微生物學(xué)實驗指導(dǎo)書

實驗一 微生物的分離和純化 本實驗以微生物的分離和純化為主線，綜合包括了培養(yǎng)基的配制、消毒滅菌、微生物的分離等內(nèi)容，在給定的時間內(nèi)由學(xué)生自主完成。包括以下知識內(nèi)容。學(xué)生書寫實驗報告的時候，不能照抄襲原文，要用自己的語言，表述實驗過程，在別人看完你的實驗報告后，能夠知道你是怎樣做的，能夠重復(fù)你的實驗過程。一、目的要求1了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握常用培養(yǎng)基的配制方法。2掌握高壓蒸汽滅菌的原理和操作方法。3 學(xué)習(xí)、掌握細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。4 學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。5 學(xué)習(xí)并掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌及霉等種類的微生物的培養(yǎng)條件。二、原理 培養(yǎng)基是將微生物生長繁殖所需要各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的各種營養(yǎng)基質(zhì)。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和無機鹽類。此外，微生物還必須在最合適的酸堿度范圍的培養(yǎng)基上生長繁殖，因此，對不同種類的微生物，應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的PH值范圍。根據(jù)研究目的不同，可將培養(yǎng)基制成固體、半固體和液體三種形式。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.52%的瓊脂作凝固劑，半固體培養(yǎng)基則加入0.50.8%的瓊脂。有時為了特殊目的，也可用明膠或硅膠等作為凝固劑。 由于微生物營養(yǎng)類型不同，應(yīng)提供不同種類的培養(yǎng)基。在分離、培養(yǎng)異樣微生物時，對一般細(xì)菌常用肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，對放線菌常用高氏合成1號培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌、霉菌則用麥芽汁或豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，有時也常用馬丁培養(yǎng)基分離霉菌。馬丁培養(yǎng)基除含有霉菌所含需的各種營養(yǎng)物外，還有孟加拉紅染料，能抑制放線菌和細(xì)菌，鏈霉素可殺死或抑制細(xì)菌，但對霉菌均無害，所以這種培養(yǎng)基具有選擇作用。 滅菌的方法很多，最常用的是加壓蒸汽滅菌法。此法是把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的。在每平方厘米為一個大氣壓（即15磅/時2）的壓力下，溫度可達(dá)121，一般只要持續(xù)1520分鐘后，就可殺死一切微生物的營養(yǎng)體和它們的各種孢子。由于加壓蒸汽滅菌是通過提高蒸汽壓力而使其升高溫度以殺死微生物的，所以，該法只有當(dāng)滅菌鍋內(nèi)的空氣完全排盡后，才能達(dá)到最佳效果。土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多；其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥、偏堿性、有機質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實驗從土壤中分離細(xì)菌、放線菌和霉菌；自面肥或酒曲或果園土分離酵母菌。為了分離和確保獲得某種微生物的單菌落，首先要考慮制備不同稀釋度的菌懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時的季節(jié)、氣溫等條件而異。其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同特性，避免菌源中各類微生物的相互干擾。細(xì)菌或放線菌皆喜中性或微堿性環(huán)境，但細(xì)菌比放線菌生長快，分離放線菌時，一般在制備土壤稀釋液時添加10的酚或在分離培養(yǎng)基中加相應(yīng)的抗生素以抑制細(xì)菌和霉菌（如加鏈霉素2550 u/ml以抑制細(xì)菌；添加制霉菌素50 u/ml或多菌靈30 u/ml以抑制霉菌）。酵母菌和霉菌都喜酸性環(huán)境，一般酵母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5時生長極快，而細(xì)菌生長適宜的酸堿度為pH 7，所以分離酵母菌時只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH，可降低細(xì)菌增殖率，霉菌生長慢，也不干擾酵母菌分離。若分離霉菌，需降低細(xì)菌增殖率，一般培養(yǎng)基臨用前需添加滅過菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計數(shù)，分離霉菌時常在培養(yǎng)基中加入化學(xué)抑制劑。三、試驗材料1藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、麥芽汁、氫氧化鈉2其它：試管、三角瓶、移液管、燒杯、量筒、玻棒、漏斗、紗布、棉花、牛皮紙、天平、PH試紙、馬鈴薯干、高壓蒸汽滅菌鍋。3無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒（刮刀）、稱量紙、藥勺、橡皮頭、10酚溶液。四、試驗方法與步驟：（一） 玻璃器皿的準(zhǔn)備 培養(yǎng)基的配制消毒滅菌 1根據(jù)實驗需要，準(zhǔn)備各種玻璃器皿，洗刷干凈，用報紙包扎好，進行干熱滅菌。需要什么，需要多少，各實驗組要認(rèn)真核算，否則影響實驗進程。2培養(yǎng)基的配制：（1）稱藥品： 根據(jù)配方，計算出試驗中各種藥品所需要的量，然后分別稱取。（2）溶解： 一般情況下，幾種藥品可一起倒入燒杯內(nèi)，先加入少于所需要的總體積的水進行加熱溶解（但在配置化學(xué)成分較多的培養(yǎng)基時，有些藥品，如磷酸鹽和鈣鹽、鎂鹽等混在一起容易產(chǎn)生結(jié)塊、沉淀，故宜按配方依次溶解。個別成分如能分別溶解，經(jīng)分開滅菌后混合，則效果更為理想）。加熱溶解時，要不斷攪拌。如有瓊脂在內(nèi)，更應(yīng)注意。待完全溶解后，補足水分到需要的總體積。（3）調(diào)節(jié)PH： 用滴管逐滴加入1N的NaOH，邊攪動，邊用精密的PH試紙測其PH值，直到符合要求時為止。PH值也可用PH計來測。（4）過濾： 要趁熱用四層紗布過濾。（5）分裝： 按照實驗要求進行分裝。裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，以免弄濕棉塞，造成污染。