CN102526717A一種吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法

CN102526717A一種吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法 (10)申請公布號102526717A (43)申請公布日xx.07.04102526717A*102526717A* (21)申請?zhí)杧x10382612.8 (22)申請日xx.11.25A61K39/116(xx.01)A61P31/04(xx.01)A61K39/05(xx.01)A61K39/08(xx.01)A61K39/10(xx.01) (71)申請人成都康華生物制品有限公司地址610100四川省成都市國家經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)北京路182號 (72)發(fā)明人侯文禮廖常茹馮曉趙志鵬鐘澤榮 (74)專利代理機構四川省成都市天策商標專利事務所51213代理人劉興亮 (54)發(fā)明名稱一種吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法 (57)摘要本發(fā)明涉及利用百日咳、白喉、破傷風菌種培養(yǎng)類毒素制備百白破疫苗的方法，所述方法采用硫酸銨鹽析、密度梯度離心、戊二醛脫毒的方式來制備包含有效抗原PT和FHA的無細胞百日咳原液，通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風毒素混合最終制備得到可用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病的無細胞百白破聯(lián)合疫苗。 (51)Int.Cl.權利要求書2頁說明書10頁附圖1頁 (19)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權局 (12)發(fā)明專利申請權利要求書2頁說明書10頁附圖1頁1/2頁21.一種制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風毒素混合最終制備得到可用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病的無細胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述方法包括如下步驟 (1)采用包括戊二醛解毒步驟的方法來制備包含有效抗原PT和FHA的無細胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50gPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0.5，置于20脫毒，每1小時振搖一次，然后加入賴氨酸溶液，使其最終濃度為0.2，置于20作用3小時； (2)采用包括甲醛解毒步驟的方法來制備白喉類毒素和破傷風毒素，其中制備白喉類毒素時甲醛解毒的具體操作條件為選擇0.5的甲醛，經(jīng)調pH至7.07.2，在3739下脫毒，然后加入賴氨酸(9.125)，脫毒42天左右；制備破傷風毒素時甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0.15，放置于37溫箱中加溫脫毒25天。 2.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于用于制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種58003(CS)。 3.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于百日咳I相菌種58003(CS)的接種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為將配制好SSM培養(yǎng)基加入10L發(fā)酵罐，接種細菌的培養(yǎng)濃度為3.0108/ml，培養(yǎng)溫度為37，通氣量4060L/min，壓力0.1kg/cm2，攪拌器的轉速設定為350rpm。 4.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無細胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟。 5.權利要求4所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無細胞百日咳原液的硫酸銨鹽析是二次鹽析。 6.