甘薯中薯蕷皂甙元的提取工藝研究碩士學(xué)位論文.doc

中圖分類號：TS215密級：保密UDC：633.4學(xué)校代碼：10082碩士學(xué)位論文甘薯中薯蕷皂甙元的提取工藝研究Hebei University of Science and TechnologyDissertation for the Master DegreeStudy on Extraction of Diosgenin from theSweet PotatoClassified Index：TS215Secrecy Rate：ConfidentialUDC：633.4University Code：10082Candidate：Li XiaoqianSupervisor：Prof. Mou DehuaAssociate Supervisor：AcademicDegreeAppplied for：Master of EngineeringSpeciality：Food ScienceEmployer：College of Bioscience and BioengineeringDateofOralExamination:May, 2012學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名： 日期： 年 月 日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán) 大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。涉密論文按學(xué)校規(guī)定處理。作者簽名：日期： 年 月 日導(dǎo)師簽名： 日期： 年 月 日河北科技大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品或成果。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名： 指導(dǎo)教師簽名： 年 月 日 年 月 日 -河北科技大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)河北科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密，在 年解密后適用本授權(quán)書。本學(xué)位論文屬于 不保密。（請在以上方框內(nèi)打“”）學(xué)位論文作者簽名： 指導(dǎo)教師簽名： 年 月 日 年 月 日摘 要摘 要我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，相對于其他水果甘薯具有低脂、低熱量和高纖維等優(yōu)點(diǎn)，除了含有大量淀粉以外，還含有胡蘿卜素、VB1、B2和VC，以及鈣、鉀、硒、鐵等元素。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，甘薯中含有脫氫表雄酮，即DHEA，該物質(zhì)具有多種保健功能，是循環(huán)系統(tǒng)中最為豐富的甾體激素之一，而據(jù)報道在植物體內(nèi)DHEA以其前體物質(zhì)薯蕷皂甙元的形式存在，而薯蕷皂甙元作為一種重要的甾體中間體廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)。本課題主要針對河北省農(nóng)科院甘薯組選育的新品種，進(jìn)行甘薯中薯蕷皂甙元的提取工業(yè)研究；對檢測方法進(jìn)行對比優(yōu)化；并對甘薯膨大期到成熟期薯蕷皂甙元在甘薯根、莖和葉中的含量進(jìn)行了檢測。為河北省新品種甘薯的推廣種植和綜合加工利用提供依據(jù)，并帶動河北產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)。本課題研究了分光光度法檢測甘薯中薯蕷皂甙元的條件極其穩(wěn)定性研究，通過對比三種顯色劑，最終確定5%香草醛冰醋酸溶液+高氯酸溶液作為顯色劑效果最佳，顯色穩(wěn)定條件為加入0.2 mL高氯酸，在80下水浴20 min，靜置30 min。最終測得的薯蕷皂甙元特征吸收波長在540 nm。本課題考察了膨大期甘薯中基礎(chǔ)物質(zhì)和薯蕷皂甙元的變化關(guān)系及相關(guān)性。通過試驗可知，在膨大期隨著淀粉含量逐漸增加，薯蕷皂甙元含量的增加趨勢也越明顯。塊根中的薯蕷皂甙元含量隨著生長周期的延長呈現(xiàn)明顯的增加趨勢，而薯皮中的薯蕷皂甙元在前期增長趨勢明顯，后期含量增加不明顯，并且薯塊中的薯蕷皂甙元含量明顯高于薯皮。本課題采用了索氏提取法和超聲波輔助方法對薯蕷皂甙元進(jìn)行提取。兩種方法比較而言，超聲波輔助提取方法，具有提取率高，提取時間短，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，第三次提取率能達(dá)到97.54%。通過單因素和正交試驗獲得了超聲波輔助提取的最優(yōu)條件：酸濃度1 mol/L、酸解溫度100、酸解時間3 h、pH值為5、溶劑提取時間1 h。最佳提取條件下的二次提取率達(dá)到了92.80%。硅膠純化甘薯中薯蕷皂甙元的粗提液最佳的洗脫溶劑為石油醚：乙酸乙酯=1：1，純化后的樣品純化度能達(dá)到82.56%。RP-HPLC法定性定量檢測純化后的薯蕷皂甙元，并確定了最佳檢測條件，流動相：乙腈：甲醇：水=8：1：1；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣量：20 L；檢測波長：210 nm，檢出時間為：15 min左右。