培養(yǎng)基的分裝裝置見圖（6）加塞： 培養(yǎng)基分裝好以后，在試管口或燒瓶口上應(yīng)加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)，防止由此而引起的污染；另一方面保證優(yōu)良還得通氣性能，使微生物能不斷地獲得無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實驗的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形與未開傘的蘑菇相似，其大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。加塞時，棉塞總長度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5應(yīng)在口外。作棉塞的棉花要選用纖維較長的，一般不用脫脂棉作棉塞，因為它容易吸水變濕，造成污染，而且價格也較貴。棉塞的一般制作方法可參見圖如果培養(yǎng)基在短期內(nèi)使用，不用棉塞，直接套上一只鋁質(zhì)試管帽也可試管帽是通過互相交叉的彈簧絲來控制與試管的松緊度。它的外形、構(gòu)造如圖在微生物實驗或科研工作中，常常要用到通氣塞。所謂的通氣塞就是用幾層紗布（一般是六至八層）做成的、通氣性能更加良好的塞子。通氣塞加在裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶瓶口上，放在搖床上進行振蕩培養(yǎng)，可獲得更多的氧氣來促進菌體生長或進行發(fā)酵。它的形狀如圖（7）包扎：棉塞塞好以后，試管用棉繩扎成捆。在棉塞的外面包上一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水的沾濕和滅菌后的灰塵侵入。然后再用棉繩扎好，掛上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。（8）滅菌：一般情況下，培養(yǎng)基配好以后，應(yīng)立即滅菌。如不及時滅菌，應(yīng)放入冰箱內(nèi)保存。（9）擱置斜面：滅菌后，固體培養(yǎng)基如需制成斜面，應(yīng)在未凝固前將試館有塞的一頭擱在一根長的玻棒或木條上即可。擱置的斜度要適當(dāng)。斜面長度一般以不超過時管長度的1/2為宜3培養(yǎng)基的滅菌：（1）加水： 直接往滅菌鍋內(nèi)加水約3升（2）裝料： 將待滅菌的物品放在滅菌桶內(nèi)。包于包之間留有適當(dāng)?shù)目障?，以利蒸汽的流通。?）密封： 將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)。上下對齊，擰緊螺栓，切勿滴漏氣。（4）升壓： 點燃煤氣，加熱至水沸騰，排盡鍋內(nèi)空氣（可將排出的氣體用橡皮管引至深層冷水中，如只聽有“噗噗”之聲而未見氣泡逸出水面，表示鍋內(nèi)空氣以排盡）。然后蓋上放氣閥，升壓。（5）滅菌： 待壓力達(dá)到一定時，關(guān)小煤氣，使其恒壓，并開始計算滅菌時間。（6）降壓： 達(dá)到規(guī)定的滅菌時間后，關(guān)閉煤氣，讓其自然降壓冷卻。（7）取料： 待壓力完全降至“零”后，打開放氣閥，再松動螺栓，拿掉蓋子，從滅菌筒內(nèi)取出滅過菌的材料。（8）倒水： 滅菌鍋用好以后，將鍋內(nèi)剩余的水倒掉，以免日久腐蝕。按照上面的步驟，參照教材，配置下列培養(yǎng)基，配制的量，同學(xué)們自己估算，要略有剩余，不能浪費。A.配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。B.配制高氏一號培養(yǎng)基。C.配制馬丁氏培養(yǎng)基。D.分裝上述培養(yǎng)基與三角瓶和試管中，并包扎E.將上述配置分裝和包扎好的培養(yǎng)基進行高壓蒸汽滅菌（二） 土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌的分離與純化1細(xì)菌的分離（1）制備土壤稀釋液 稱取土樣1g，在火焰旁加入到一個盛有99ml并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中，振蕩1020min，使土樣中菌體、芽孢或孢子均勻分散，制成10-2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進行稀釋分離，以制備10-7稀釋度為例，具體操作過程如下：取4.5ml無菌水試管6支，按10-310-7順序編號，放置試管架上。取無菌移液管一支，從移液管包裝紙?zhí)字虚g撕口，將包裝紙?zhí)追殖缮稀⑾聝啥?，去除上段包裝紙?zhí)祝谝埔汗苌隙斯芸谘b橡皮頭，取出下段移液管紙?zhí)追胖米烂?，以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮頭，將吸液端口及移液管外部表面迅速通過火焰23次，殺滅撕紙?zhí)讜r可能污染的雜菌，切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底，以右手掌及小指、無名指夾住錐形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夾在手上，不能亂放在桌上），將1ml移液管的吸液端伸進振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部，用手指輕按橡皮頭，在錐形瓶內(nèi)反復(fù)吹吸三次（吹吸時注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后準(zhǔn)確吸取0.5ml 10-2土壤稀釋液，右手將棉塞插回錐形瓶上，左手放下錐形瓶，換持一支盛有4.5ml無菌水試管，依前法在火焰旁拔除試管帽（或棉塞），將0.5ml 10-2土壤稀釋液注入4.5ml無菌水試管內(nèi)，制成10-3的土壤稀釋液，將此移液管在試管內(nèi)反復(fù)吹吸三次，然后取出移液管，并將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。蓋上試管帽，右手持10-3稀釋液試管在左手上敲打2030次，混勻土壤稀釋液。再從紙?zhí)兹〕鲈瓉淼囊埔汗埽迦胂♂屢阂鸦靹虻脑嚬軆?nèi)，再吹吸三次，然后準(zhǔn)確吸出0.5ml 10-3的稀釋液，置第二支裝有4.5ml無菌水試管中，制成10-4土壤稀釋液。用同法再制成10-5、10-6、10-7的土壤稀釋液（為避免稀釋過程誤差，進行微生物計數(shù)時，最好每一個稀釋度更換一支移液管）。最后用畢的移液管重新放入紙?zhí)變?nèi)。待滅菌后，再洗刷或?qū)⒂眠^的移液管放在廢棄物筒中，用35來蘇爾浸泡1h后再滅菌洗滌。（2）傾注法分離 取無菌培養(yǎng)皿69個，分別于培養(yǎng)皿底面按稀釋度編號。稀釋完畢后，可用原來的移液管從菌液濃度最小的10-7土壤稀釋液開始吸取1ml稀釋液，按無菌操作技術(shù)加到相應(yīng)編號10-7的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。