MS培養(yǎng)基及配制注意事項(xiàng).doc

一、MS培養(yǎng)基母液的配制母液成分規(guī)定量濃縮倍數(shù)稱取量（mg）母液體積（ml）配制1升培養(yǎng)基吸取量定容編號(hào)種類1大量元素KNO3190010190001000 100NH4NO316501016500MgSO47H2O370103700KH2PO41701017002CaCl22H2O44010440010001003微量元素MnSO44H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO47H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54鐵鹽Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有機(jī)物甘氨酸2.010010050010鹽酸吡哆醇0.510025鹽酸硫銨素0.11005煙酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1大量元素按照使用時(shí)高10倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量后，除CaCl22H2O單獨(dú)配制外，其余化合物混合在500ml燒杯中加適量蒸餾水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽注明化合物名稱（或編號(hào)），濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓名，CaCl22H2O配制同上置于另一小口瓶中。2微量元素母液的配制 按要求濃縮100倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量除鐵鹽（FeSO47H2O和Na2-EDTA.2H2O）作為一組單獨(dú)配制外，其余化合物可混合置于燒杯內(nèi)加少量蒸餾水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。3鐵鹽配制將FeSO47H2O和Na2-EDTA.2H2O分別溶于450ml蒸餾水中，加熱，（很重要）不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調(diào)PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，貼上標(biāo)簽。4有機(jī)物母液配制，按母液要求濃縮50倍，除蔗糖按3%單獨(dú)臨時(shí)稱量外，其余分別稱量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。5母液最好在24的冰箱中貯存，特別是有機(jī)類物質(zhì)，貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)，無機(jī)鹽母液最好在一個(gè)月內(nèi)用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。1 制備母液和營養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，所用蒸餾水或無離子水必須符合標(biāo)準(zhǔn)要求，化學(xué)藥品必須是高純度的（分析純）。2 稱量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專用一藥匙。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制： 為了操作方便，節(jié)約時(shí)間，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制培養(yǎng)基時(shí)只要稍加計(jì)算，按需要量取即可。 不同藥品在配制時(shí)若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生長(zhǎng)素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加熱。激動(dòng)素（KT）和6-芐基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。稱取50mg生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5mg，配制后一般要求在低溫（04）保存，配制培養(yǎng)基時(shí)如每升（1000ml）需添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為0.5mg時(shí)，則取1ml母液即可。二、培養(yǎng)基配制和滅菌一養(yǎng)培養(yǎng)基配制程序(一).母液吸取量的計(jì)算 配制培養(yǎng)基的升數(shù)公式1：母液吸取量= 母液體積（CC）母液濃縮倍數(shù) 培養(yǎng)基要求的含量 公式2：母液吸取量= （各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）母液每CC的含量（二） 各種母液按順序編號(hào)排列A. 大量元素；B.CaCl2.2H2O； C.微量元素 ；D.鐵鹽； E.有機(jī)物； F生長(zhǎng)素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA稱取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸餾水定容至1000ml；G.細(xì)胞分裂素、激動(dòng)素（KT）配制0.5mg/ml的KT 稱50mgKT用少量1N HCL溶解后,加蒸餾水定容至100ml。(三)配制培養(yǎng)基（1000ml）1. 瓊脂: 稱取57g瓊脂，加入300ml蒸餾水，加熱溶解直至完全溶解為止.2. 蔗糖3%用質(zhì)量較好的白糖代替，稱取30g白糖，溶于溶有瓊脂的300ml蒸餾水中。3. 各種母液的吸取（培養(yǎng)基1L）（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl22H2O母液（B）各100ml（2） 分別用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），鐵鹽（D）母液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有機(jī)物（H）10ml（4） 移取激素 將上述溶液全部混合于瓊脂與蔗糖溶液中，混合均勻后，加熱至80左右，用酸度計(jì)或精密PH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的PH一般要求5.86.0，過酸過堿則用1N NaoH和1N HCL調(diào)整。