關(guān)鍵詞 甘薯；薯蕷皂甙元；分光光度法；提取；純化 IAbstractAbstractChina is the worlds largest producer of sweet potato, relative to other fruits, sweet potato have the advantages of low fat, low heat and high fiber, besides contains a lot of starch, but also contains beta-carotene, VB1, B2 and VC, and calcium, potassium, selenium, iron and other elements. Study found that in recent years, sweet potato contains DHEA, namely DHEA, the material has a variety of health care function, is the most abundant in the circulation system of one of steroid hormones, and DHEA in plant body with its precursor diosgenin form existence,as a kind of important intermediates steroid widely used and the pharmaceutical industry production.This subject mainly aimed at the academy in hebei province of sweet potato varieties of breeding, sweet potato in the extraction of diosgenin industrial research; Compared to test method and optimization; And detect the diosgenin of sweet potato at swollen to maturity in each organ levels.For new varieties of sweet potato in hebei province cultivated and comprehensive processing using provides the basis, and drive the hebei industry economy.This topic research the spectrophotometry detection conditions and stability study of diosgenin, through comparing three show color agent, and finally determined that 5% vanillin glacial acetic acid solution-high chlorine acid solution as colour-display reagent, show color stability conditions for join 0.2 mL high chlorine acid, in 80 water under 20 min, and let rest for 30 min. Finally the measurement of diosgenin features absorption wavelength in the 540 nm.This subject research sweet potato based and diosgenin at the swollen change relations and correlation. Starch content increase obviously, diosgenin the increase of the content of the more obvious trend. diosgenin content of root with the extension of the growth cycle is obviously increased, and diosgenin of potato skins only expands the period in the beginning and end of the growth trend obvious, and diosgenin of root was obviously higher than potato skins.This topic research the soxhlet method and utrasonic-assisted extraction method. Two methods in comparison, utrasonic-assisted extraction method, have higher extraction yield, extracting time short, simple operation etc, the third time extraction yield is 97.54%. By single factor and orthogonal test won the ultrasonic extraction auxiliary the optimal conditions: acid concentration 1 mol/L, acid solution temperature of 100, acid solution time 3 h, pH value for 5,solvent extraction time 1 h. Best extraction conditions of secondary extraction yield to 92.80%.Silica gel purification diosgenin coarse extraction solvent the best elution liquid for petroleum ether:ethyl acetate= 1:1, purification of sample purification and could reach 93.14%. RP-HPLC method to detect the sweet