westernblot.doc

實驗四：免疫共沉淀蛋白質(zhì)免疫印跡分析姓名： 學號： 專業(yè)： 【實驗?zāi)康摹?、 掌握蛋白質(zhì)免疫印跡分析的基本原理2、 掌握蛋白質(zhì)免疫印跡分析的基本操作過程【實驗原理】蛋白質(zhì)免疫印跡分析又稱Western Blot，是以某種抗體作為探針，使之與附著在固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原部位發(fā)生特異性反應(yīng)，從而對復(fù)雜混合物中的某些特定蛋白質(zhì)進行鑒別和定量。這一技術(shù)講蛋白質(zhì)凝膠電泳分辨率高與固相免疫測定特異性強的特點結(jié)合起來，是一種重要的蛋白質(zhì)分析測試手段。蛋白質(zhì)凝膠電泳利用不連續(xù)系統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的分辨率。由于其電泳體系中有三種物理效應(yīng)：（1）凝膠的分子篩效應(yīng)；（2）電泳分離的電荷效應(yīng)（3）樣品的濃縮效應(yīng)。固相免疫測定是通過電場作用把凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉非特異位點后，使用目的蛋白的特異抗體檢測，并通過種屬特異的二級抗體的結(jié)合及放射自顯影或者原位酶反應(yīng)，確定抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物的位置及豐度。本實驗是蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗的第二部分，主要是通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析對大鼠肝組織中PCNA與p21相互作用進行檢測。同時，進一步學習蛋白質(zhì)免疫印跡分析原理及基本操作過程?！緦嶒灹鞒獭?、配制Tris-SDS-PAGE：a洗板及電泳裝置，并確定其底端的密閉性；b配置10%分離膠，灌膠至距梳齒下緣0.51cm，加水封閉，聚合約30min；c去水，并配置5%濃縮膠，插入梳子，注意避免氣泡，室溫約30min；d裝好電泳裝置，內(nèi)槽倒?jié)M電泳緩沖液，拔去梳子，并沖洗加樣孔。2、準備樣品：加入工作液為1的loading buffer，煮沸5min，瞬離，上樣。3、電泳：80V，30min；100V, 1h。4、轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)方式，安放順序：黑膠（SDS-PAGE）白膜（NC膜），由陽極向陰極依次安放：3層濾紙3張，NC膜，凝膠，3層濾紙；注意除氣；電轉(zhuǎn)100V，1h；5、封閉：5%脫脂奶粉封閉NC膜，室溫，1h；6、一抗孵育：NC膜放入雜交袋，封好三面，加入一抗（1：2000稀釋的小鼠抗大鼠PCNA抗體），封嚴雜交袋，4 overnight。7、漂洗：TBST漂洗三次，每次5min。8、二抗孵育：NC膜放入雜交袋中，加入二抗（1：2000稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG），封嚴雜交袋，于室溫1h。9、漂洗：TBST漂洗三次，每次5min。10、顯影：將ECL化學發(fā)光試劑A液B液混合，加在有NC膜面上，反應(yīng)約1 min，置熒光圖像分析系統(tǒng)檢測?！緦嶒灲Y(jié)果】InputIgGCoIPmarker43KD34KD 上圖所示為Western Blot曝光圖，Input即陽性對照，IgG代表陰性對照，Co-IP代表ProteinA拉下的免疫復(fù)合物，為待測蛋白，目的條帶PCNA蛋白出現(xiàn)在35kD大小處?！緦嶒炗懻摗?、圖中在55kD和25kD處的條帶為小鼠抗大鼠P21抗體的重鏈和輕鏈。2、由于陽性對照和免疫復(fù)合物（Co）均出現(xiàn)目的蛋白，說明最有可能的原因是一抗孵育的操作失誤，或者是因為大鼠肝臟的問題。【W(wǎng)estern Blot注意事項】1、為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設(shè)計對照實驗，對照分為：陽性對照（最好有標準品（比如-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）。2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實驗結(jié)果以及背景的深淺。3、實驗設(shè)計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實驗結(jié)果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。5、電泳、轉(zhuǎn)膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉(zhuǎn)膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。6、加一抗二抗要嚴格保證反應(yīng)時間，洗膜要注意盡可能地將