免疫組化教程

第一章 免疫細胞化學基本概念及發(fā)展簡史 一免疫細胞化學的基本概念免疫細胞化學（ immunocytochemistry）是利用特異性抗原抗體反應，觀察和研究組織細胞特定抗原（或抗體）的定位和定量的技術。應用免疫細胞化學技術可以在光鏡和電鏡水平觀察細胞膜及細胞內某種抗原物質的存在。從而為生物醫(yī)學研究生命大分子，特別是那些對細胞化學方法來說尚無作用物或作用物特異性不強的酶、蛋白質、激素及受體蛋白等在組織內分布、細胞內定位以及代謝狀態(tài)等，提供了特異性強、靈敏度高而又直觀化的原位分析細胞組成物質的細胞化學手段。二免疫細胞化學的發(fā)展簡史1941年， Coons等創(chuàng)立了熒光抗體法1959年， Singer創(chuàng)立了鐵蛋白法1966年， Nakane等創(chuàng)立了免疫酶技術1971年， Faulk和Taylor 創(chuàng)立了免疫膠體金法1976年， Bayer等提出了親合組織化學法第二章 免疫細胞化學相關的組織學和細胞學技術一 取材（一） 組織標本的取材1. 活檢鉗的刃口鋒利，以免組織受擠壓。2. 取所需組織：主要病變區(qū)、病灶與正常組織交界區(qū)。必要時取遠離病變區(qū)的正常組織作為對照。3. 為充分保存組織的抗原性, 取材要快，盡量保持組織新鮮。（二） 細胞標本的取材1 印片法應用：活檢標本、手術切除的標本。方法：新鮮標本以最大面剖開暴露病區(qū)，載玻片輕壓病區(qū)，脫落細胞黏附于載玻片上，立即浸入固定液中510分鐘，取出自然干燥，低溫保存。優(yōu)點：簡便省時，細胞抗原保存較好。缺點：細胞分布不均重疊，影響標記效果。2 穿刺吸取涂片法應用：實質器官的病變區(qū)。方法： 穿刺液較少時直接涂片，力求均勻。穿刺液較多時，穿刺液滴入12毫升Hanks液（RPMI 1640液）內，輕攪，500rpm離心510分鐘，棄上清，制成細胞懸液（2x106細胞/ml）,吸一滴于載玻片上，輕涂，干后固定。優(yōu)點：細胞均勻。缺點：細胞易變形。3 體液沉淀涂片法細胞數(shù)多，取一滴直接涂片。細胞數(shù)少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm離心10分鐘，棄上清，將沉淀涂片，略干后固定備用。4 培養(yǎng)細胞貼壁生長的細胞：將蓋玻片插入培養(yǎng)液中。懸浮生長的細胞：可用離心涂片法制成涂片。5 離心涂片機法 細胞懸液21056， 1000r/min， 2min，50100ml。注意事項： 防止脫片, 涂黏附劑，。為節(jié)省試劑及便于鏡下觀察和計數(shù)，將細胞集中到直徑0.6-1.0cm圓圈內，細胞總數(shù)以105為宜。粘液豐富的標本如胃液、痰液等未經特殊處理，不宜作免疫組化。二固定（一）免疫組化的固定法選擇最佳固定的標準最好的保存細胞和組織的形態(tài)結構。最大限度的保存抗原的免疫活性。固定有：（1）物理固定：血膜空氣快速干燥，凍結干燥。（2）化學固定：固定方法1. 浸潤法（ immersion method） 424小時。2. 灌流法 ( irrigation method )麻醉動物，經動物左心室主動脈插管，生理鹽水沖洗，注入固定液，組織在30分鐘內取材。（二）重要的固定液1 10中性緩沖福爾馬林雙功能交聯(lián)劑。使組織間相互交聯(lián)，保存抗原于原位。特點是對組織穿透性強，收縮性小，易使組織硬化而浸蠟困難。固定時間不宜過長。2 4%多聚甲醛磷酸緩沖液 適應性較廣泛的固定液，固定時間不宜過長。3 Bouin,s液 對組織固定力強且較均勻。比單獨醛類固定更適合免疫組化染色，4 0C。4 Zamboni,s液 可用于光鏡、電鏡免疫細胞化學觀察。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對組織的穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。618小時。5 丙酮 用于冰凍切片及細胞涂片的固定。固定較好，對組織穿透性很強 ，保存抗原的免疫活性較好，染色效果稍差。4 0C，510分鐘，干燥后低溫保存。6 95乙醇用于冰凍切片及細胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他試劑混合使用，染色較好。7 AAF液：較常用的固定液。