potato diosgenin best detection conditions for: mobile phase: acetonitrile: methanol: water=8:1:1; Flow rate: 0.7 mL/min; Into the sample weight: 20 L; Detected wavelength: 210 nm, detection for time:15 min.Key words Sweet potato；Diosgenin；Spectrophotometry；Extracted；PurificationIII目 錄目 錄摘 要IAbstractII第1章 緒 論11.1 甘薯簡介11.2 甘薯主要營養(yǎng)成分簡介11.3 薯蕷皂甙元的簡介21.4 薯蕷皂甙元研究現(xiàn)狀31.4.1 薯蕷皂甙元的功能特性31.4.2薯蕷皂甙元的提取現(xiàn)狀41.4.3薯蕷皂甙元的純化和檢測方法的研究進(jìn)展61.5 課題主要研究的內(nèi)容、意義及創(chuàng)新點(diǎn)81.5.1 課題研究的內(nèi)容和意義81.5.2 課題的創(chuàng)新點(diǎn)9第2章 甘薯中薯蕷皂甙元分光光度檢測法102.1 試驗材料與設(shè)備102.1.1 試驗材料與試劑102.1.2 試驗設(shè)備102.2 試驗內(nèi)容與方法112.2.1 分光光度法檢測甘薯中薯蕷皂甙元方法的確定112.2.2 薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制112.3 試驗結(jié)果及分析112.3.1 不同顯色方法對甘薯薯蕷皂甙元檢測影響的試驗結(jié)果112.3.2 香草醛冰醋酸-高氯酸顯色法穩(wěn)定性試驗結(jié)果122.3.3 香草醛冰醋酸-高氯酸作為顯色劑的分光光度檢測結(jié)果142.4 本章小結(jié)15第3章 甘薯中薯蕷皂甙元在膨大期變化研究163.1 試驗材料與設(shè)備163.1.1 試驗材料與試劑163.1.2 試驗所用儀器設(shè)備173.2 試驗內(nèi)容及方法173.2.1 取樣173.2.2 樣品前處理183.2.3 甘薯各器官中薯蕷皂甙元的提取和檢測183.2.4 甘薯基礎(chǔ)成分的檢測183.3 試驗結(jié)果與分析213.3.1 薯蕷皂甙元HPLC檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制213.3.2 甘薯中薯蕷皂甙元在膨大期含量變化規(guī)律213.4 本章小結(jié)25第4章 甘薯中薯蕷皂甙元提取、純化工藝研究264.1 試驗材料與設(shè)備264.1.1 試驗材料與試劑264.1.2試驗設(shè)備264.2 試驗內(nèi)容與方法274.2.1 原料的預(yù)處理274.2.2 23個不同品種甘薯中基礎(chǔ)成分和薯蕷皂甙元含量的測定274.2.3 甘薯中薯蕷皂甙元索氏提取法274.2.4 超聲波輔助提取甘薯中的薯蕷皂甙元284.2.5 單因素試驗294.2.6正交試驗294.2.7薯蕷皂甙元的純化研究304.2.8RP-HPLC檢測甘薯中薯蕷皂甙元314.3 試驗結(jié)果及分析314.3.1 甘薯中基礎(chǔ)物質(zhì)和總薯蕷皂甙元含量的檢測314.3.2 索氏提取與超聲波輔助提取法提取率比較344.3.3甘薯中薯蕷皂甙元超聲波輔助提取工藝優(yōu)化結(jié)果344.3.4甘薯中薯蕷皂甙元的純化結(jié)果394.4 本章小結(jié)41結(jié) 論43參考文獻(xiàn)45攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的論文50致 謝51V第1章 緒 論第1章 緒 論1.1 甘薯簡介甘薯是旋花科草本植物，又名白薯、紅薯、山藥和地瓜等，原產(chǎn)于美洲中部和南美洲西北部的熱帶地區(qū)，16世紀(jì)末傳入我國，具有適應(yīng)性廣、高繁殖、易栽培、高產(chǎn)量、高營養(yǎng)和用途廣等特點(diǎn)1，2。在我國甘薯的年產(chǎn)量約為1億噸以上，是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，占全世界的80%，是僅次于小麥、大米和玉米后的重要農(nóng)作物之一3。據(jù)統(tǒng)計，我國甘薯作為動物飼料的為50%，用于工業(yè)加工成產(chǎn)品的占15 %，食用占14%，用作種薯占6%，因保藏不當(dāng)而霉?fàn)€掉占15% 4。甘薯相對于其他水果具有低脂、低熱量和高纖維等優(yōu)點(diǎn)，除了含有大量淀粉以外，還含有胡蘿卜素、VB1、B2和VC，以及鈣、鉀、硒、鐵等元素。美國費(fèi)城大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘薯中含有脫氫表雄酮，即DHEA，該物質(zhì)具有多種保健功能，是循環(huán)系統(tǒng)中最為豐富的甾體激素之一5。另外，由于甘薯呈堿性，因此能夠有效維持人體血液的酸堿平衡，曾被世界衛(wèi)生組織(WHO)評選為“十大最佳蔬菜”的冠軍，更被營養(yǎng)學(xué)家稱為“營養(yǎng)最均衡的保健食品之一”6。根據(jù)目前市場對甘薯不同品種的需求，全國各地把培育優(yōu)質(zhì)專用多樣化甘薯最為目標(biāo)。目前我國的甘薯主要包括淀粉型、食用型、菜用型、無糖型、高胡蘿卜素和高花青素型等7。近年來，通過國內(nèi)外對甘薯的成分不斷進(jìn)行深入的研究發(fā)現(xiàn)其所富含的多種營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，不但具有一定的保健功能，并且還有很高的藥用價值。這些的營養(yǎng)和活性物質(zhì)，能有效解決各國普遍存在的營養(yǎng)和食品安全等問題8。