權利要求5所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于硫酸銨鹽析的具體操作條件如下收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進行一次鹽析，7日后經(jīng)3500rpm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經(jīng)7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內液經(jīng)16000rpm離心3小時后收取上層清液。 7.權利要求4所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備無細胞百日咳原液的密度梯度離心是經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心1820小時除去內毒素，收集糖濃度為412之間的樣品。 8.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于在制備無細胞百日咳原液時，進行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200300ml，置于28，透析7日，進行戊二醛殘量檢測。 9.權利要求1所述的制備吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于制備得到的百日咳原液、白喉類毒素和破傷風毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至24mg/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風類毒素加入氫氧化鋁，于20-25攪拌吸附4小時。 10.權利要求9所述的方法制備得到的吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經(jīng)過檢測這兩種有效抗原的純度達到85以上，且含無細胞權利要求書102526717A22/2頁3百日咳疫苗效價應不低于4.0IU，白喉疫苗效價應不低于30IU，破傷風疫苗效價應不低于40IU。 權利要求書102526717A31/10頁4一種吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗的制備方法技術領域0001本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，本發(fā)明涉及利用百日咳、白喉、破傷風菌種培養(yǎng)類毒素制備成百白破疫苗，用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病。 背景技術0002百日咳是一種常見的、傳染性極強的呼吸道感染性疾病。 百日咳病在中醫(yī)上稱為天哮嗆、鷺鶿吼、疫咳等，我國早在十一世紀就有關于此病的治療方法。 1840年Monlton提到過百日咳病，1876年Sydenham詳細描述了該病，稱之為劇烈咳嗽的病。 1900年由Bordet和Gengon在患兒的咳痰涂片內找到了百日咳桿菌。 由于該菌初次分離營養(yǎng)要求較高，直到1906年他們采用了血液-甘油-馬鈴薯培養(yǎng)基才獲得純種。 百日咳桿菌能引起人類急性呼吸道傳染病，傳染力強，發(fā)病持續(xù)時間長，故稱百日咳(whoop cough或Pertussis)。 百日咳桿菌能引起人類百日咳，以嬰幼兒患者居多，主要是易感者與患者密切接觸后，通過飛沫空氣傳播感染。 百日咳病程較長，大約57周或更長，常見有流感嗜血桿菌、A群鏈球菌和肺炎球菌的繼發(fā)感染，具有嚴重的預后結果，最常見的合并癥為肺炎，是導致百日咳患兒死亡的主要原因。 在患病的早期使用抗生素可能有效，百日咳桿菌對紅霉素、氯霉素、氨芐青霉素、多粘菌素等抗生素均有較敏感。 若在百日咳潛伏期和卡他期立即使用這些藥物可以縮短病程，減輕病情。 但是，如果進入了百日咳痙咳期，則所有抗菌素效果都不明顯。 百日咳桿菌致病機理至今尚不十分清楚。 但體液內存在一定的抗體水平可保護機體免受百日咳桿菌感染已被證實。 自20世紀30年代Medson等制成百日咳菌體疫苗以來，已在世界各國使用近60年。 百日咳菌體疫苗在預防和控制百日咳中發(fā)揮了巨大的作用，使百日咳成為用疫苗可以預防的傳染病，已列入世界衛(wèi)生組織推行的擴大免疫計劃(Expend ProgrammeImmunization，EPI)中要控制的和消滅的傳染病之一。 0003破傷風是一種嚴重的疾病，它多發(fā)生于創(chuàng)傷后，由于患者傷口被破傷風桿菌感染，在厭氧的條件下產(chǎn)生大量的毒素，進而侵害神經(jīng)組織，導致患者全身性肌肉強直和陣發(fā)性痙攣，死于窒息及全身性衰竭。 它多是散在發(fā)生，感染與發(fā)病也需要特定的條件，即創(chuàng)傷、污染、破傷風桿菌及厭氧條件。 破傷風桿菌產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛解毒后，形成類毒素，可用于人群免疫接種，形成自動免疫，該方法是1925年通過動物法注射類毒素后，在血清中可測出相應的抗體，并能抗破傷風感染。 