機(jī)能實(shí)驗(yàn) 腎缺血再灌注.doc

影響尿生成的因素和腎缺血再灌注損傷（南方醫(yī)科大學(xué) 廣州 510515）【摘要】 目的 探究影響腎泌尿功能的因素，探究腎缺血后再灌注對(duì)腎的損傷現(xiàn)象。 方法 靜脈分別補(bǔ)充37的生理鹽水和20%的高滲葡萄糖，觀測(cè)平均動(dòng)脈壓，尿量；結(jié)扎左腎動(dòng)脈，一段時(shí)間后松開動(dòng)脈夾再灌注，觀測(cè)平均動(dòng)脈壓，尿量，血肌酐和尿肌酐含量，計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)。 結(jié)果 補(bǔ)充37的生理鹽水和20%的高滲葡萄糖尿生成量增加，缺血再灌注后血肌酐濃度增高，尿肌酐濃度降低,內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)明顯降低。 結(jié)論 增加血容量，腎濾過血液增多，尿生成增加；注射高滲溶液增加腎小管內(nèi)原尿濃度，尿生成量增加；缺血再灌注后腎排泄能力降低，腎的功能受損。【關(guān)鍵詞】尿生成；腎缺血再灌注損傷；尿肌酐；內(nèi)生肌酐清除率腎是機(jī)體主要的排泄器官之一，探究影響腎泌尿功能的因素有助于利尿藥等干預(yù)腎臟功能藥物的研發(fā)；腎缺血再灌注(Ischemic reperfusion，IR)損傷是臨床上常見的病理過程，在腎臟手術(shù)、腎移植和體外震波碎石等過程中，均可發(fā)生不同程度的再灌注損傷，它是急性腎衰最常見的原因，因此探究腎的缺血再灌注這一病理現(xiàn)象具有重要意義。腎缺血再灌注時(shí)，內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）明顯降低，腎功能受損.本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制腎臟缺血再灌注損傷的模型，對(duì)腎臟缺血再灌注損傷后血肌酐和尿肌酐的含量，以及內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）進(jìn)行測(cè)定，來探究腎臟的缺血再灌注損傷。1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物 ：家兔 器材 ：醫(yī)用計(jì)算機(jī)記錄系統(tǒng)，家兔手術(shù)臺(tái)，哺乳動(dòng)物手術(shù)器械，壓力換能器，動(dòng)脈靜脈插管，三通管，注射器，兔繩，分光光度計(jì)，恒溫水浴箱。 藥品與試劑 ：20%烏拉坦，0.2%肝素，生理鹽水，20%葡萄糖溶液，速尿，肌酐測(cè)定試劑。1.2 探究影響尿生成的因素的方法1家兔稱重后用20%烏拉坦耳緣靜脈麻醉，麻醉后將家兔仰臥位固定在兔臺(tái)上。家兔頸部剪毛，沿甲狀軟骨下正中剪開皮膚5cm，分離右側(cè)頸總靜脈和左側(cè)頸總動(dòng)脈。從右側(cè)頸總靜脈插入靜脈導(dǎo)管，左側(cè)頸總動(dòng)脈插管，連接壓力換能器用于記錄血壓。將家兔換成右側(cè)臥位，在左肋弓下緣兩指處做一斜形切口，辨認(rèn)輸尿管并進(jìn)行輸尿管插管，用有刻度的試管收集尿液并計(jì)算每分鐘尿量，取此時(shí)的尿液測(cè)量尿肌酐。靜脈輸入30ml生理鹽水，用有刻度的試管收集尿液并計(jì)算注射后每分鐘尿量。一段時(shí)間后靜脈輸入10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的試管收集尿液并計(jì)算注射后每分鐘尿量。1.3 腎缺血再灌注損傷模型復(fù)制的方法游離左腎動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉，夾閉即刻觀測(cè)動(dòng)脈血壓和尿量變化，夾閉30min后觀測(cè)動(dòng)脈血壓和尿量變化。松開動(dòng)脈夾，再灌注，同時(shí)靜脈輸入19ml 生理鹽水加1ml速尿，再灌注30min后取尿測(cè)定尿肌酐濃度。1.4 尿肌酐測(cè)定方法取樣 取尿液10l與2ml蒸餾水按1：200比例稀釋。加樣加樣（ml）標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管測(cè)試樣品上清1.6試劑一(Cr標(biāo)準(zhǔn)品)1.6蒸餾水1.6試劑三0.5 0.5 0.5 試劑四0.5 0.5 0.5 測(cè)定 37 10min水浴，以蒸餾水調(diào)零， 測(cè)510 nm處光密度。計(jì)算 肌酐(mol/L) =（測(cè)定管OD -空白管OD）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD 空白管OD）x 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 x 201倍 內(nèi)生肌酐清除率Ccr (ml/min) = 尿肌酐濃度 / 血肌酐濃度 x 尿量2 結(jié)果 2.1 血壓記錄輸入生理鹽水后，血壓上升，輸入20%葡萄糖后，血壓上升不明顯，缺血再灌注后血壓下降。