1.2 甘薯主要營養(yǎng)成分簡介甘薯中的營養(yǎng)成分比較豐富，徐州甘薯研究中心通過對790份甘薯塊根的分析，粗淀粉含量37.6%77.8%，粗蛋白2.24%12.21%，可溶性糖1.68%36.02%，以上均以干物質(zhì)計算，而每100 g鮮薯胡蘿卜素含量最高者達(dá)20.81 mg9。甘薯莖葉的營養(yǎng)也比價豐富，粗蛋白質(zhì)含量與豬、牛肉相當(dāng)。粗纖維含量11.4%，總糖含量20%25%，VB1、VB2、VB6、VC等含量超過一般葉類蔬菜10。甘薯中的主要功能性營養(yǎng)成分包括膳食纖維、多糖、糖蛋白、多酚類物質(zhì)、DHEA等。可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維是膳食纖維的主要組成成分，被營養(yǎng)學(xué)家稱為“人體第七類營養(yǎng)素”?？扇苄陨攀忱w維占甘薯渣約2.66%，不溶性的占26.63%11，調(diào)查發(fā)現(xiàn)不溶性的膳食纖維能夠維持機(jī)體健康，在降血脂和預(yù)防心腦血管疾病和便秘等方面具有重要作用。曹媛媛等12通過篩分法從甘薯渣中提取出的膳食纖維達(dá)到81.25%。而利用我國甘薯渣資源進(jìn)行膳食纖維產(chǎn)品的開發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景。多糖是一種單糖聚合度大于10 的高分子化合物，而植物中的多糖是由許多相同或不同的單糖以-或-糖苷鍵組成的化合物13。多糖是甘薯主要能量的來源也是其主要成分之一，甘薯多糖的活性近些年也逐漸被研究學(xué)者所重視，包括其抗腫瘤、抗突變、增強(qiáng)免疫力等功能14。目前對甘薯多糖的提取和純化研究較多，付宏媛15等利用酶結(jié)合熱水提取甘薯中的多糖，使提取率達(dá)到5.55%。林茹16 等人采用超聲波輔助法提取甘薯多糖，得到最佳料也比、提取溫度和提取時間分別為1:6、70和45 min，3次提取后的最高提取率達(dá)到23.68%。糖蛋白顧名思義，由多糖和蛋白質(zhì)共同組成的一種復(fù)合產(chǎn)物，作為甘薯中的一種功能性成分，它對呼吸道、消化道、漿膜腔和關(guān)節(jié)腔具有一定的的潤滑作用，保護(hù)心血管和腎臟器官結(jié)締組織，從而防止動脈硬化、腎臟萎縮并減緩人體器官的老化速度17。關(guān)于甘薯中糖蛋白的相關(guān)提取和純化研究，國內(nèi)外近幾年都進(jìn)行的比較深入。劉主18等通過水提、醇沉，用Sevage法去除蛋白，提取出的甘薯粗多糖經(jīng)過DEAE-52纖維柱洗脫純化等步驟后獲得甘薯糖蛋白純品。程何偉19等采用無機(jī)陶瓷膜超濾設(shè)備得出甘薯生產(chǎn)淀粉廢水中糖蛋白的最佳提取工藝下的提取率為73%。Shuichi Kusano20等采用水提醇沉法，經(jīng)過TCA透析、柱層析和超濾的處理，在甘薯中獲得了一種新的酸性糖蛋白。甘薯酚酸、花色苷和類黃酮是甘薯中酚類化合物的主要三類組成成分。紫甘薯中含有豐富的花色苷，長期食用紫甘薯具有潤肺、養(yǎng)顏益氣補(bǔ)血、降血壓等功效。經(jīng)過研究表明，紫甘薯還具有抗突變、預(yù)防高血壓和抗氧化等作用21，22。黃酮類化合物同樣具有清除體內(nèi)自由基抗氧化、防癌的作用2325。研究表明薯皮的抗氧化性高于塊根，清除率隨著抗氧化劑濃度的降低而上升，抗氧化劑濃度與清除率之間呈線性關(guān)系并為反比。脫氫表雄甾酮(dehydmepiandrostemne，DHEA)，是在人體腎上腺網(wǎng)狀區(qū)皮層中大量合成的類固醇激素，是雄激素和雌激素的中間產(chǎn)物。國外近些年對其生理和病理作用進(jìn)行了大量研究，包括抗衰老、抗肥胖26，27、糖尿病、抗癌、腫瘤2830等， 研究進(jìn)展顯著。工業(yè)上通過合成的方法來生產(chǎn)的DHEA與天然的DHEA結(jié)構(gòu)和性質(zhì)很難保證完全一樣，因此在天然植物中提取DHEA逐漸被人們所重視。姚菊英等31通過預(yù)發(fā)酵和酸水解的方法從甘薯的廢渣中提取出了DHEA。楊紅花32等利用超聲波輔助法，對脫氫表雄酮的提純工藝進(jìn)行了研究，獲得了最佳的提取條件，并通過液相檢測得到純度較高的DHEA。1.3 薯蕷皂甙元的簡介薯蕷皂甙元(diosgenin)又稱皂素，為淡黃色、白色結(jié)晶狀粉末物質(zhì)，化學(xué)名稱為5-異螺旋甾烯-3-醇，分子式為C27H42O3，相對分子質(zhì)量(以下簡稱分子量)為414.61，熔點(diǎn)為204207，25D為-129(C=1.4，氯仿)33，可溶于丙酮、三氯甲烷、石油醚等有機(jī)溶劑。植物體內(nèi)的薯蕷皂甙元是以薯蕷皂甙配基的形式存在的，即糖鏈通過糖苷鍵（包括D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖）與薯蕷皂甙元相連接34如圖1-1，其結(jié)構(gòu)特征是甾核上有單個雙鍵5和具有3-OH，與C25相連的C27-甲基為定向，即C25為R構(gòu)型，雙鍵和-OH的存在決定了其化學(xué)反應(yīng)特性和應(yīng)用價值。圖1-1 薯蕷皂甙與薯蕷皂甙元分子結(jié)構(gòu)式薯蕷皂甙元在醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)中是一種重要的甾體中間體35，36。它以薯蕷皂甙的形式廣泛存在于薯蕷屬、鞘姜屬和葫蘆巴屬植物中。其中盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元的含量最高，其次為黃山藥和穿山龍等37。近些年研究發(fā)現(xiàn)，甘薯中含有DHEA，而薯蕷皂甙元作為其前體物質(zhì)也備受關(guān)注32。1.4 薯蕷皂甙元研究現(xiàn)狀1.4.1 薯蕷皂甙元的功能特性近些年來，薯蕷皂甙元抗腫瘤作用被國內(nèi)外學(xué)者所重視并進(jìn)行研究3840。由于飲食和生活習(xí)慣的不同，癌癥，如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等疾病在西方國家比較常見，而薯蕷皂甙元對這些疾病都有一定的抵抗作用41。