0004白喉是一種嚴重的世界性的呼吸道傳染病，人類是白喉桿菌的唯一宿主。 它是由白喉棒狀桿菌侵入到上呼吸道粘膜上皮組織，生長繁殖并產(chǎn)生外毒素引起炎癥，產(chǎn)生纖維性滲出和組織破壞，形成典型的假膜，這種假膜牢固的附著在粘膜上，可引起呼吸障礙甚至窒息，同時白喉外毒素不斷由病灶吸收，引起全身性中毒性癥狀、器官損害和急性死亡，主要是心肌、神經(jīng)系統(tǒng)、肝、腎及腎上腺等器官的損害。 自1923年發(fā)現(xiàn)經(jīng)用甲醛處理白喉毒素后，可使白喉毒素的毒性消失而保持免疫原性，注射動物可產(chǎn)生中和抗體。 0005我國目前應用于計劃免疫預防百日咳、白喉、破傷風疾病的疫苗主要是在全細胞百日咳疫苗中加入白喉、破傷風類毒素的聯(lián)合疫苗。 自五十年代初我國已經(jīng)開始生產(chǎn)該種說明書102526717A42/10頁5疫苗，至今已使用了半個多世紀。 雖然近半個世紀以來，在世界范圍內許多國家已經(jīng)廣泛應用了疫苗，大大降低了白喉和破傷風疾病的發(fā)病率，但有關研究表明，在疫苗接種不完全區(qū)域的人群中仍時有百日咳和白喉發(fā)生，處于地方性低水平流行。 在20世紀70年代末至80年代初，在一些發(fā)達國家，如英國、瑞典、意大利和日本等由于停止百日咳菌體疫苗接種，發(fā)病率大幅度上升。 1993年瑞典報告在未免疫的兒童中，60在10歲前發(fā)生過典型的百日咳癥狀，其中90兒童的血清百日咳毒素抗體呈陽性反應。 因此，百日咳疫苗接種的長期性和保證完成全程免疫是非常重要和關鍵。 根據(jù)WHO近期統(tǒng)計，全球每年仍有百日咳病人近4000萬，35.7萬人死亡。 如非洲，發(fā)病率為2000/10萬，5歲以下兒童的發(fā)病率高達2060。 在歐洲發(fā)病率約為0.35/10萬85/10萬。 在美國，百日咳的發(fā)病率從1981年的0.5/10萬增加到1993年的2.6/10萬；澳大利亞盡管3針基礎免疫覆蓋率高達90，百日咳發(fā)病率從1991年的2/10萬增加到1994年的30.5/10萬。 在荷蘭疫苗接種率高達95，1996年仍發(fā)生了大范圍的流行，發(fā)病率達18/10萬。 在我國，目前尚無百日咳感染的確切流行病學資料，盡管自1985年中國推行計劃免疫，將百白破聯(lián)合疫苗納入第一批計劃免疫的疫苗，使得百日咳的發(fā)病率急劇下降。 但是，由于全細胞百白破聯(lián)合疫苗易產(chǎn)生的副反應，嚴重影響了劃免疫的實施，使常規(guī)免疫的全國覆蓋率尚未真正達到85，造成百日咳的局部暴發(fā)流行的情況。 如貴州省某鎮(zhèn)1997年發(fā)生暴發(fā)流行，發(fā)病率高達20.55(285例/總人口1387)，其中7歲以下兒童占44，此次流行與疫苗接種率低、易感人群累積有關。 浙江麗水報告，1984-1992年百日咳的發(fā)病率仍達17.24/10萬。 由于百日咳在發(fā)病的早期癥狀不典型，不易診斷，但傳染性卻很強，所以難以控制傳染源和切斷傳播途徑，只有通過預防接種百日咳疫苗，減少易感人群，提高人群對百日咳的免疫水平，形成免疫屏障，才能達到控制和消滅百日咳的目的。 有關流行病學調查證明全細胞百日咳疫苗對于控制百日咳疾病的流行非常有效，免疫人群后可提供中至高水平的保護作用。 英國在1978年和1981年發(fā)生了兩次因停止接種全細胞百日咳疫苗后最為嚴重的百日咳流行。 1979年日本由于疫苗接種事故停止接種疫苗，使百日咳發(fā)生率大幅度上升。 然而，由于全細胞百日咳疫苗具有復雜的生物學性狀，而且有關其效力與毒性之間的關系不甚明了，因此盡管接種全細胞百日咳疫苗后是否會引起腦病已爭論了許多年，但是，因接種疫苗引起或誘發(fā)嚴重副反應仍然是一個世界性的問題。 0006與百日咳疫苗接種相關的副反應可以分為兩大類。 一類是常見副反應，包括局部和全身輕微副反應，前者如注射局部發(fā)生紅暈、疼痛、腫脹，在接種百日咳菌體疫苗后的發(fā)生率為50；后者如發(fā)燒、煩躁、嗜睡、厭食等副反應，吸附無細胞百日咳疫苗、白喉、破傷風類毒素聯(lián)合疫苗(DTaP)明顯比白喉和破傷風類毒素二聯(lián)疫苗(DT)的副反應高。 另一類為不尋常的副反應，局部的有硬結和化膿，血管神經(jīng)性水腫等，全身副反應有嘔吐、持續(xù)哭叫、蕁麻疹等，嚴重的可發(fā)生驚厥、虛脫、休克等，極少數(shù)人可引起永久性腦損傷。 我國在1988年由中國藥品生物制品檢定所組織進行了百日咳菌體疫苗人體接種反應觀察，體溫38.5以上的中強反應6-8h為1.62-10.57，24h為2.5-11.5，48h為0-3.84。 局部中強反應24h為0-4.38，48h為0-3.22，72h為0-2.63。 化膿發(fā)生率為0.87。 