輸尿管插管后輸入生理30ml鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注30min后平均動(dòng)脈壓83.2mmHg92.1mmHg97.6mmHg50.2mmHg 2.2 尿量記錄輸入生理30ml鹽水后，尿量增加，輸入20%葡萄糖后，尿量增加更明顯；再灌注后尿量又明顯減少。輸尿管插管后輸入生理30ml鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注30min后尿量0.1ml/min0.6ml/min1.6ml/min0.02ml/min2.3尿肌酐含量測(cè)定數(shù)據(jù)缺血再灌注后尿肌酐濃度下降。缺血再灌注后的Ccr較缺血再灌注前降低。標(biāo)準(zhǔn)管空白管輸尿管插管瞬時(shí)尿液再灌注30min后尿液尿肌酐OD值0.06800.0750.043輸尿管插管瞬時(shí)再灌注30min后尿肌酐濃度2205.9mol/L1264.7mol/L缺血再灌注前缺血再灌注后Ccr7.24ml/min6.48ml/min3 討論 3.1 影響尿液生成的因素2 實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，靜脈輸入30ml生理鹽水和10ml20%葡萄糖后，家兔尿量增加。由于補(bǔ)充了上述兩種液體，血液被稀釋，血漿蛋白質(zhì)濃度降低，血漿膠體滲透壓降低，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率增加，尿量增加；再者，補(bǔ)液后血流量增大，由于腎血流量的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)機(jī)制，促使腎動(dòng)脈擴(kuò)張，尿液生成增加。3.2 腎缺血再灌注損傷3實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，腎缺血30min后再灌注，尿肌酐濃度和內(nèi)生肌酐清除率Ccr都較缺血前的降低了，說明腎小球受到了損傷，導(dǎo)致其濾過作用降低。缺血再灌注的發(fā)生機(jī)制如下：1 活性氧損傷作用：線粒體產(chǎn)生活性氧增加；血管內(nèi)皮細(xì)胞黃嘌呤氧化酶形成增加，通過通過黃嘌呤氧化酶途徑產(chǎn)生大量活性氧；白細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧，兒茶酚胺的自身氧化，誘導(dǎo)型NOS表達(dá)增加，都導(dǎo)致活性氧的大量產(chǎn)生，再加上再灌注后機(jī)體清除活性氧的能力下降，更是增加了腎內(nèi)活性氧含量。這些活性氧攻擊細(xì)胞膜，造成膜脂質(zhì)過氧化，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生氧化反應(yīng)，引起DNA損傷，破壞了細(xì)胞間基質(zhì)，造成細(xì)胞功能障礙?；钚匝跏歉鞣N損傷機(jī)制學(xué)說中重要的啟動(dòng)因素。2 鈣超載機(jī)制：缺血再灌注后大量產(chǎn)生的活性氧破壞細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器膜，造成膜的通透性增加和結(jié)構(gòu)損傷，從而使胞外的鈣離子內(nèi)流增加，胞內(nèi)肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；缺血再灌注后，氧自由基引起了線粒體膜的損傷，抑制了氧化磷酸化作用，使ATP合成減少，ATP依賴性離子泵功能障礙；缺血缺氧時(shí)，胞內(nèi)PH降低（胞內(nèi)酸中毒），恢復(fù)灌注使胞內(nèi)和胞外形成PH差，鈉離子和氫離子交換增加，使胞內(nèi)鈉離子過荷，從而促進(jìn)鈉鈣交換反轉(zhuǎn)，使胞外鈣離子大量內(nèi)流；缺血再灌注時(shí)兒茶酚胺大量產(chǎn)生，通過和受體使鈣離子內(nèi)流增加。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是細(xì)胞不可逆性損傷的共同通路。3 白細(xì)胞的作用：缺血再灌注使腎內(nèi)趨化因子生成增多，細(xì)胞粘附分子表達(dá)增多，致使白細(xì)胞聚集，大量的白細(xì)胞聚集在再灌注區(qū)，阻塞微循環(huán)，釋放活性氧，釋放各種顆粒成分，產(chǎn)生各種致炎性細(xì)胞因子，總之，白細(xì)胞活化后產(chǎn)生的各種趨化物質(zhì)可以促使更多的白細(xì)胞聚集，引起微循環(huán)障礙，聚集的白細(xì)胞釋放活性氧和各種生物活性物質(zhì)，使炎癥反應(yīng)失控，造成再灌注后腎組織的損傷。白細(xì)胞聚集是缺血再灌注損傷引起各臟器功能障礙的關(guān)鍵步驟。4 補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的損傷作用：缺血再灌注時(shí)期補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，過敏毒素的釋放和膜攻擊復(fù)合物的裝配直接或間接地導(dǎo)致缺血組織損傷，包括了補(bǔ)體介導(dǎo)的溶胞作用和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)