薯蕷皂甙元能抑制多種腫瘤細(xì)胞的侵入和繁殖以達(dá)到抗腫瘤的目的。Wang Zhao42等報道薯蕷皂甙元能有效遏制HL60的生長，進(jìn)而防止白血病的病變。Li43等研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂甙元濃度大于40 mol/L時對MCF-7乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用并呈正相關(guān)，而大于100 mol/L變化不明顯。Yen44等研究了8種植物薯蕷皂甙元天然產(chǎn)物對骨肉瘤細(xì)胞的活性的抑制效果，得出C5、C6位的雙鍵、糖元的異構(gòu)和C5、C25是起作用的重要因素。此外，薯蕷皂甙元在降低血糖方面效果也比較明顯。通過小鼠實驗，McAnuff45等證明薯蕷皂甙元可以有效提高鏈唑霉素，從而降低患糖尿病小鼠的血糖。薯蕷皂甙元還具有維持膽固醇正常水平和延緩衰老的功效4648。盾葉薯蕷中的水溶性皂甙能提高冠脈血流量和改善末梢循環(huán)，進(jìn)而防止心肌缺血，還能使總膽固醇、甘油酸三脂膽固醇含量降低，使高密度脂蛋白-膽固醇水平升高，不僅對對脂質(zhì)代謝紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用，并能有效防止動脈粥樣硬化，同時研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其對抗血栓有一定的效果49。1.4.2 薯蕷皂甙元的提取現(xiàn)狀1.4.2.1 水解工藝的研究薯蕷皂甙元的生產(chǎn)工藝主要是將原料水解，脫掉糖分子鏈，提取薯蕷皂甙元粗品后進(jìn)行重結(jié)晶，由于糖苷鍵的斷裂是提取過程中的工藝難點(diǎn)，所以水解工藝的優(yōu)化是非常必要的。袁麗紅50等研究了盾葉薯蕷中水解原位提取薯蕷皂甙元的方法，實驗采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計優(yōu)化了影響薯蕷皂甙元提取主要因素。結(jié)果顯示優(yōu)化后的最佳條件為：取1.50 g盾葉薯蕷塊莖干粉，加入25 mL、1.25 mol/L硫酸-70%異丙醇溶液，然后水解7.5 h，最終薯蕷皂甙元產(chǎn)率達(dá)到0.7034%。此法比傳統(tǒng)提取方法產(chǎn)率提高68%。于武江和俞斌51通過二次酸水解法從黃姜中提取了薯蕷皂甙元，通過正交試驗經(jīng)過二次水解來提取薯蕷皂甙元，結(jié)果表明該方法提取的薯蕷皂甙元提取率達(dá)到了2.41%，比傳統(tǒng)方法提高了9.55%。李敏52等采用正交試驗優(yōu)化了從穿山龍中提取薯蕷皂甙元的工藝條件，結(jié)果顯示使用H2SO4溶液作為介質(zhì)水解穿山龍根莖能得到較高的產(chǎn)率，但硫酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)要大于10%，否則不能有效破壞根莖中的纖維素，以致不能使包裹在纖維素中的薯蕷皂甙元充分分離出來；硫酸的濃度也不能太高，否則會破壞薯蕷皂甙元的結(jié)構(gòu)，使產(chǎn)率降低，最佳條件為酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，回流時間為18 h。1.4.2.2 發(fā)酵法和酶解法的研究 Linli Qiu53等研究了預(yù)發(fā)酵條件對盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元提取率的影響，最終確定發(fā)酵條件為：溫度30、發(fā)酵3天、100 g原材料中加入0.8 g的酵母。作者分析預(yù)發(fā)酵之所以能提高薯蕷皂甙元的產(chǎn)量，主要?dú)w因于盾葉薯蕷中的糖苷酶促進(jìn)甾體皂甙發(fā)生酶解作用，從而提高薯蕷皂甙元的積累；而較長的發(fā)酵時間會使甾體皂甙水解成菝葜皂甙元酮和表菝葜皂甙元酮。喬振杰54等分別通過單因素試驗和正交試驗確定了影響盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元提取的主次因素，并通過預(yù)發(fā)酵提高了產(chǎn)率，優(yōu)化的工藝條件為原料粒徑1 mm，預(yù)發(fā)酵溫度為40，發(fā)酵24 h，3 mol/L鹽酸水解4 h。常用來提取薯蕷皂甙元的植物，大部分都含有較多的淀粉和纖維素，它們將薯蕷皂甙元緊緊地包裹在細(xì)胞當(dāng)中，很難提取出來。在水解前對原材料進(jìn)行酶解是一種提高提取率的有效手段。張黎明55等研究了酶解結(jié)合水浸提法從脫脂胡蘆巴種子中提取薯蕷皂苷元的工藝。以薯蕷皂苷元的提取率為指標(biāo)，優(yōu)化了該法制備薯蕷皂苷元的工藝條件，得到以下結(jié)論：酶解法比水浸提法更有利于提高皂甙元的提取率；確定料液比為1:14，纖維素酶(每克原料10 U，pH值4.6，45)酶解6 h為最佳工藝條件。在此基礎(chǔ)上考察了酶解結(jié)合水浸提法對皂苷元提取率的影響，發(fā)現(xiàn)酶解后升溫至90100，保溫水浸提70 min，可使薯蕷皂苷元的提取率由83.8%提高到92.9%。Yuqing Zhang56等使用聚乙二醇將纖維素酶進(jìn)行改性來提高其熱穩(wěn)定性和盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元的提取率。原材料分別使用改性的纖維素酶、淀粉酶和糖苷酶進(jìn)行水解，結(jié)果顯示，使用改性的纖維素酶由于自然狀態(tài)下的纖維素酶，最佳的pH值和溫度范圍也有所增加，薯蕷皂甙元的純度達(dá)到96%，產(chǎn)率和提取率分別達(dá)到2.80%和96.6%。1.4.2.3 超聲波法 近年來超聲波以其高效，、節(jié)能等特點(diǎn)在植物功能成分提取的領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。