0007由于百白破疫苗中白喉、破傷風兩種類毒素是已經(jīng)被提純精制過的有效蛋白抗原，而百日咳則為全細菌體制劑，即包含所有的有效抗原和毒性成分，所以注射百白破疫苗所發(fā)生的反應一般為百日咳所含的毒性組分所引起的異常反應，如接種后發(fā)生的發(fā)燒、紅說明書102526717A53/10頁6腫、硬結等，并不是疫苗本身所應該具備的性狀，而是該疫苗本身含有除了人們所需要的有效抗原成分以外，同時所含的有害成分所引起的異常反應。 而有害成分對于過敏體質或已被某些細菌、病毒隱性感染的接種者較容易引起變態(tài)反應。 而有害成分存在量也是疫苗質量的反映。 接種百、白、破疫苗后發(fā)生的異常反應還有以下幾種嚴重異常反應0008過敏性合并癥1)過敏性休克；2)過敏性皮疹；3)血管神經(jīng)性水腫；0009神經(jīng)系統(tǒng)合并癥1)腦?。?)神經(jīng)炎及神經(jīng)根炎；3)變態(tài)性腦脊髓炎。 0010百白破疫苗中的百日咳菌體易誘發(fā)潛伏感染，或使原有的疾病加重。 尤其過敏體質和已被某些細菌、病毒隱性感染的接種者容易發(fā)生嚴重異常反應。 但是根據(jù)計劃免疫的要求，白、破兩種類毒素幾乎總是與百日咳疫苗合并使用，用于兒童計劃免疫，因此菌體百日咳引起的副反應大大干擾了白喉和破傷風類毒素的免疫接種。 有些國家在百日咳發(fā)病率大幅度降低的情況下，由于接種疫苗后所引起的上述嚴重副反應，使人們抵制接受百日咳疫苗，如英國、瑞典和日本等國都一度停止了百日咳疫苗的接種，隨后這些國家的百日咳發(fā)病率急劇上升。 鑒于此種情況自20世紀70年代起對百日咳桿菌進行了更加深入的研究，研制和純化了包百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳粘著素等近20種百日咳菌的生物活性成分。 本在研究的基礎上，于1981年率先研制成功主要含有百日咳毒素和絲狀血凝素無細胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaine，APV)，并替代百日咳菌體疫苗(whole cell pertussis vaine，WPV)，用于免疫2歲以上兒童，并于1989年開始使用吸附無細胞百日咳疫苗、白喉、破傷風類毒素聯(lián)合疫苗(adsorbed acellularpertussisvaine，iphtheria toxiod，tetanus toxoidbined vaine；DTaP)，用于3月齡嬰兒的基礎免疫，至今已累計使用了幾千多萬針次，使百日咳的發(fā)病率重新下降，并且達到歷史最低點。 20世紀90年代以來在瑞典、美國、德國、意大利、塞內加爾以及中國等國家，對近20多種不同的DTaP免疫效果、接種反應等進行了臨床觀察。 結果證明，盡管不同DTaP的免疫保護率有所差異，但DTaP具有與吸附百日咳全細胞疫苗、白喉、破傷風類毒素聯(lián)合疫苗(adsorbed wholecellpertussisvaine，diphtheriatoxiod，tetanus toxoidbinedvaine；DTwP)同樣免疫保護效果。 此外，不論從日本歷年累計的接種反應資料，還是其他國家的臨觀察資料，都證明DTaP的副反應明顯低于DTwP23。 目前從世界范圍內，各國的百日咳疫苗都處于更新?lián)Q代的階段，即新的無細胞百白破疫苗逐步取代傳統(tǒng)的菌體百白破疫苗。 至今已有近30個國家批準使用DTaP或正在進行DTaP的臨床評估。 目前，歐美、加拿大和日本等國已普遍使用無細胞百日咳疫苗。 我國是于80年代中期開始研制無細胞百白破聯(lián)合疫苗，90年代中期獲得正式生文號。 無細胞百日咳疫苗的生產(chǎn)工藝是沿用日本的無細胞百日咳生產(chǎn)工藝進行生產(chǎn)。 工藝基本上包括大發(fā)酵罐培養(yǎng)細菌，硫酸銨沉淀，高鹽濃度提取、透析和糖梯度離心等。 由于我國人口眾多，每年出生嬰兒逾二千萬，目前無細胞百白破聯(lián)合疫苗生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)量較低，只有極少數(shù)兒童才能使用無細胞百日咳疫苗，因此，從我國的計劃免疫預防工作的安全性和與國際接軌的要求來看，我國急需大力生產(chǎn)和發(fā)展自己的無細胞百白破聯(lián)合疫苗，滿足每年出生嬰兒逾二千萬的免疫接種的需要，從而在我國實現(xiàn)以安全、有效的無細胞百白破疫苗全面替代全細菌體百白破疫苗，造福于廣大兒童。 0011 2、各國的無細胞百白破聯(lián)合疫苗的現(xiàn)狀00121981年日本的佐藤教授等人在純化出LPF和FHA兩種抗原的基礎上，在世界上第一次研制成功了含有兩種抗原成分的無細胞百日咳疫苗，并且與白喉和傷風類毒素聯(lián)合成說明書102526717A64/10頁7無細胞百白破聯(lián)合疫苗。 該疫苗在日本開始正式使用，目前日本已經(jīng)全部取代了老的菌體百白破疫苗用于兒童計劃免疫接種。 1992年美國正式批準使用日本生產(chǎn)的無細胞百日咳疫苗。 