再以相同方法分別吸取1ml 10-6、10-5的土壤稀釋液，各加到相應(yīng)編號為10-5、10-6的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將已滅菌的肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化，待冷卻至4550左右，分別傾入到已盛有10-5、10-6、10-7土壤稀釋液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。注意：溫度過高易將菌燙死，皿蓋上冷凝水太多，也會影響分離效果；低于45培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不平。傾倒培養(yǎng)基時注意無菌操作，要在火焰旁進行。左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶底部，左手同時用小指和手掌將棉塞拔開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入培養(yǎng)基約1215ml，將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕前后左右轉(zhuǎn)動，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，混勻后靜置桌上。整個操作過程見圖（3）培養(yǎng) 待平板完全冷凝后，將平板倒置于37恒溫箱中，培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。2放線菌的分離（1）制備土壤稀釋 液稱取土樣1g，加入到一個盛有99ml并裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中，并加入10滴10的酚溶液（抑制細(xì)菌生長），有時也可不加酚。振蕩后靜置5min，即成10-2土壤稀釋液。（2）傾注法分離 按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-3、10-4、10-5三個稀釋度，然后用無菌移液管依次分別吸取1ml 10-5、10-4、10-3土壤稀釋液于相應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用高氏合成1號培養(yǎng)基依前法傾倒平板，每個稀釋度做23個平行皿。（3）培養(yǎng) 冷凝后，將平板倒置于28恒溫箱中，培養(yǎng)57d觀察結(jié)果。3真菌的分離（1）制備土壤稀釋液 稱取土樣5g，加入到一個盛有95ml無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩10min，即成10-2土壤稀釋液。（2）傾注法分離 依前法將土壤稀釋液再稀釋成10-3、10-4的土壤稀釋液。然后用無菌移液管分別吸取1ml 10-4、10-3、10-2土壤稀釋液于相應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。采用馬丁培養(yǎng)基傾倒平板，為了抑制細(xì)菌生長和降低菌絲蔓延速度，馬丁培養(yǎng)基臨用前需無菌加入孟加拉紅、鏈霉素和去氧膽酸鈉。每個稀釋度作23平行皿。（3）培養(yǎng) 冷凝后，將平板倒置于28恒溫箱中，培養(yǎng)35d后觀察結(jié)果。（三）劃線分離法菌種被其他雜菌污染時或混合菌懸液常用劃線法進行純種分離。此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散成由單個微生物細(xì)胞繁殖而成的菌落，從而達(dá)到純化目的。平板制作方法如前所述。但劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。連續(xù)劃線法是從平板邊緣一點開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當(dāng)中不需灼燒接種針上的菌（圖6-1-4A）；另一種是將平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。劃線時每次將平板轉(zhuǎn)動6070劃線（見圖6-1-4B），每換一次角度，應(yīng)將接種針上的菌燒死后，再通過上次劃線處劃線。1連續(xù)劃線法以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落（參見附錄四微生物的接種技術(shù)）。將菌種點種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷涼，然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時平板面與接種環(huán)面成3040，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線，接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊（圖6-1-4A，6-1-5）。劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷涼后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（以免培養(yǎng)過程皿蓋冷凝水滴下，沖散已分離的菌落）。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。2分區(qū)劃線法（四分區(qū)劃線法，圖6-1-4B）取菌、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相似。分區(qū)劃線法劃線分離時平板分4個區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。其中第4區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第4區(qū)內(nèi)劃線與1、2、3區(qū)線條相接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃35條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉(zhuǎn)動6070，右手把接種環(huán)上多余菌體燒死，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉(zhuǎn)動約6070，同樣依次在3、4區(qū)劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。本次實驗在分離細(xì)菌的平板上選取單菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次劃線分離，使菌進一步純化。劃線接種后的平板，倒置于30恒溫箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。五、復(fù)習(xí)思考題：1 分析新配制培養(yǎng)基中，何為碳源，何為氮源？2 如何檢查滅過菌的培養(yǎng)基是否無菌？3 培養(yǎng)基為什么要調(diào)整pH值？細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌生長最適pH值為多少？