（95-100%酒精85ml, 冰醋酸5ml, 濃甲醛10ml.）（三）固定劑的選擇各種抗原的最佳固定劑的選擇見表。鑒于10%中性甲醛是國際最通用的固定劑，雖然它對保存Ig抗原方面較差，若采用合適的蛋白酶消化處理，進一步暴露抗原，結合使用敏感的免疫組化方法，如PAP，ABC法，仍不失為一可用的固定劑。固定時間可適當縮短至16-24小時。免疫球蛋白類抗原可選用含汞類的固定液，(如Zenker固定液)，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃體、淋巴結和骨髓還可用甲縮醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蠟切片，能有效地保存Ig。腫瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA)對多種固定均穩(wěn)定。一般可用中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片）激素類中的多肽類激素宜選用Bouin。組織之中酶和一些組織特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等)可用10%中性甲醛。 待測抗原與固定液的關系 抗原 適 用 固 定 液細胞表面抗原 100%丙酮，95%乙醇，10%福爾馬林，Bouin液免疫球蛋白 Zenker固定液,10%福爾馬林，95%乙醇，100%丙酮，酶，蛋白類 10%福爾馬林，Bouin液，95%乙醇，100%丙酮肽類激素 Bouin液，10%福爾馬林，F(xiàn)AA固定液固醇類 10%福爾馬林，Bouin液補體 95%乙醇，100%丙酮，10%福爾馬林，Bouin液腫瘤胚胎抗原 10%福爾馬林，（四）注意事項免疫組化固定方法的原則是：在保持細胞形態(tài)完好和所測抗原的前提下，應采用濃度最低的固定液和最短的固定時間。為此，固定組織時應該：1 組織新鮮，盡早、盡快固定。2 組織塊盡量小(300，000)水溶液，涂布載片后，晾干或45 0C烤干，一周內應用。此溶液需冷凍貯藏。（5）APES：3-Amino propyltriethoxy silaneAPES/丙酮（1/50）涂片晾干。（6）APES 和Poly-L-lysine（PLL）聯(lián)合應用 適于特別容易脫片的情況。第三章 免疫細胞化學染色 免疫細胞化學的類型根據(jù)標記物的性質，可將免疫組化染色法分為以下幾種：(1) 免疫熒光法(Immunofluorescence technique)(2) 免疫酶法(Immunoperoxidase technique)(3) 親合組織化學法（affinity histochemistry）(4) 免疫金銀法(Immunogold technique)(5) 其它：放射免疫法。此外，尚有根據(jù)染色及抗體滴加步驟，分類為直接法，間接法，橋法等。一免疫細胞化學染色方法及原理（一） 免疫熒光技術 (Immunofluorescence technique)1. 免疫熒光直接法原理：優(yōu)點：簡單、省時、特異性強。缺點：一種標記抗體只能檢測一種抗原；敏感性差。2. 免疫熒光間接法原理：優(yōu)點：一種標記抗體可用于多種一抗（只要一抗是同種動物產生的）；敏感性較直接法高10倍左右。缺點：非特異性著色機會較多；染色時間長。 3.雙重免疫熒光標記法標本保存及封片介質及時照相，可050C暗處保存。緩沖甘油液（PH8.5）0.5mmol/lPH8.5碳酸鹽緩沖液1份，無熒光甘油9份混勻即用。熒光顯微鏡標本制作要求載玻片光潔均勻，厚度，在0.8-1.2mm間，無明顯自發(fā)熒光。有時需石英玻璃載玻片。蓋玻片光潔，厚度0.17mm左右。切片不宜太厚。 暗視野熒光顯微鏡和油鏡觀察時，使用無熒光鏡油，或上述甘油及液體石蠟。（二） 免疫酶標技術(Immunoperoxidase technique)1. 酶標抗體法通過共價鍵將酶結合在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產物，于顯微鏡下進行細胞或組織表面或內部某種抗原成分定位觀察。 HRP（POD） ALP直接法 優(yōu)點：簡單、省時、特異性強。缺點：一種標記抗體只能檢測一種抗原；敏感性差。間接法優(yōu)點： 與免疫熒光技術相比，此法終產物可在普通光鏡下觀察，切片可長久保存，反復觀察。2. 