中國自80年代開始研制無細胞百日咳疫苗，目前我國已有無細胞百白破聯(lián)合疫苗正式產(chǎn)品，已經(jīng)在我國許多省份用于兒童計劃免疫，由于該類型疫苗接種反應好于老的百白破疫苗，很受國內歡迎，產(chǎn)品供不應求。 0013目前，無細胞百白破聯(lián)合疫苗的配方在國際上有所不同，白喉和破傷風類毒素的使用量也不同，成品中的吸附劑含量也有區(qū)別，按照含有百日咳抗原的類型主要分為幾種1)PT+FHA；2)PT+FHA+Prn；3)PT+FHA+Prn+Agg2，325。 歐洲使用比較多的是第2和第3種。 美國使用的主要是第1和第2種，中使用的是第一種配方，生產(chǎn)工藝是參照日本的無細胞百日咳生產(chǎn)工藝進行生產(chǎn)，我國的無細胞百白破聯(lián)合疫苗已納入中國生物制品規(guī)程2000版中。 0014 3、吸附無細胞百白破疫苗使用情況00151981年日本率先研制成功含有PT、FHA的無細胞百白破疫苗，到目前日本全國已經(jīng)全部使用無細胞百、白、破疫苗用于預防百日咳、白喉和破傷風三種嚴重傳染病，日本自1989年起累計使用了3千多萬人次。 世界衛(wèi)生組織自1986年組織在瑞典進行了第一次臨床試用無細胞百日咳疫苗起，至今世界上有十多個國家已經(jīng)使用了該類疫苗。 美國每年從日本進口無細胞百日咳疫苗原液，用于兒童免疫預防百日咳。 亞洲除日本外，印尼、泰國、韓國和臺灣地區(qū)都從日本進口無細胞百白破疫苗用于免疫接種。 中國許多較發(fā)達地區(qū)已經(jīng)開始大范圍使用無細胞百白破疫苗，但是由于生產(chǎn)的疫苗數(shù)量遠遠不能滿足需要，造成很大的疫苗供應缺口。 發(fā)明內容0016要解決的技術問題0017本發(fā)明的目的之一是提供一種副反應更小，免疫原性更高，接種更安全，接種人群更廣泛的新疫苗及其制備方法。 0018本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，通過將制備所得到的百日咳原液與精致純化得到的白喉類毒素和破傷風毒素混合最終制備得到可用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病的無細胞百白破聯(lián)合疫苗，其特征在于，所述方法采用包括戊二醛解毒步驟的方法來制備包含有效抗原PT和FHA的無細胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50gPN/ml，然后加入戊二醛使其最終濃度為0.5，置于20脫毒，每1小時振搖一次，然后加入賴氨酸溶液，使其最終濃度為0.2，置于20作用3小時；采用包括甲醛解毒步驟的方法來制備白喉類毒素和破傷風毒素，其中制備白喉類毒素時甲醛解毒的具體操作條件為選擇0.5的甲醛，經(jīng)調pH至7.07.2，在3739下脫毒，然后加入賴氨酸(9.125)，脫毒42天左右；制備破傷風毒素時甲醛解毒的具體操作條件為甲醛0.15，放置于37溫箱中加溫脫毒25天。 制備百日咳原液的菌種為百日咳I相菌種58003(CS)，其接種發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為將配制好SSM培養(yǎng)基加入10L發(fā)酵罐，接種細菌的培養(yǎng)濃度為3.0108/ml，培養(yǎng)溫度為37，通氣量4060L/min，壓力0.1kg/cm2，攪拌器的轉速設定為350rpm。 制備無細胞百日咳原液的方法還包括硫酸銨鹽析、密度梯度離心步驟，其中的硫酸銨鹽析是二次鹽析，硫酸銨鹽析的具體操作條件如下收集培養(yǎng)物并加入低說明書102526717A75/10頁8濃度的硫酸銨進行一次鹽析，7日后經(jīng)3500rpm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS進行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘，經(jīng)7000rpm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rpm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內液經(jīng)16000rpm離心，3小時收上清。 制備無細胞百日咳原液的的密度梯度離心是經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心1820小時除去內毒素，收集糖濃度為412之間的樣品。 在制備無細胞百日咳原液時，進行戊二醛脫毒后，將所得原液包透析袋，每袋200300ml，置于28，透析7日，進行戊二醛殘量檢測。 制備得到百日咳原液、白喉類毒素和破傷風毒素后，配置13mg/ml的氫氧化鋁，高壓滅菌，將氫氧化鋁用生理鹽水稀釋至24mg/ml，將百日咳原液、精制白喉和破傷風類毒素加入氫氧化鋁，于20-25攪拌吸附4小時。 