超聲波產(chǎn)生的空化作用能夠破壞植物細(xì)胞壁，從而使目標(biāo)物質(zhì)快速充分的溶解到提取溶劑當(dāng)中。韓楓57等以黃姜為原料，采用相應(yīng)面設(shè)計，對超聲波提取薯蕷皂甙元的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定磨漿時間5 min，超聲提取時間48 min，料液比1:18(g/mL)，薯蕷皂甙元回收率達(dá)到3.19%，該方法與傳統(tǒng)方法相比提取率增加了19%。陳圓華58等采用超聲波對黃姜中的薯蕷皂甙元進(jìn)行提取優(yōu)化。其操作流程為稱取黃姜粉末100 mg，加入1.0 mol/L濃硫酸水解4 h，然后用去離子水沖洗殘渣至中性后抽濾，濾渣干燥，加入100 mL氯仿在超聲波中提取30 min，之后用Liebemann-Barcharad試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后測吸光度，計算薯蕷皂甙元含量。結(jié)果顯示該法比傳統(tǒng)方法提取量高，作者說可能是由于超聲波的高能輻射將薯蕷皂甙元的糖苷鍵斷裂，從而導(dǎo)致其提取率增加，更重要的是因為超聲波的空化作用是溶劑快速的滲透到細(xì)胞中，使薯蕷皂甙元溶解出來。楊轉(zhuǎn)萍59等將超聲波與表面活性劑進(jìn)行協(xié)同作用，通過單因素試驗和正交試驗考察超聲頻率、時間、料液比、表面活性劑濃度對薯蕷皂甙元提取率的影響。結(jié)果得到優(yōu)化后的萃取條件為常溫，1:14料液比 (g/mL，黃姜粉末：表面活性劑水溶液) 、8.610-3 mol/L十二烷基硫酸鈉、25.8 kHz超聲頻率、萃取時間40 min，黃姜中薯蕷皂甙元提取率達(dá)到6.50%。1.4.2.4 超臨界流體萃取法 Xiao-shun Shu60等通過超臨界CO2流體萃取技術(shù)從酸解后的抜葜中提取皂甙元，分別對改性劑、壓力、溫度和提取時間進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示超臨界CO2流體萃取技術(shù)的提取效果明顯高于傳統(tǒng)的提取方法，提取出的皂甙元的主要成分為薯蕷皂甙元，當(dāng)提取率達(dá)到最大值時，提取條件為壓力35 MPa、60、95%的乙醇作為改性劑反應(yīng)180 min。魏福祥61等采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從穿山龍中提取薯蕷皂甙元，對提取工藝、條件進(jìn)行了研究。選擇穿山龍水解物粒度為40目，夾帶劑為體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，通過正交實驗確定了最佳提取工藝為萃取壓力35 MPa、萃取溫度55、CO2流量4045 kg/h和提取時間3.0 h，粗品薯蕷皂甙元的提取率為4.44%，粗品中薯蕷皂甙元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為w(薯蕷皂甙元)=54.65%。李輝62等通過單因素和正交試驗確定了超臨界CO2提取黃姜中薯蕷皂甙元的最佳工藝條件：夾帶劑為95%的乙醇，萃取時間、壓力、萃取溫度和解析溫度分別為3 h、20 MPa、60、50；各因素對提取率影響大小為：提取時間萃取溫度萃取壓力解析溫度。得到的最佳條件的的提取率為19.35%。1.4.2.5 其他提取方法崔燕娟63等以云南重樓為原材料采用正交實驗設(shè)計方法，分別對四種提取薯蕷皂甙元的方法直接提取法、改進(jìn)酸水解法、加酶水解法、微波加熱水解法進(jìn)行了工藝條件優(yōu)化，實驗結(jié)果表明：在直接提取法中，以無水甲醇為提取溶劑，薯蕷皂甙元提取率最高時的實驗條件為：樣品粒度采用2040目、提取溫度80、提取時間6 h時，微波提取效果其次。董悅生64等將盾葉薯蕷進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化制備了薯蕷皂甙元，并優(yōu)化了培養(yǎng)條件。其中對轉(zhuǎn)化效果影響最大的因素為pH、微生物接種量、培養(yǎng)溫度，最終確定了最佳的轉(zhuǎn)化條件：緩沖溶液為pH 6.0的66.7mmol/LNa2HPO4 KH2PO4緩沖液中，米曲霉接種量8%，在37培養(yǎng)84 h后，升溫至50繼續(xù)轉(zhuǎn)化8 h。1.4.3 薯蕷皂甙元的純化和檢測方法的研究進(jìn)展1.4.3.1 薯蕷皂甙元純化方法的研究進(jìn)展劉光東65等利用D-101型大孔吸附樹脂，富集與純化薯蕷水溶性皂甙，試驗說明純化前樣品液的預(yù)處理非常重要，當(dāng)吸附時間為2 h，洗過乙醇濃度為70%時具有較好的分離富集效果。試驗結(jié)果顯示純化前黃姜中的水溶性薯蕷皂甙含量為13.1%，純化后的含量為27.3%，精制度達(dá)到208%，洗脫率達(dá)到80%以上。舒明勇66通過正交實驗設(shè)計，得到薯蕷皂甙元最佳的提取條件：以粉碎粒度60目、萃取時間10 min、萃取溫度100、固液比1/20，之后采用酸性氧化鋁柱對薯蕷皂甙元進(jìn)行梯度洗脫純化，用洗脫溶劑為苯、石油醚、乙酸乙酯，之后采用HPLC檢測，純度達(dá)到84.31%，得率為1.21%。劉詠67等用硅膠層析加重結(jié)晶的方法對黃姜中薯蕷皂甙元粗品進(jìn)行了提純，并對純品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步鑒定，方法如下：取一定量薯蕷皂甙元粗品，以10% H2O-CH3OH作溶劑溶解，將濾液加到硅膠柱上，然后用CHCl3-MeOH（體積比為65:30）做沖洗劑洗柱，以TCL法帶標(biāo)樣鑒別，合并相同組分，濃縮，析出晶體，離心干燥得薯蕷皂甙純品。1.4.3.2 薯蕷皂甙元檢測方法的研究進(jìn)展重量法、分光光度法和色譜法是薯蕷皂甙元常用的檢測方法。