腫瘤動物模型課件

腫瘤動物模型 腫瘤動物模型 2015342056導(dǎo)師孔維2015 11 30 腫瘤動物模型 腫瘤動物模型 一 自發(fā)性腫瘤動物模型二 誘發(fā)性腫瘤動物模型三 移植性腫瘤動物模型及其研究方法四 人體腫瘤異種移植性腫瘤模型 腫瘤動物模型 一 自發(fā)性腫瘤動物模型 定義 實驗動物不經(jīng)人為實驗處理而自然發(fā)生的腫瘤 成為自發(fā)性腫瘤 實驗動物選擇 高發(fā)病率的實驗動物 一般選用小鼠 mouse 腫瘤動物模型 常用腫瘤模型小鼠腫瘤自然發(fā)生率 腫瘤動物模型 自發(fā)性腫瘤動物模型的優(yōu)點 自然發(fā)生 腫瘤發(fā)生學(xué)與細(xì)胞學(xué)特點與人類腫瘤相似 2 便于慢性治療及綜合治療 3 發(fā)生條件自然 可通過細(xì)致觀察研究發(fā)現(xiàn)新的環(huán)境致癌因素及其他致癌因素 可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發(fā)生中的作用 腫瘤動物模型 自發(fā)性腫瘤動物模型的缺點 腫瘤發(fā)生情況參差不齊 難以短時間內(nèi)獲得大量腫瘤材料 耗時長 耗資大 發(fā)生腫瘤的動物腫瘤生長速度差異大 難以評價 腫瘤動物模型 二 誘發(fā)性腫瘤動物模型 定義 使用致癌因素 Carcinogens 在實驗條件下誘發(fā)動物發(fā)生腫瘤的動物模型 原理 利用外源性致癌因素引起細(xì)胞遺傳特性異常而呈現(xiàn)出異常生長和高增殖活性 形成腫瘤 腫瘤動物模型 用于誘發(fā)實驗性腫瘤的動物種類很多 以嚙齒動物的使用最多 應(yīng)用最廣 包括各種大鼠 小鼠 豚鼠等 誘發(fā)性腫瘤模型動物選擇 腫瘤動物模型 物理方法 放射性物質(zhì)致瘤 用放射線照射或局部注射放射性同位素 化學(xué)方法 使用化學(xué)致癌物 如苯并芘 benzpyrene 甲基膽蒽 MC 聯(lián)苯胺 benzidine 亞硝胺類 nitrosamine 黃曲霉素類 aflatoxin 等 生物方法 用能誘發(fā)動物腫瘤的病毒致癌 如 小鼠白血病病毒 SV40病毒 用轉(zhuǎn)基因的方法誘發(fā)動物產(chǎn)生腫瘤 可根據(jù)啟動子類型的不同選擇不同的發(fā)瘤器官 如用乳球蛋白啟動子的SV40T抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠 可誘發(fā)乳腺癌或胰腺癌 MMTV Wnt 1轉(zhuǎn)基因小鼠高發(fā)乳腺癌 誘發(fā)性腫瘤動物模型建立方法 腫瘤動物模型 原位誘發(fā)致癌物直接與動物靶組織或靶器官接觸而誘發(fā)該組織或器官發(fā)生腫瘤 異位誘發(fā)將與致癌物接觸后的動物組織或器官埋置于該動物或另一正常動物皮下而產(chǎn)生的該組織或器官的腫瘤 誘發(fā)性腫瘤動物模型建立方法 腫瘤動物模型 1 涂抹法 皮膚癌 2 經(jīng)口給藥法 消化道或消化腺 3 注射法4 氣管灌注法 肺癌 5 穿線法6 埋藏法 誘發(fā)性腫瘤模型 致癌物給予途徑 腫瘤動物模型 1 肺癌 Carcinomaofthelung 簡述 在實驗功物身上誘發(fā)肺癌 要比誘發(fā)其他腫瘤困難得多 誘癌率低 呼吸道給藥的方法常常誘發(fā)多種肺外腫瘤而不是肺腫瘤 方法 二乙基硝胺 DEN 誘發(fā)小鼠肺癌 小鼠每周皮下注射1 DEN水溶液1次 每次劑量為56mg kg 烏拉坦誘發(fā)肺腺癌 小鼠 A系 1 1 5月齡 每次每只腹腔注入馬拉坦生理鹽水液0 1 0 3ml 間隔3 5日再注 共注2 3個月每只小鼠用量約為100mg 誘發(fā)性腫瘤模型 舉例 腫瘤動物模型 特點 DEN總量達(dá)868mg 觀察時間為100天 發(fā)癌率可達(dá)40 DEN總量達(dá)1176mg 觀察時間為半年時 發(fā)癌率可達(dá)94 其中支氣管鱗狀細(xì)胞癌占41 烏拉坦注后3個月肺腺癌發(fā)生率為100 且多數(shù)為多發(fā)性 誘發(fā)肺腫瘤的部位和組織分型與人類肺腫瘤相近似 腫瘤動物模型 2 食管癌 Carcinomaofesophagus 簡述 亞硝胺在體內(nèi)經(jīng)過代謝 產(chǎn)生重碳烷 使核酸或其他分子發(fā)生烷化而致癌 不對稱亞硝胺口服或胃腸外給藥 均能誘發(fā)大鼠食管癌 方法 甲基芐基亞硝胺 MBNA 誘發(fā)食管癌 將1 