非標記抗體酶法(1) 酶橋法優(yōu)點：提高了敏感性。(2) 過氧化物酶抗過氧化物酶法（peroxidase anti- peroxidase method, PAP 法） 1970年，Sternberger 優(yōu)點：敏感，適合于石蠟切片中微量抗原的檢測。缺點：步驟多，費時，不適合臨床常規(guī)檢驗。（三） 親合組織化學（affinity histochemistry）1. 抗生物素(親合素)生物素過氧化物酶復合物技術(Avidin-Biotin.-Peroxidase Complex technique ABC法)基本原理：2 鏈酶親合素生物素過氧化物酶復合物技術（Strept Avidin-Biotin -Peroxidase Complex ，SABC） 基本原理： 鏈酶親合素是一種從鏈酶菌Streptomyces Avidinii 培養(yǎng)物中提取的蛋白質，有四個生物素結合位點，親和力高。是一種接近于更完美的生物素結合蛋白。 生物素是一種水溶性維生素（維生素H）。生物素活化后，可以標記抗體和酶而不影響其活性。鏈酶親合素同一定濃度的生物素化酶混合后，形成鏈酶親合素生物素酶復合物 。這種復合物至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結合位點，可以和各種生物素標記抗體結合。這種復合物即是SABC。市售的試劑盒中SABC的A液和B液合二為一。 SABC具有下述特點：1 高敏感性。2 低背景。3 簡便快速。4 結果穩(wěn)定。試劑盒分型濃縮型SABC過氧化物酶即用型SABC過氧化物酶：SABC預稀釋，可以直接使用。濃縮型SABC堿性磷酸酶 (容易克服組織細胞中內源性酶的干擾，尤其是血液、骨髓、胃腸等富含過氧化物酶的組織，應用SABCAP效果較好。)即用型SABC堿性磷酸酶SABC免疫組化雙重染色試劑盒：(同時采用SABCPOD和SABCAP試劑盒進行免疫組化雙重染色。)3葡萄球菌蛋白A技術（Staphylococal Protein A, S P A）4凝集素（組織化學）技術 凝集素(lectin)：是一種從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅細胞而得名。種類很多，常用的為植物凝集素，如：花生凝集素(Peanut agglutinin) PNA D-半乳糖刀豆素A（Concanavalin ensifomis agglutinin） Con A D-葡萄糖特點：1）能識別糖蛋白和糖肽，特別是細胞膜中復雜的碳水化合物結構（碳水化合物抗原決定簇）2）具有多價結合的能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等示蹤物結合， 從而在光鏡、電鏡水平顯示其結合部位。 一般認為，細胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細胞的類型及反映細胞在分化、成熟和細胞惡變中的變化。 凝集素本身不是來源或參與免疫反應的產物，放此講授，是由于凝集素具有某些親合特性，能被免疫細胞化學技術方法所應用。 (四) 免疫金銀法(Immunogold technique)二 免疫組化染色的重要環(huán)節(jié)1選擇最佳的固定方法和制片方法2免疫組織化學中的對照實驗 由于影響免疫組化的因素甚多，染色中必須有陽性和陰性對照。 陽性對照片可選用其它組織標本并行固定、包埋、染色，并且經該抗體證實為中等陽性反應。 陰性對照片仍用上述相同程序，證實其免疫反應為陰性。待檢標本上滴加PBS以及同種非免疫動物血清以代替第一抗體，用以檢查抗體的特異性。若僅滴加第一抗體的標本陽性，說明特異性高。免疫組化對照試驗及判斷標本號試驗組陽性對照陰性對照替代抗體對照結論1+ 受檢標本含抗原2+受檢標本不含抗原3操作錯誤4+非特異性染色5+非特異性反應6+陽性對照差注：第一批抗血清做一次對照實驗即可。必須用連續(xù)切片普通染色組進行對照。3. 選擇抗體的最佳稀釋度最佳稀釋度可提高染色的陽性率，獲得染色的良好的對比?？贵w濃度過高。反而會減弱抗原抗體的結合，甚至出現(xiàn)假陰性結果。抗體稀釋的原則是： 抗體的工作滴度(稀釋后的應用濃度)高有助于減少污染蛋白的非特異著色，節(jié)省試劑。 選擇所測抗原著色最強、背景著色最弱的滴度。 根據(jù)抗體和待染標本等具體情況，確定最佳工作滴度。 稀釋液中常用0.01M PBS，但不宜放過久。