重量法：此法將薯蕷皂甙元的粗品烘至恒重后稱重，然后將干燥后的粗品與樣品的絕對干重的比值即為皂素含量。石艷霞68等將薯蕷皂甙元皂甙元粗提液濃縮至一定體積，重結(jié)晶后過濾，105干燥，冷卻，稱重，并計算其含量。重量法由于其原理和設(shè)備簡單，只根據(jù)薯蕷皂甙元重量即可計算其含量，因此工業(yè)生產(chǎn)常用重量法做粗略計算，但是此法誤差大逐漸被實驗室的精確檢測分析所淘汰。分光光度法：分光光度法是一種操作簡單，能定性和定量檢測分析被測物質(zhì)的方法。此法不需要將薯蕷皂甙元進(jìn)行重結(jié)晶操作。陳戰(zhàn)國69等第一次以香蘭醛冰醋酸一高氯酸作為皂甙元顯色劑，用分光光度法檢測波長為530 nm，此法特點(diǎn)為測定薯蕷皂甙元時不需分離。馬敬中70等用乙酸酐一濃硫酸作顯色劑對甾體化合物在460 nm進(jìn)行分光光度法測定，顯色溫度為50，顯色劑占總體積2/5，少則色度變淺或難以顯色，多則雜質(zhì)發(fā)生干擾雖然此顯色劑對甾體皂甙元顯色具有專一性， 但由于色素的干擾，往往導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。張玲71等首次采用濃硫酸反應(yīng)使薯蕷皂苷元顯色，對影響顯色反應(yīng)的主要因素進(jìn)行了試驗，用分光光度法在波長為410 nm處對黃山藥中薯蕷皂苷元的含量進(jìn)行測定。試驗結(jié)果表明：方法的線形范圍為230 g/mL(r=0.9996)，平均回收率為97.8%；最佳顯色條件為：水浴溫度50、反應(yīng)時間30 min、濃硫酸用量10 mL。薄層色譜法（TLC）：謝如剛2等采用薄層光密度法對薯蕷皂甙元進(jìn)行檢測，以石油醚(6090)-乙酸乙酯為(4:1)作為展開劑，以濃硫酸噴霧作為顯色劑，所得結(jié)果顯示誤差較小，比較適合于薯蕷皂苷元含量較高時的測定。劉玉珍73等通過薄層掃描對蒺藜中薯蕷皂苷進(jìn)行測定，以氯仿-乙酸乙酯(9:1)為展開劑，茴香醛：冰醋酸：硫酸(1:100:2)為顯色劑，S=433 nm，R=480 nm，結(jié)果呈良好的線性關(guān)系。康阿龍74等用氯仿-甲醇-水(65:35:10) 作展開劑，通過分光光度法在510 nm下進(jìn)行檢測，以10%的硫酸乙醇溶液進(jìn)行噴霧顯色，得出的結(jié)果表明方法精密度較好。TLC法的優(yōu)點(diǎn)雖然比較簡單，但需要使用薄板涂層作為固定相，因此不易保存和穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)比較突出。氣相色譜法：此法以氣體作為流動相，其特點(diǎn)是分利率高速度快，樣品用量較少和檢測限低等。陶莉75等分別用氣相色譜法和紅外光譜法對薯蕷皂苷元進(jìn)行了定性和定量。確定最佳的檢測條件為：柱溫270，汽化溫度330，氮?dú)饬魉僭O(shè)定為50 mL/min，試驗結(jié)果顯示薯蕷皂甙元與其他雜質(zhì)分離較好。都述虎76等通過毛細(xì)管氣相色譜法對盾葉薯蕷中的薯蕷皂甙元含量進(jìn)行檢測，樣品的峰面積在3521758 g范圍內(nèi)與其濃度呈良好線性關(guān)系。高效液相色譜法(HPLC)：本法適合于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的檢測，因此被較多應(yīng)用于甾體化合物的檢測分析。韋建榮77等采用高效液相色譜法測定了重樓中薯蕷皂甙元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。試驗過程包括甲醇提取、酸水解，得到薯蕷皂甙元后，進(jìn)行HPCL檢測，色譜柱為Symmetry C8，流動相為V(乙腈):V(水)= 75:25，檢測波長203 nm，結(jié)果顯示重復(fù)性較好。韓菊78等采用的提取薯蕷皂甙元的技術(shù)為超臨界CO2萃取法，原料為盾葉薯蕷，提取之后采用高效液相法進(jìn)行檢測。色譜柱采用Shim-packCLC-ODS(150 mm416 mm，5 m)，流動相為V(甲醇):V(水) =99:1，流速為1.0 mL/min，UV檢測波長為206 nm。在0.2210 mg/mL范圍內(nèi)，薯蕷皂甙元峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，r=0.9997。彭紅霞79等采用超聲提取結(jié)合酸水解對黃姜進(jìn)行預(yù)處理，通過RP-HPLC測定薯蕷皂甙元含量。色譜條件為：色譜柱AglilengtHC-C18，流動相為甲醇:水= 95:5(V:V)，流速為1.0 mL/min，UV檢測波長為203 nm。結(jié)果表明，薯蕷皂甙元峰面積在401000 g/mL范圍內(nèi)與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.9996)，樣品平均加標(biāo)回收率為99.8%，RSD為1.1%。與傳統(tǒng)方法比較提取量提高了32%。1.5 課題主要研究的內(nèi)容、意義及創(chuàng)新點(diǎn)1.5.1 課題研究的內(nèi)容和意義薯蕷皂甙元作為重要的醫(yī)藥中間體，主要存在于薯蕷屬植物當(dāng)中，因此國內(nèi)外研究薯蕷皂甙元的提取和檢測等研究基本都以盾葉薯蕷為原材料。研究的內(nèi)容主要包括盾葉薯蕷中薯蕷皂甙元的提取，純化以及檢測等。而到目前為止，沒有研究報道關(guān)于甘薯中薯蕷皂甙元的提取和檢測的內(nèi)容，有試驗研究報道，甘薯中發(fā)現(xiàn)存在DHEA，而薯蕷皂甙元則是DHEA的前體物質(zhì)，因此對甘薯中薯蕷皂甙元的試驗研究，在有利于綜合開發(fā)利用甘薯的同時，為甘薯中DHEA的提取也提供了一定的理論依據(jù)。本課題采用超聲波輔助法提取甘薯中的薯蕷皂甙元，選用鹽酸進(jìn)行酸解預(yù)處理，目前工業(yè)上生產(chǎn)薯蕷皂甙元也多采用酸解預(yù)處理操作，此方法操作簡便，易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，且酸解溶液中存在的大量單糖可以進(jìn)行發(fā)酵，進(jìn)而回收乙醇，增加企業(yè)收益。