MBNA溶液加在少量的粉末狀飼料中 攪拌均勻 出1月齡以上Wistar大鼠自由攝食 結(jié)藥量每天0 75 1 5mg kg 二烴黃樟素誘發(fā)大鼠食管癌模型 在大鼠飼料中加入微量 1 2500 1 10000 黃樟素喂養(yǎng)大鼠誘發(fā)率達(dá)20 一70 腫瘤動物模型 特點及應(yīng)用 MBNA誘發(fā)的食管癌可見食管鱗狀細(xì)胞癌的組織 但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移 亞硝胺致癌性較強(qiáng) 大劑量1次給藥 即可致癌 腫瘤動物模型 3 肝癌 Carcinomaoftheliver 簡述 常用口服致肝癌的物質(zhì)有乙基亞硝胺 DEN 4 2甲基氨基偶氮苯 DBA 2 乙酰氨基酸 2AAF 亞胺基偶氮甲苯OAAT和黃曲霉素 方法 DEN誘發(fā)大鼠肝癌 取體重250g左右的封閉群大鼠給與0 25 DEN水溶液0 25 1mL灌胃或稀釋10倍放在飲水瓶中自由飲水 劑量為每天2 10ml kg 喂養(yǎng)半年左右 黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌 每月飼料中含0 001 0 015mg kg混入飼料中喂6個月左右 腫瘤動物模型 特點及應(yīng)用 DEN誘發(fā)大鼠致癌率為70 DBA誘癌率為60 黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生率為80 此種方法從病因?qū)W角度分析 與人體腫瘤較為近似 故此類模型常用于腫瘤特點的深入研究 腫瘤動物模型 4 宮頸癌 Carvicalcarcinoma 用穿線法將附有0 1mg二甲基膽蒽 DMC 的棉沙線結(jié)穿入雌性小白鼠的宮頸部 并固定縫線 觀察半年左右處死動物 取宮頸組織 腫瘤動物模型 三 移植性腫瘤動物模型及其研究方法 定義 模型是指將動物或人體腫瘤移植到同種或異種動物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成移植性腫瘤動物的腫瘤實驗動物選擇 移植性腫瘤常用動物為小鼠 大鼠和地鼠腫瘤細(xì)胞的選擇 篩選抗癌藥物時 最好選用3類瘤株 及肉瘤 腹水型腫瘤和白血病株 在眾多移植性腫瘤中 小鼠Lewis肺癌 小鼠黑色素瘤B16及小鼠白血病P388是目前最受重視和應(yīng)用最廣的 腫瘤動物模型 接種方法 無菌操作 1 實體瘤 實體瘤接種法 瘤塊接種法 瘤細(xì)胞懸液接種法 培養(yǎng)細(xì)胞接種法 活細(xì)胞接種方法等 腫瘤動物模型 瘤塊接種法 選取接種后7 10d生長狀態(tài)良好的瘤源動物 頸椎脫臼處死 消毒操作部位皮膚 切開皮膚 剝離出接種用的瘤塊 剔除非腫瘤組織和壞死組織 選取生長良好而無變性壞死 淡紅色 黑色素瘤則呈黑色或黑紫色 魚肉裝的瘤組織 在無菌平皿內(nèi)剪成2mm3小塊 平皿放置在冰塊上 平皿內(nèi)放置少許滅菌的PBS或其它營養(yǎng)液 用無菌套管針抽吸瘤塊 接種于同種受體動物腋窩皮下 接種部位皮膚應(yīng)先消毒 也可取出腫瘤后切成小塊 在受體動物的腋下剪開一個小口 用無齒眼科鑷夾取瘤塊 送入切口內(nèi) 腋窩部皮膚松弛 能允許腫瘤生長的較大 宿主動物的壽命也可延長 接種操作的時間盡可能縮短 從瘤塊取材到接種結(jié)束一般應(yīng)在30min內(nèi)完成 腫瘤動物模型 瘤細(xì)胞懸液接種法 每次接種的動物數(shù)量較多時可采用此法 具體方法是 無菌操作取出瘤塊 將數(shù)個瘤塊混合后剪成小塊 放入玻璃勻漿器中 加無菌生理鹽水向一個方向轉(zhuǎn)動研磨后 經(jīng)濾網(wǎng)過濾 加生理鹽水稀釋成1 3 1 4 腫瘤g 生理鹽水ml 的瘤細(xì)胞懸液 用臺盼蘭染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù) 用1ml注射器注射到接種部位 每個接種點接種0 2ml 一般含1 106 1 107個細(xì)胞數(shù) 通常接種到腋窩皮下 每只動物可選用多個接種點 腫瘤動物模型 瘤細(xì)胞懸液接種法 將對數(shù)生長期細(xì)胞用0 25 胰蛋白酶消化脫壁后 用PBS或者生理鹽水以1000r min離心10min 洗滌2次 洗掉細(xì)胞中胰蛋白酶和培養(yǎng)液中血清等成分 用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞數(shù) 