0019本發(fā)明采用硫酸銨鹽析法，再經(jīng)過蔗糖密度梯度離心，去除內毒素，獲得百日咳有效抗原PT和FHA，經(jīng)過檢測這兩種有效抗原的純度完全可以達到國家藥典要求的“純度達到85以上”的標準。 0020 1、選取菌株制備培養(yǎng)基00211.1菌株00221.1.1百日咳I相菌58003(CS)菌株中國藥品生物制品檢定所00231.1.2白喉棒狀桿菌菌株(PW8)菌株中國藥品生物制品檢定所00241.1.3破傷風厭氧芽孢桿菌菌株(L58)菌株中國藥品生物制品檢定所00251.2培養(yǎng)基00261.2.1包-姜氏培養(yǎng)基00271.2.2改良林氏培養(yǎng)基00281.2.3半固體碎肉培養(yǎng)基00291.2.4綜合培養(yǎng)基和半綜合培養(yǎng)基00301.2.5改良馬丁培養(yǎng)基和牛肉消化的林氏培養(yǎng)基00311.2.6雙胨培養(yǎng)基0032上述培養(yǎng)基均由公司培養(yǎng)基組提供00331.3試劑00341.3.1百日咳I相標準血清(93-1)中國藥品生物制品檢定所00351.3.2百日咳分型血清 1、 2、3型(84-1)中國藥品生物制品檢定所0036所用化學試劑均為分析純，0037 2、菌種庫的建立及鑒定00382. 1、百日咳菌種庫的建立及檢定0039將原始種子批的凍干菌種啟開后接種于包-姜氏(含25羊血)培養(yǎng)基上，于3537，培養(yǎng)不超過72小時，以后各代不超過48小時，傳至第4代，培養(yǎng)24小時，刮下菌苔，于脫脂牛奶內混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20保存，為主代種子批菌種。 0040主代種子批菌種檢定啟開1支主代種子批菌種，于改良B-G固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)72小時，檢查菌落生長情況為光滑凸起，灰白色不透明露滴狀小菌落，菌落周圍有不清晰溶血環(huán)。 傳3代，37培養(yǎng)48小時，菌苔生長不透明，灰白色，光滑，濕潤；刮取菌苔，進行以下檢定說明書102526717A86/10頁900412.1.1菌落形態(tài)為光滑凸起，灰白色不透明露滴狀小菌落，菌落周圍有不清晰溶血環(huán)。 00422.1.2革蘭氏染色革蘭氏陰性短小卵圓形桿菌。 00432.1.3血清學特性標準診斷血清購自中國藥品生物制品檢定所。 0044試管凝集試驗百日咳I相標準血清批號93-1；刮取菌苔，用比濁法測定菌液濃度，并用0.85NaCl溶液稀釋至30億/ml。 血清稀釋度200、400、800、1600、3200、6400、12800，每管加入以上稀釋度血清0.5ml，加菌液(30億/ml)0.5ml，使之實際血清稀釋度為400、800、1600、3200、6400、12800，混勻，置3過夜，再靜置室溫2小時，判斷凝集效。 0045玻片凝集試驗標準分型因子血清批號84-1( 1、 2、3型)，將標準分型血清分別與刮下的菌苔進行玻片凝集試驗。 00462.1.4生化檢定0047各管加菌液(60億/ml)0.5ml，混勻后置35-37培養(yǎng)7日，00482.1.5皮膚壞死試驗0049用在37培養(yǎng)48小時的菌苔混懸液稀釋，豚鼠皮內注射0.1ml，觀察72小時，記錄出血性壞死部位，用“+”表示。 00502.1.6菌種毒力試驗0051用體重1618g之小鼠隨即分為3組，每組免疫10只，在麻醉狀態(tài)下從鼻腔滴入經(jīng)培養(yǎng)2028小時以PBS稀釋的菌液0.05mL，觀察14天，記錄小鼠生死情況，按ReedMuench法計算LD50，00522.1.7免疫效力試驗0053分別用標準品和待檢品的不同稀釋度免疫小鼠(8只/組)，每只小鼠腹腔注射0.5ml。 免疫14天后，每只小鼠腦內攻擊0.03ml含8萬個菌的菌液 (18323)；同時進行對照組毒力測定，對照組每稀釋度攻擊10只小鼠。 攻毒后，記錄小鼠14天內死亡情況，計算出對照組LD50；并計算待檢菌種的IU值。 00542. 2、白喉棒狀桿菌菌種庫的建立及檢定0055將凍干的原始白喉棒狀桿菌菌種 (38007)啟開后，接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34培養(yǎng)2448小時，再傳代于改良林氏培養(yǎng)基中管中，連續(xù)傳4代，離心后將菌體放置于脫脂牛奶內混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20保存，為主代種子批菌種。 0056白喉棒狀桿菌菌種檢定將凍干的主代種子批白喉棒狀桿菌菌種 (38007)啟開后，接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34培養(yǎng)2448小時，按照中國生物制品規(guī)程2000版中白喉菌種的檢定方法和質量標準，對凍干的白喉棒狀桿菌的主代種子批進行以下菌種檢定。 