欲放置抗體長久，可用Tris緩沖液稀釋，或專用抗體稀釋液。直接測定法：其它條件穩(wěn)定，用于測定一抗最佳稀釋度。選擇抗體的最佳濃度一抗稀釋度 特異性染色強度 非特異性染色背景強度1:50 1:100 1:200 陰性對照 在1:100與1:200間如上找出最佳稀釋度。棋盤（方陣）測定法：欲測知二種以上抗體的免疫反應濃度，可測試比較9張標本的陽性反應和背景著色。從下表可知，應采用1:20的第二抗體，并進一步在1:50-1:100之間尋得第一抗體的最佳工作稀釋度。 抗體的最佳滴度測試表第二抗體第一抗體稀釋度1:501:1001:2001:20+(+)+()+（）1:40+（）+（）+（）1:80+（）+（）+（）注( )內為背景著色 若應用三種以上抗體的染色法，如PAP法，ABC法，可按上表求得第二、第三抗體的最佳配伍滴度。之后可按商品說明選擇第一抗體滴度，或按優(yōu)選法求得高稀釋度，逐步縮小優(yōu)選范圍，選中最佳滴度。稀釋中，一般常微量加樣品。最常用者為10l、20l、50l、100l、和200l?？贵w稀釋后應充分混勻。4抗體的孵育時間一般說，抗體稀釋度愈高則孵育時間愈長，標本染色對比度愈大。使用高滴度抗體，可將切片置于4度冰箱內過夜(約18小時)，以增強特異性著色而減少非特異染色，提高對比。為節(jié)省時間，加強反應亦可于室溫下孵育20分鐘，37度下孵育5-10分鐘。若標本中抗原很強，可適當延長孵育時間。孵育應在濕盒中進行。5其它 注意滴加抗體時應適量。以抗體充分覆蓋組織片為準，不可過多或過少。PBS洗滌抗體時應充分，且應防止使用同一PBS容器導致交叉反應。最終標本顯色時，應用光鏡控制和觀察最佳顯色反應和時間。一般顯色時間約為515分鐘。以陽性反應著色最強而背景開始著色為度。免疫細胞化學染色的注意事項 反應的pH值應以接近體液環(huán)境為宜，即組織片與各種標記抗體液應處于同 一酸堿度（pH7.0-7.2） 為避免非特異沉著和交叉反應，各標記抗體液要在染色前經離心去沉淀 要特別注意載玻片是否處于水平位置（滴染時），確保染色液覆蓋整個切面。 染色反應要在保濕容器內進行，以防止染色液的蒸發(fā)干涸。 染色的抗原抗體反應要在37度或室溫下進行。但對耐熱能力差的抗原，要 在4度低溫下延長反應的時間。四 免疫組化有關技術（一） 抗體的保存抗體的保存40C保存一年。稀釋后40C保存13天、7天后效價顯著降低。（二）增強特異性染色的方法1 蛋白酶消化法0.1胰蛋白酶 最常用。用前370C水浴。消化530分鐘。04胃蛋白酶370C消化530分鐘。2 抗原修復高溫高壓組織抗原修復適用范圍：大量常規(guī)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片的抗原修復，效果優(yōu)于微波法和直接煮沸法。儀器設備：普通家用壓力鍋。緩沖液：0.01M檸檬酸緩沖液，PH6.0。 方法：切片水化。緩沖液置于壓力鍋內加熱至沸騰，放入切片，繼續(xù)加熱至噴汽（扣閥至噴汽以46分鐘為最佳）、12分鐘后，壓力鍋離開熱源、1分鐘后，自來水淋壓力鍋至室溫，開蓋，取出切片，蒸餾水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。注意事項：用過的緩沖液棄去。加熱時間不宜太長，否則背景加深。組織抗原微波修復適用范圍：多數(shù)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片的抗原修復。儀器設備：家用微波爐，進口微波爐置“DEFROST”檔。方法：去除內源性酶的切片置入盛有已煮沸緩沖液的耐熱容器中，繼續(xù)加熱至981000C，持續(xù)810分鐘。取出容器至室溫。蒸水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。注意事項：不可將切片從緩沖液中取出冷卻。組織抗原直接煮沸修復適用范圍：多數(shù)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片的抗原修復。方法：切片水化。置入盛有已煮沸緩沖液的燒杯中繼續(xù)加熱10分鐘。加入蒸餾水補充水分損失。燒杯離開熱源，置流水槽內冷卻至室溫。蒸水沖洗3分鐘x2次,PBS沖洗3分鐘x2次。注：一般，對于不太熟悉的一抗染色石蠟切片時，應比較一下抗原修復、胰酶消化和不做預處理的染色效果。如果石蠟切片無法作出滿意的結果，則應考慮用冰凍切片。