4 根據(jù)哪些菌落特征可區(qū)分細(xì)菌、放線菌、酵母菌與霉菌？它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在菌落形態(tài)上有什么聯(lián)系？實驗二 微生物的染色由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的運動性和直接計算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進行觀察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實情況，染色觀察時必須注意。一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。細(xì)菌的等電點較低，pH值大約在25之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進行染色。影響染色的其它因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細(xì)菌的染色。 二、染料的種類和選擇染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復(fù)雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機酸或堿類，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復(fù)合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?、酸性染料這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。2、堿性染料這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細(xì)菌易被堿性染料染色。3、中性（復(fù)合）染料酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。4、單純?nèi)玖线@類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。 三、制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。1、制片在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。2、自然干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。3、固定標(biāo)本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：）殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。）改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過34次，共約23秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60）,放置待冷后，進行染色。以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。化學(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，12%的餓酸等。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的12%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過12分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。4、染色標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。染料作用標(biāo)本的時間平均約13分鐘，而所有的染色時間內(nèi)，整個涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。若作復(fù)合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進行。、脫色用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色。可檢查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。、復(fù)染脫色后再用一種染色劑進行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進行染色，就是復(fù)染。、水洗染色到一定的時候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。、干燥著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。、鏡檢干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。綜上所述，染色的基本程序如下：制片固定媒染染色脫色復(fù)染水洗干燥鏡檢。四、染色方法微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。、單染色法用一種染色劑對涂片進行染色，簡便易行，適于進行微生物的形態(tài)觀察。在一般情況下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其呈現(xiàn)強酸性（低于細(xì)菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。染色結(jié)果依染料不同而不同：石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時間短，菌體呈紅色。美蘭染色液：著色慢，時間長，效果清晰，菌體呈蘭色。草酸銨結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。、革蘭氏染色法革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：）涂片固定。）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。）自來水沖洗。）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。）水洗，用吸水紙吸去水分。）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。）蕃紅梁色液（稀）染10秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色 實驗三 微生物細(xì)胞大小測定和計數(shù)、微生物細(xì)胞大小的測定一、實驗原理 微生物細(xì)胞的大小，是微生物重要的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小、只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺(圖)是一塊圓形玻片，其中央刻有精確等分的刻度，有把5毫米刻成為50等分或把10毫米長度刻成100毫米。