二分裝：用一個(gè)接有膠管的分裝器趁熱裝培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基分裝到25-30個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶約30ml左右（一般占試管、三角瓶容量1/41/3左右）注：培養(yǎng)基勿碰瓶壁。三.包裝：分裝好的三角瓶用封口膜包扎好，標(biāo)明培養(yǎng)基代號(hào)即可進(jìn)行滅菌。 用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過的量筒，移液管、燒杯、鋁鍋等用水洗滌干凈，然后按次序放回原處。三、高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法具體操作步驟：1. 高壓鍋放水至平把架；2. 把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋;3. 蓋上熱壓鍋蓋,上緊螺帽(注意對(duì)角擰緊螺帽)關(guān)上氣閥和安全閥.4. 然后接通電源.5. 壓力計(jì)升至0.05MPa時(shí)，打開放氣閥,排除冷空氣(此步很重要)。6. 排除冷空氣后,關(guān)閉放氣閥，待壓力升到0.11MPa位置時(shí)，開始計(jì)算滅菌時(shí)間，具體方法：當(dāng)壓力鍋指針升至0.12MPa時(shí)，關(guān)閉電源，待指針下降至0.11MPa時(shí)接通電源，不斷重復(fù)此操作過程，維持20分鐘。7. 滅菌時(shí)間達(dá)到20分鐘后，除去電源，打開放氣閥(注意要逐漸放氣)待高壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后，打開熱壓滅菌鍋蓋(注意對(duì)角扭松螺帽)稍待冷后再把培養(yǎng)基取出。8.經(jīng)過滅菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長(zhǎng)，應(yīng)盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有無微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25下保存4天，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，可在4低溫下保存。 滅菌高壓鍋有大型臥式、中型立式、小型手提式等多種型號(hào)和規(guī)格，無論哪種型號(hào)，操作的步驟都很相近。 進(jìn)水放進(jìn)培養(yǎng)基蓋緊鍋蓋關(guān)上放汽閥檢查安全閥接上加熱源待壓力升至0.05MPa時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥0.11MPa(121)下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力除熱源逐漸打開放氣閥鍋內(nèi)空氣排除完后開放鍋蓋稍冷后取出培養(yǎng)基。四、無菌操作技術(shù)（一）植物材料表面消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。1.接種步驟： 第一步：清理材料流水沖洗加入吐溫（或洗衣粉）清洗 自來水沖洗第二步：對(duì)材料的表面浸潤滅菌 ： 70%酒精浸10-30秒無菌水第三步：滅菌劑處理 0.1-1%升汞5-8 min（或其他滅菌劑） 第四步：無菌水進(jìn)行沖洗注意事項(xiàng)：.滅菌劑一般要臨時(shí)配制，現(xiàn)配現(xiàn)用升汞可以短期儲(chǔ)存.對(duì)去除較容易的滅菌劑滅菌后無菌水沖洗-次，升汞一般-次，每次不少于min.滅菌時(shí)要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底.滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。.滅菌液要充分浸沒材料2.無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：（1）在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時(shí)打開其內(nèi)紫外線燈進(jìn)行殺菌；（2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；（4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面；（5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢＃ㄈ缛~片切成0.5cm2的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片葉原基）在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。常用植物激素類別名稱縮寫詞分子量使用濃度范圍母液配制說明生長(zhǎng)素2，4二氯苯氧乙酸2，4D221.00.00110mg/L生長(zhǎng)素通常用NaOH溶液滴至溶解成溶液。能溶于乙醇IAA易被植物細(xì)胞所氧化。故培養(yǎng)基中很少單獨(dú)使用。萘乙酸NAA186.20.00110mg/L吲哚3乙酸IAA175.20.00110mg/L吲哚3丁酸IBA203.20.00110mg/L細(xì)胞分裂6芐基氨基嘌呤BA225.2分裂素通常能溶于稀NaOH，含水乙醇或稀鹽酸玉米素不耐熱，不能高壓滅菌。6糠基氨基嘌呤KT215.2N異戊烯氨基嘌呤（玉米素）ZT219.2赤霉素赤霉素GA3346.4能溶于乙醇不耐熱不能高壓滅菌在愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物的啟動(dòng)和保持生長(zhǎng)時(shí)才需要有時(shí)小植株再生時(shí)也需要四、常用藥品的配置方法1.1mol/L HCl的配制：根據(jù)鹽酸的密度37%鹽酸溶液的密度為1.19克/毫升，假設(shè)要配制1000ml 1mol/L HCl，則需要鹽酸的物質(zhì)的量為1mol，所以需要量取37%的鹽酸為1*36.5/37%/1.19=82ml 2.1mol/L的NaOH的配制：稱40gNaOH，然后融于1000ml的蒸餾水中。（定容到100ml）3.95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸餾水即可得到75%的酒精。如果用無水酒精配制75%的酒精，則量取750ml的無水酒精，再加水250ml。4.0.1%的升汞