00572.2.1培養(yǎng)及形態(tài)特性0058將培養(yǎng)好的白喉棒狀桿菌分別接種于以下三種不同的培養(yǎng)基上，進行細菌培養(yǎng)特性的檢查。 0059方法和判定0060呂氏斜面培養(yǎng)菌苔呈灰白色，表面光滑突起；菌落圓形，邊緣整齊。 0061亞碲酸鉀平板培養(yǎng)菌落呈灰黑色具金屬光澤。 說明書102526717A97/10頁100062血瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈灰白色，不透明，不產(chǎn)生溶血素。 00632.2.2鏡檢及染色特性0064方法和判定0065將培養(yǎng)好的白喉棒狀桿菌進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察為深紫色，說明革蘭氏染色陽性，并且具有異染顆粒，桿狀的菌體呈一端或兩端膨大，菌體排列呈柵欄、X或Y。 00662.2.3生化特性0067將菌液接種于各生化培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)7日。 00682.2.4特異性中和反應0069將接種于改良林氏培養(yǎng)基中管，34培養(yǎng)2448小時的白喉主代種子批的細菌接種于呂氏培養(yǎng)基上，進行毒力測定。 0070方法和判定0071Elek平板毒力試驗用濃度為1000Lf/ml的白喉抗毒素制成抗毒素濾紙條，平整鋪于Elek瓊脂培養(yǎng)基或適宜的白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基的雙碟上，倒置雙碟約1小時。 用白金接種環(huán)挑取呂氏培養(yǎng)物，與濾紙垂直劃線接種。 置于37孵箱，培養(yǎng)4872小時，觀察菌種生長邊緣是否有白色沉淀線。 00722. 3、破傷風芽孢桿菌菌種庫的建立及檢定0073將凍干的原始破傷風厭氧芽孢桿菌菌株(L58)菌種啟開后，接種于半固體碎肉培養(yǎng)基中管，放置于34孵箱，培養(yǎng)48小時，連續(xù)傳4代，離心后將菌體放置于脫脂牛奶內混勻，分裝后冷凍干燥，真空封口，-20保存，為主代種子批菌種。 將破傷風厭氧芽孢桿菌菌株(L58)主代種子批菌種啟開后，接種于半固體碎肉培養(yǎng)基中管，放置于34培養(yǎng)48小時，收集菌體，用于以下菌種檢定內容。 00742.3.1培養(yǎng)及形態(tài)特性由于破傷風是專性厭氧桿菌，將培養(yǎng)好的破傷風桿菌接種于不同培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)基形態(tài)特征檢測。 0075方法和判定0076在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)肉湯呈渾濁，產(chǎn)生氣體，具腐敗性惡臭。 0077血瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈彌漫生長。 0078半固體培養(yǎng)基經(jīng)48-72小時培養(yǎng)，穿刺線呈毛刷樣生長，表現(xiàn)菌體鞭毛動力。 00792.3.2鏡檢及染色特性0080方法和判定0081將破傷風桿菌的初期培養(yǎng)菌體進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，革蘭氏染色呈陽性，少見芽孢。 培養(yǎng)48小時以后，可見芽孢，菌體呈鼓槌狀，芽孢位于頂端為正圓形。 00822.3.3生化特性0083將菌液接種于各生化培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)7日，00842.3.4產(chǎn)毒試驗0085方法和判定0086破傷風桿菌經(jīng)液體產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)，過濾取培養(yǎng)液注射至少4只體重1822g小鼠，每只小鼠尾根部皮下注射0.1ml，于注射后1224小時觀察小鼠，出現(xiàn)尾部僵直豎起、后退強直痙攣或全身肌肉痙攣等癥狀。 00872.3.5特異性中和反應說明書102526717A108/10頁110088方法和判定0089取適量產(chǎn)毒培養(yǎng)濾液與相應稀釋的破傷風抗毒素經(jīng)體外中和后，注射4只體重18-22g小鼠，同時設立不結合破傷風抗毒素的培養(yǎng)濾液注射小鼠，作為陽性對照。 注射后每日觀察，陽性對照出現(xiàn)明顯破傷風癥狀并死亡，試驗組小鼠存活。 附圖說明0090圖1為吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗成品生產(chǎn)工藝流程圖。 具體實施方式0091例1無細胞百日咳原液、精制白喉和破傷風類毒素的制備00921. 