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上來測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同的顯微鏡放大倍數(shù)不同，同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下，其放大倍數(shù)也不相同，而目鏡測微尺是處在目鏡的隔板上，每格實際表示的長度不隨顯微鏡的總放大倍數(shù)的放大而放大，僅與目鏡的放大倍數(shù)有關(guān)，只要目鏡不變，它就是定值。而顯微鏡下的細(xì)胞物象是經(jīng)過了物鏡、目鏡兩次放大成象后才進入視野的。即目鏡測微尺上刻度的放大比例與顯微鏡下細(xì)胞的放大比例不同，只是代表相對長度，所以使用前須用置于鏡臺上的鏡臺測微尺(或血球計數(shù)板)校正，以求得在一定放大倍數(shù)下實際測量時的每格長度。二、實驗器材 1、儀器 顯微鏡，目鏡測微尺，鏡臺測微尺或血球計數(shù)板 2、材料 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)標(biāo)本片目鏡測微尺及其安裝方法如圖三、操作步驟 1、目鏡測微尺的校正 把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把血球計數(shù)板置于載物臺上，使刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準(zhǔn)焦距，視野中看清血球計數(shù)板的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與血球計數(shù)板的刻度平行，移動推動器、使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個完全重合的刻度。計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和血球計數(shù)板的格數(shù)。因為血球計數(shù)板的刻度每格長50微米，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度：例如目鏡測微尺10小格等于血球計數(shù)板2小格，已知血球計數(shù)板每小格為50微米則2小格的長度為250微米100微米，那么相應(yīng)地在目鏡測微尺上每小格長度為： 同法校正在高倍鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。2、測定巨大芽孢桿菌細(xì)胞大小 換上巨大芽孢桿菌標(biāo)本片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下轉(zhuǎn)動目鏡測微尺，測出巨大芽孢桿菌菌體的長、寬各占幾格(不足一格的部分估計到小數(shù)點后一位數(shù))，測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的長度，即等于該菌的大小。一般測量菌的大小要在同一個涂片上測定10-20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小，而且一般是用對數(shù)生長期的菌體進行測定。四、注意事項1、 當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。2、 不能用血球計數(shù)板對目鏡測微尺在油鏡下進行校正時，此時目鏡測微尺每格相當(dāng)于1微米。、微生物的顯微鏡直接計數(shù)法一、實驗原理 測定微生物數(shù)量方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。 鏡檢計數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球計數(shù)板；一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤(Petroff Hausser)細(xì)菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故細(xì)菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網(wǎng)(圖-2)。每個方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱為計數(shù)室)常被用作微生物的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即每個大方格都由400個小方格組成(圖5)。 每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為l4000mm3。使用血球計數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。 圖-2 血球計數(shù)扳的構(gòu)造 a.平面圖(中間平臺分為兩半，各刻有一個方格網(wǎng)) b.側(cè)面圖(中間平臺與蓋玻片之間有高度為0.1毫米的間隙)圖-3 血球計數(shù)板計數(shù)網(wǎng)的分區(qū)和分格二、實驗器材1、 1、 菌種 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌液；2、 2、 儀器 顯微鏡，血球計數(shù)板；3、 3、 材料 蓋玻片，吸水紙，尖嘴滴管。三、操作步驟 1、視待測菌液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋(斜面一般稀釋到10-2)，以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。 2、取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)室上蓋上一塊蓋玻片。 3、將酵母菌液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過多)，使菌液沿兩玻片間自行滲入計數(shù)室，勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌液。也可以將菌液直接滴加在計數(shù)室上，然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。 4、靜置約5分鐘，先在低倍鏡下找到計數(shù)室后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察計數(shù)。 5、計數(shù)時用16中格的計數(shù)板，要按對角線方位，取左上、左下、右上、右下的4個中格(即100小格)的酵母菌數(shù)。如果是25中格計數(shù)板。除數(shù)上述四格外，還需數(shù)中央1中格的酵母菌數(shù)(即80小格)。