3 合適的抗體稀釋度抗體效價越高，工作液稀釋度越高?？贵w稀釋度越大，孵育時間越長。只有高稀釋度時才能防止非特異性背景產生。盡量使用單克隆抗體（MAB）。4 孵育時間370C，3060分鐘。40C過夜（約18小時）或室溫。5 去污劑0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%Triton X-100處理切片，去除脂類，促進抗體進入細胞中。但是濃度過高會破壞細胞抗原和細胞膜結構。6 顯色增敏劑過氧化物酶底物中加入氯化鎳、0.1N異吡唑、氯化銨、硫酸鎳銨等可增強顯色敏感度。（三）非特異染色和內源性過氧化物酶的消除法 在免疫細胞化學染色中，常在非抗原部位出現(xiàn)陽性反應（非抗原抗體反應出現(xiàn)的陽性反應），稱為非特異性染色，致背景著色過深。非特異性染色，背景色過深其可能原因有：1粘片劑使用不當。2固定(如可因液中殘存的游離醛基所引起)3切片或涂片太厚。4脫蠟不徹底。5未用酶消化處理切片或進行抗原修復。6內源性酶未阻斷。7標記抗體、I抗的不純；抗體濃度過高，抗體的稀釋度不夠，反應后沖洗不充分。8血清封閉不夠或血清溶血。9洗滌不徹底。10底物呈色時間過久。11細胞或組織與血清或酶之間由于靜電吸引所致的吸附作用造成。去除非特異染色的方法：1 血清封閉加一抗前，用與二抗同種動物非免疫血清封閉組織上帶電荷基團，去除其與一抗的非特異性結合。必要時加入25牛血清白蛋白。也可用除制備一抗以外其他動物非免疫血清。室溫或37度，30分鐘。2 緩沖液洗滌用緩沖液加入0.9%NaCL成為高鹽溶液，充分洗滌切片。3 盡可能高地稀釋一抗。在組織中的紅細胞、粒細胞含有較多的內源性過氧化物酶，其它細胞和組織中也有少量。為此，實驗中設法消除或抑制內源性過氧化物酶。去除內源性過氧化物酶的常用方法：3H 2O2蒸餾水或PBS，或3H 2O2甲醇， 室溫30min處理切片。去除內源性生物素的常用方法： 生物素是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉換酶等催化的代謝環(huán)節(jié)中所產生的羧基的中間載體，它存在于某些組織和細胞內，在應用ABC法，LSAB法，SP法SABC法染色時會與抗生物素結合而產生非特異性染色。因此，對抗生物素結合性較高的組織如冰凍切片和肝、腎、腦等組織的石蠟切片，在應用上述染色方法前應預先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20min左右，以消除內源性抗生物素結合活性，每次作用后用PBS洗5min，更換3次。內源性生物素封閉試劑： Avidin Biotin Blocking Reagent (ABB) (市售)（四）顯色時間的控制著色太深可減少反應時間。過氧化物酶顯色時，H 2O2濃度較大使顯色反應過快而致背景加深，過量H 2O2又抑制酶的活性，故H 2O2濃度要適中。五。免疫細胞化學染色結果判定陽性細胞陽性細胞染色分布類型：胞漿細胞核細胞膜 陽性細胞分布呈現(xiàn)灶性/彌漫性。陽性細胞染色強度不一。若細胞間染色強度相同，常常提示為非特異性反應。陽性反應定位于細胞，且與陰性細胞相互交雜分布。而非特異性反應常常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。切片邊緣、刀痕、皺折處或壞死擠壓的細胞區(qū)、膠原結締組織等，常常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度，但不能用于判斷陽性。染色失敗的原因假陰性固定方法不對，抗原在石蠟切片中遭到破壞，尤其是不規(guī)范的石蠟標本。未加一抗，或一抗與試劑盒中二抗不配對，或抗體失效，或抗體的濃度過低?？贵w孵育時間太短。染色過程中切片干燥，或未嚴格按照步驟操作如抗原修復和消化等預處理不當。酶底物中H 2O2量少或失效。復染或脫水劑使用不當。假陽性粘片劑太厚。部分多克隆抗體特異性差。抗體濃度太高?；蚩贵w孵育時間太長。PBS中未加NaCl，PH值不準，洗滌不徹底。切片在染色過程中干燥。使用已經變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長，或H2O2濃度過高，呈色速度過快。第四章 免疫細胞化學染色的應用1 免疫細胞化學在FCM（Flow Cytometry）中的應用 關鍵是對細胞進行免疫熒光染色。 方法： 直接染色法 間接染色