本課題采用分光光度法和高效液相色譜法來檢測甘薯中的薯蕷皂甙元，并進(jìn)行定性定量分析。本課題主要針對河北省農(nóng)林科學(xué)研究院糧油所選育的新品種，進(jìn)行甘薯中薯蕷皂甙元的提取工藝研究；對分光光度檢測方法中的顯色劑進(jìn)行對比；并對提取方法進(jìn)行優(yōu)化。為河北省甘薯的綜合利用和功能成分的開發(fā)提供了參考，帶動地方產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)，提高綜合利用價值。1.5.2 課題的創(chuàng)新點(diǎn)經(jīng)反復(fù)試驗篩選出薯蕷皂甙元含量較高的甘薯品種，并對分光光度檢測法中薯蕷皂甙元的最佳顯色劑進(jìn)行了對比分析試驗，最終確定適合甘薯檢測的顯色劑和顯色條件。以傳統(tǒng)的提取方法為參考，改用超聲波輔助提取甘薯中的薯蕷皂甙元，從提取率和提取時間上提高薯蕷皂甙元的提取效果。采用硅膠柱層析對甘薯薯蕷皂甙元的粗提液進(jìn)行了純化，并用HPLC法進(jìn)行了定性分析。研究了從甘薯膨大期到成熟期薯蕷皂甙元含量的變化情況，分別對甘薯的根、莖和葉等部位考察了薯蕷皂甙元的變化趨勢，對河北省農(nóng)科院甘薯的綜合利用提供依據(jù)。53第2章 甘薯中薯蕷皂甙元分光光度檢測法第2章 甘薯中薯蕷皂甙元分光光度檢測法2.1 試驗材料與設(shè)備2.1.1 試驗材料與試劑甘薯（冀98、冀71、冀65） 河北省農(nóng)科院糧油所薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)品（97%） 中國藥品生物制品檢定所鹽酸，分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠高氯酸，分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠香草醛，分析純天津市大陸化學(xué)試劑廠氫氧化鈉，分析純天津市大陸化學(xué)試劑廠濃硫酸，分析純新光化工試劑廠氯化鉀，分析純天津市大陸化學(xué)試劑廠冰醋酸，分析純天津市大茂化學(xué)試劑廠石油醚，分析純天津大茂化學(xué)試劑廠乙腈，色譜純天津康科德科技有限公司甲醇，色譜純天津康科德科技有限公司2.1.2 試驗設(shè)備101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津華北試驗電爐廠玻璃儀器氣流烘干器河南豫華儀器有限公司JA 1003型電子天平(感量0.001 g)上海精科天平JJ 1000型電子天平(感量0.01 g)美國雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋河南省鞏義市英峪予華儀器廠SP-756 p紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司DELTA 320型pH計梅特勒-托利多儀器有限公司LG10-2.4A型離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠SHZ-D()循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠Re-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器河南省鞏義市英峪予華儀器廠201升降恒溫水浴鍋河南省鞏義市英峪予華儀器廠SHZ-D()型予華牌循環(huán)水式真空泵河南省鞏義市英峪予華儀器廠超聲波昆山市超聲波儀器有限公司高效液相色譜儀上海島津儀器有限公司2.2 試驗內(nèi)容與方法2.2.1 分光光度法檢測甘薯中薯蕷皂甙元方法的確定2.2.1.1 甘薯中薯蕷皂甙元樣品的制備將甘薯清水洗凈后切片，40鼓風(fēng)干燥24 h，冷卻后粉碎過40目篩。準(zhǔn)確稱取5 g甘薯粉末，加入50 mL、2 mol/L的鹽酸，用超聲波處理30 min，取出后在沸水中水浴3 h，用2 mol/L NaOH將pH調(diào)至中性；真空抽濾，濾渣在60下干燥3 h；濾渣中加入50 mL石油醚和1 g活性炭在超聲波中提取1.5 h；過濾殘渣，將濾液用石油醚定容到50 mL。2.2.1.2 不同的顯色劑對分光光度檢測方法的影響本文采用硫酸、高氯酸和香草醛冰醋酸高氯酸（以下簡稱香草醛顯色劑）三種顯色劑來檢測薯蕷皂甙元的含量。以甘薯中薯蕷皂甙元提取液為檢測樣品，以薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，顯色后分別用分光光度計在400700 nm波長下進(jìn)行掃描檢測，確定甘薯中薯蕷皂甙元的最大吸收波長。2.2.1.3 香草醛顯色劑與甘薯中薯蕷皂甙元顯色穩(wěn)定性試驗由于香草醛和甘薯中薯蕷皂甙元在顯色過程中需要進(jìn)行水浴加熱和靜置等過程，而這些因素會影響顯色效果，因此分別對高氯酸用量、水浴時間、水浴溫度和樣品靜置時間進(jìn)行了單因素試驗，每個試驗進(jìn)行三次，取平均值，過程如下：取5 mL甘薯薯蕷皂甙元提取液于具塞試管中，水浴揮干溶劑，依次加入0.2 mL新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液和一定量高氯酸，然后進(jìn)行水浴加熱，再用冰水冷卻，最后用冰醋酸將其定容至10 mL，靜置。2.2.2 薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取10 mg薯蕷皂甙元標(biāo)準(zhǔn)品，溶于50 mL石油醚中，吸取以上標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL，揮干石油醚，按香草醛冰醋酸高氯酸顯色方法處理后，分別定容到10 mL，在540 nm下測定其