由于菌體在計數(shù)室中處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)螺旋，方能數(shù)到全部菌體，防止遺漏。如菌體位于中格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。 6、凡酵母菌的芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復(fù)分?jǐn)?shù)2-3次(每次數(shù)值不應(yīng)招差過大，否則應(yīng)重新操作)，取其平均值，按下述公式計算出每毫升菌液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)。每毫升菌液含菌數(shù)每小格酵母細(xì)胞數(shù)40001000稀釋倍數(shù)7、血球計數(shù)板用后，在水龍頭上用水柱沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或吹風(fēng)機吹干。四、注意事項1 加酵母菌液時，量不應(yīng)過多，不能產(chǎn)生氣泡。1、 由于酵母菌菌體無色透明，計數(shù)觀察時應(yīng)仔細(xì)調(diào)節(jié)光線?；蛘哂脜问蠅A性美藍(lán)染液處理酵母菌液。實驗四 細(xì)菌的生理生化試驗 一、目的 （一）了解細(xì)菌鑒定中常用的生理生化試驗反應(yīng)原理 （二）掌握測定細(xì)菌生理生化反應(yīng)的技術(shù)和方法 二、原理 各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。由于細(xì)菌特有的單細(xì)胞原核生物的特性，這種差異就表現(xiàn)的更加明顯。不同細(xì)菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物學(xué)技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天，細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。 三、材料 （一）菌種 大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）、（二）培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） （三）試劑 40NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示劑。 （四）器具 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。 四、流程 糖發(fā)酵試驗V-P試驗甲基紅試驗吲哚試驗 五、步驟 (一)糖類發(fā)酵試驗 1.目的 了解不同細(xì)菌分解利用糖的能力及實驗原理，并掌握其操作方法 2.原理 可根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。 3.材料 （1）菌種 大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）、（2）培養(yǎng)基 葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管 4.流程 發(fā)酵液試管標(biāo)記接種培養(yǎng)觀察記錄 5.步驟 (1)試管標(biāo)記圖糖發(fā)酵產(chǎn)氣 取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各不產(chǎn)氣；產(chǎn)氣 4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌和空白對照。 (2)接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中（圖9-1），置37恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結(jié)果。 (3)觀察記錄 與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”表示。 （二）乙酰甲基甲醇試驗(VP試驗) 1.目的 了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，并掌握其操作方法 2.原理 某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP（+）反應(yīng)。 3.材料 (1)菌種 大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）、(2)培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管 4.流程 培養(yǎng)液試管標(biāo)記接種培養(yǎng)觀察記錄 5.步驟 (1)標(biāo)記試管 取5支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、(2) 接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。 (3) 觀察記錄 取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加入35ml以上對應(yīng)管中的培養(yǎng)液，再加入40NaOH溶液1020滴，并用牙簽挑入約0.51mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽性反應(yīng)（用“”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應(yīng)（用“”表示）。 注意：原試管中留下的培養(yǎng)液用作甲基紅試驗。 （三）甲基紅試驗（M.R.試驗） 1.目的 了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗原理，并掌握其操作方法 2.原理 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。 3.材料 (1) 菌種 同VP試驗 (2) 培養(yǎng)基 同VP試驗 4.流程 培養(yǎng)液指示劑觀察記錄結(jié)果 5.步驟 于V.P.試驗留下的培養(yǎng)液中，各加入23滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“”或“”表示。 （四）吲哚試驗 1.目的 掌握吲哚試驗(Ehrlich法)的原理和方法 2.原理 有些細(xì)菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))。吲哚本身沒有顏色，不能直接看見，但當(dāng)加入對二甲基氨基苯甲醛試劑時，該試劑與吲哚作用，形成紅色的玫瑰吲哚。 3.材料 (1) 菌種 測試菌株 (2) 培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基 (3)試劑 二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 4. 流程