用生理鹽水將腫瘤稀釋成一定濃度的細(xì)胞懸液 細(xì)胞懸液置于冰上 使用1ml注射器在每個接種點接種0 2ml 含1 106 1 107個細(xì)胞 應(yīng)盡快注射到接種部位 腫瘤動物模型 2 腹水瘤 腫瘤動物模型 腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 對腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存可以使其得以長期使用 防止退化或變異 保存不同代細(xì)胞的特征 一般在液氮中保存1 2年 細(xì)胞存活率可達(dá)80 90 1 凍存方法 取對數(shù)生長期增殖旺盛的細(xì)胞 胰蛋白酶消化 離心 洗滌 用含7份培養(yǎng)液 2份小牛血清 1份DMSO配成 1 5 106個 ml的細(xì)胞懸液 轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管 將凍存管于4 放置30min 20 放置4h 70 過夜 然后放入液氮中 2 復(fù)蘇方法 取出凍存管 迅速放入38 40 水浴中 并不停搖動使其在一分內(nèi)全部融化 500 800r min離心5min 棄上清 加入培養(yǎng)液 轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng) 次日更換培養(yǎng)液 以后按常規(guī)培養(yǎng) 腫瘤動物模型 四 人體腫瘤異種移植性腫瘤模型 這種模型使用人的腫瘤細(xì)胞 在病理組織形態(tài)和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同 用這種模型可以比較直接的研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物 常用的宿主動物 裸小鼠和C57BL 6小鼠 腫瘤動物模型 裸小鼠作為移植宿主 實驗動物 在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長的BALB c裸小鼠 6 8周齡 體重21 22g 瘤源 來源大致分兩類 一類是人的腫瘤細(xì)胞株 另一類是源于人體腫瘤組織快的癌細(xì)胞 常用的人癌裸鼠細(xì)胞株 接種方法和最佳生長期為 結(jié)腸癌HCT 8 勻漿 3周 胃癌MGC 803 組織塊 4 5周 肝癌BEL 7402 組織塊 4周 小細(xì)胞肺癌LTEP SM1 組織塊 4 5周 乳腺癌MCF 7 組織塊 4 5周 等操作方法 例 人胃腺癌SGC 7901 1 超凈臺內(nèi)將移植瘤剪成2 3mm3大小的瘤塊 用套管針接種在BALB c裸小鼠右側(cè)腋窩皮下2 接種24h后隨機(jī)分組 開始給予受試藥進(jìn)行實驗治療 試驗周期6周左右3 停藥次日 稱體重 剝?nèi)∧[瘤并稱重 計算瘤重抑制率 腫瘤動物模型 觀察指標(biāo)與療效評價 1 動物在接種腫瘤后6周左右形成1g以上的瘤塊 平均瘤重 則表明移植腫瘤成功2 如出現(xiàn)20 小鼠的瘤重小于400mg 則表示腫瘤生長不良3 在藥物治療期間 如給藥組小鼠死亡率超過20 或剝?nèi)∧[瘤后平均體重下降超過15 自身對照 表示藥物存在毒性 應(yīng)當(dāng)減量重新實驗4 藥效可根據(jù)給藥后瘤重抑制率來評價 瘤重抑制率大于30 并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時 表示該受試藥有苗頭 重復(fù)3次 如療效穩(wěn)定 評定該藥有一定療效注 腫瘤模型形成時間較長 需30 40d甚至更長 在異種移植瘤實驗中 還有一種正位移植 即將人癌組織或細(xì)胞按其在人體內(nèi)的原發(fā)部位 接種于相應(yīng)的器官 有別于通常的皮下接種 異位接種 腫瘤動物模型 免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主 實驗動物 體重120 160g的Wistar大鼠操作方法 例 人胃癌細(xì)胞株 1 大鼠分籠飼養(yǎng) 皮下注射具有免疫抑制作用的阿糖胞苷200mg kg體重 2d后用10Gy 1000rad 60Co全身照射 照射后的大鼠飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中 每日紫外線燈照