物數(shù)量為3cfu 100ml 第六鍋待滅菌放置1小時(shí)后微生物數(shù)量為118cfu 100ml 已經(jīng)超過100cfu 100ml的滅菌前藥液的微生物數(shù)量 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 我們通過檢測(cè)滅菌前藥液和待滅菌藥液放置1小時(shí)后的藥液的微生物數(shù)量 9小時(shí)可以作為稀配至滅菌污染控制限度的時(shí)間點(diǎn) 可以將7小時(shí)作為預(yù)留的安全時(shí)間作為內(nèi)部控制時(shí)限要求 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 污染控制限度的時(shí)間點(diǎn)和內(nèi)部控制時(shí)限匯總表 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 確定微生物污染內(nèi)部控制內(nèi)部時(shí)限 稀配定容至灌裝結(jié)束時(shí)限為6小時(shí) 灌裝開始至滅菌結(jié)束時(shí)限為7小時(shí) 每次最長(zhǎng)待滅菌時(shí)限為3小時(shí) 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 二 其他檢測(cè)結(jié)果生產(chǎn)當(dāng)天的注射用水微生物限度檢查結(jié)果0 標(biāo)準(zhǔn)10cfu 100ml 符合規(guī)定 灌裝間生產(chǎn)環(huán)境 溫度 濕度 塵埃粒子 生產(chǎn)前 生產(chǎn)過程 生產(chǎn)結(jié)束 風(fēng)速 生產(chǎn)前 生產(chǎn)結(jié)束 沉降菌 生產(chǎn)全過程 人員5指手套 接觸碟表面微生物 生產(chǎn)結(jié)束 結(jié)果均符合規(guī)定 四 試驗(yàn)結(jié)果及討論 三 最終成品檢驗(yàn)情況成品按照滅菌柜次檢驗(yàn)無菌和熱原 結(jié)果均符合規(guī)定 五 污染菌鑒定 微生物鑒定程序 參見 現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與驗(yàn)證技術(shù) P205 一 原則微生物鑒別應(yīng)遵循逐步縮小范圍的原則 用細(xì)菌分類學(xué)的知識(shí)和操作步驟 一步一步的將未知微生物逐步落實(shí)到科 屬 然后選擇相應(yīng)的數(shù)碼鑒定系統(tǒng)將未知微生物鑒定到種 五 污染菌鑒定 鑒定包括以下幾個(gè)環(huán)節(jié) 1 菌株采集 2 菌株純化 3 菌落形態(tài)學(xué)觀察如形狀 大小 色澤 4 細(xì)胞形態(tài)觀察如球狀 桿狀 螺旋狀 弧狀 絲狀及其排列方式 5 革蘭染色反應(yīng) 陽(yáng)性或陰性 6 氧化與發(fā)酵試驗(yàn) 7 接觸酶與氧化酶試驗(yàn) 8 鞭毛與動(dòng)力等等 五 污染菌鑒定 通過上述基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果再結(jié)合細(xì)菌鑒定檢索表從而確定微生物所屬范圍 并選擇合適的數(shù)值分類鑒別試驗(yàn)條 API試驗(yàn)條 將微生物鑒定到種 五 污染菌鑒定 五 污染菌鑒定 細(xì)菌鑒定檢索表包含細(xì)菌鑒定時(shí)所涉及的基本定向生化鑒別試驗(yàn) 根據(jù)這些定向生化試驗(yàn)?zāi)転榇蟛糠治粗蔫b定選擇合適API試紙條 五 污染菌鑒定 如何根據(jù)這張鑒定表來選擇所使用方法的步驟 1 純化 分離待鑒定菌無菌操作用接種環(huán)挑取待鑒定菌落或少許含菌溶液到相應(yīng)的培養(yǎng)基上 如 TSA 劃線分離 以純化至單菌落 2 挑取純化后單菌落做革蘭染色 鏡檢 以確定待鑒定菌的革蘭屬性 五 污染菌鑒定 3 如鏡檢結(jié)果為革蘭陰性桿菌 則先進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 如發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性 則選用API20NE試劑條進(jìn)行鑒定 如發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性 則在經(jīng)過細(xì)胞色素氧化酶實(shí)驗(yàn)后選用API20E試劑條進(jìn)行鑒定 4 如鏡檢結(jié)果為革蘭陽(yáng)性球菌 則先進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn) 如實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性則選用APIStrep試劑條進(jìn)行鑒定 如實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性則選用APIStaph試劑條進(jìn)行鑒定 五 污染菌鑒定 5 假如鏡檢結(jié)果為革蘭陽(yáng)性桿菌并且有內(nèi)生芽胞 則選用API50CHB試劑條進(jìn)行鑒定 否則 根據(jù)運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用APICoryne或其他試劑條進(jìn)行鑒定 6 表中未列出的其他試劑條API20A試劑條可用于鑒定厭氧菌 API20CAUX試劑條可用于鑒定酵母菌 五 污染菌鑒定 7 選定正確的試劑條后 根據(jù)不同的API試劑條的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程準(zhǔn)備接種物 進(jìn)行接種 培養(yǎng)等操作并將結(jié)果形成數(shù)碼 用API鑒定軟件鑒定或查詢待檢菌的名稱均可 鑒定結(jié)果應(yīng)記錄 必要時(shí) 給出相應(yīng)解釋 五 污染菌鑒定 三 革蘭染色試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定過程中 需要最先完成的一些實(shí)驗(yàn)稱為基本定向生化試驗(yàn) 介紹革蘭染色實(shí)驗(yàn)的原理 操作步驟和試劑配制的內(nèi)容 五 污染菌鑒定 1 原理由于革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚 細(xì)胞壁中的肽聚糖含量高且網(wǎng)格結(jié)構(gòu)緊密 含脂量又低 當(dāng)用結(jié)晶紫復(fù)合溶液染色細(xì)胞后用脫色劑脫色時(shí) 引起了細(xì)胞壁肽聚糖層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑縮小以致關(guān)閉 從而阻止了結(jié)晶紫 碘復(fù)合物的逸出 故而菌體呈現(xiàn)深紫色 五 污染菌鑒定 而革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量低 含脂量又高 當(dāng)用酒精脫色時(shí) 脂類物物質(zhì)被溶解 細(xì)胞壁通透性增大 結(jié)晶紫 碘復(fù)合物被抽提出來 從而使菌體呈現(xiàn)復(fù)染液的紅色 五 污染菌鑒定 2 染色液的配制2 1結(jié)晶紫染液將A液 結(jié)晶紫2 0g溶于20ml95 乙醇中 與B液 草酸銨0 8g溶于80ml蒸餾水 混合 靜置48小時(shí)后過濾 五 污染菌鑒定 2 2盧戈碘液取碘化鉀2 0g溶于5ml蒸餾水中 再加入碘片1 0g 待碘全部溶解后 加蒸餾水至300ml即成 也可只加蒸餾水至100ml 配制母液儲(chǔ)存 用時(shí)加兩倍蒸餾水 2 3脫色液95 乙醇溶液 五 污染菌鑒定 2 4復(fù)染液 0 25 的沙黃液