1、無細胞百日咳原液的制備00931.1.1百日咳I相菌種58003(CS)接種與BG血培養(yǎng)基大管培養(yǎng)34代0094培養(yǎng)時間選擇3844小時，控制pH值8.5左右時，百日咳桿菌的菌體濃度和血凝活性較高。 00951.1.2接種發(fā)酵罐培養(yǎng)0096將配制好SSM培養(yǎng)基加入10L發(fā)酵罐，接種細菌的培養(yǎng)濃度為3.0108/ml，培養(yǎng)溫度為37，通氣量4060L/min，壓力0.1kg/cm2，攪拌器的轉速設定為350rpm。 培養(yǎng)至26個時開始測量發(fā)酵液的pH，濃度，血凝，每隔3h取樣測量以上參數(shù)，共檢測發(fā)酵時間為50小時。 00971.1.3硫酸銨鹽析0098收集培養(yǎng)物并加入低濃度的硫酸銨進行一次鹽析、7日后經(jīng)3500rPm離心40分鐘，棄上清，沉淀中加入PBS(0.05MPB、1MNaCl、0.1g/L硫柳汞、pH8.0)進行一次浸提，每天攪拌2次，每次40分鐘。 經(jīng)7000rPm離心60分鐘棄沉淀、上清液中加高濃度的硫酸銨二次鹽析、經(jīng)9000rPm離心60分鐘，收集沉淀加入PBS(0.05MPB、1MNaCl、0.1g/L硫柳汞、pH8.0)二次浸提3天，每天攪拌2次，每次1小時，包袋透析，銨根檢測合格后，透析內液經(jīng)16000rPm離心3小時收上清。 00991.1.4密度梯度離心0100經(jīng)30000rpm蔗糖密度梯度離心1820小時除去內毒素，收集糖濃度為412之間的樣品。 其中含有PT和FHA組分。 01011.1.5戊二醛脫毒0102戊二醛解毒的濃度為，在222的溫度下解毒時間4小時。 0103將梯度離心后的中間品用PBS稀釋為50gPN/ml，然后加入戊二醛使之最終戊二醛濃度為0.5，置于20脫毒。 每1小時振搖一次。 然后加入賴氨酸溶液，使之最終濃度為0.2，置于20作用3小時。 01041.1.6無細胞百日咳原液0105包透析袋，每袋200300ml，置于28。 透析7日，進行戊二醛殘量檢測。 合格后可收液，否則繼續(xù)透析，透析過程每日換透析液2次。 01061.1.7檢測及肯定的檢測結果0107經(jīng)檢測可以確定上述制備方法最終制備得到的產(chǎn)品中包含目標抗原PT和FHA，且說明書102526717A119/10頁12含量達到相應的要求。 01081.2精制白喉類毒素的制備01091.2.1菌種培養(yǎng)0110采用改良的林氏液體培養(yǎng)基，采用靜止培養(yǎng)和深層培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式。 深層培養(yǎng)方式可以補加氨基酸，調整pH，通過攪拌和控制通氧量及溫度，使得產(chǎn)毒水平大幅度增加。 0111a)大規(guī)模生產(chǎn)細菌時發(fā)酵溫度控制在2435；0112b)pH的變化控制為開始發(fā)酵時pH為7.88.2，以后隨著培養(yǎng)時間會逐步下降，約12小時以后，pH會從8.0逐步降到7.0，然后再逐步回升到8.0，通過補入適當?shù)奶羌右钥刂苝H，在這種條件下說明細菌生長茂盛，產(chǎn)毒較好。 如果pH不斷下降，說明細菌生長不佳。 0113c)根據(jù)培養(yǎng)條件補充碳源和氮源，麥芽糖作為碳源，在pH發(fā)生變化時進行適當?shù)难a充。 在白喉桿菌深層培養(yǎng)時，當氨基氮從1.41.6mg/ml下降到0.40.7mg/ml時，補充谷氨酸鈉，胱氨酸及生長因子可使產(chǎn)毒單位從150Lf/ml提高到400Lf/ml。 控制培養(yǎng)時間在4550小時之間，這時的白喉毒素的Lf/ml產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，并且pH值也基本恒定在8.0左右的生產(chǎn)條件下較為合適。 01141.2.2上清硫酸銨鹽析0115采用硫酸銨分段沉淀法，第一段加入硫酸銨24-27(w/v)，過濾后收集濾液，第二段加入硫酸銨15-18(w/v)，過濾后收集沉淀。 經(jīng)過透析去除-NH4離子，再經(jīng)過除菌過濾，獲得大于1500Lf/ml的精制白喉類毒素。 01161.2.3脫毒0117我們采用的解毒方式是首先將生產(chǎn)的精制毒素，毒素濃度過大，不宜解毒完善，精制后的毒素經(jīng)適當稀釋至濃度為40Lf/ml左右時，再進行解毒，解毒效果較完全，毒性不易發(fā)生逆轉。 然后再進行解毒的工藝，這樣可以減少所生產(chǎn)的毒素損失。 精制毒素的解毒選擇了0.5的甲醛濃度，經(jīng)調pH至7.07.2，在3739下脫毒，經(jīng)一步脫毒和兩步的加深脫毒試驗的比較，采用加入賴氨酸(9.125)，脫毒42天左右，控制了毒性逆轉現(xiàn)象，并且能有效的保持抗原性。 01181.2.4除菌過濾