不同地理位置的微生物差別ppt課件

,取自中國不同地區(qū)活性污泥樣本中細(xì)菌群落的焦磷酸測(cè)序分析,蔣一凡&劉苗苗&熊蓓蓓,材料：活性污泥,來源:8城市，10市政WWTPs，曝氣池東部西北北部：SJZ（工廢）這些WWTPs主要處理生活污水，大多數(shù)WWTPs采用（A/O，A/A/O，OD）樣本處理：無菌塑料瓶（11）-80一個(gè)晚上干冰運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)室,WX（CAST）,MAS,SZ（工廢，SBR）,HF（工廢）,NJ,LZ（工廢，CASS）,ULMQ（AB）,研究目標(biāo),估計(jì)來自不同地理位置樣本的細(xì)菌群落組成的相似性和差異性獲得活性污泥樣本中微生物相互作用的更好理解,研究意義,研究這些復(fù)雜又多樣化群體物種（共生模式）之間的相互作用能夠很好地理解在污水處理過程中這些細(xì)菌群體的作用作用：細(xì)菌在活性污泥中起主導(dǎo)因素而且在去除有機(jī)污染物，毒素和營養(yǎng)素起到重要作用對(duì)活性污泥中細(xì)菌組成的更好理解可以提供有用的信息去改善污水處理效率以及闡明微生物對(duì)活性污泥的形成，發(fā)展和功能的影響,研究方法的確定,第二代高通量測(cè)序：提供足夠的序列長(zhǎng)度來覆蓋復(fù)雜的微生物群體,網(wǎng)路分析：分類關(guān)系是活性污泥中細(xì)菌群落形成的主導(dǎo)因素,研究方法及過程,DNA提取PCR擴(kuò)增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）焦磷酸測(cè)序序列分析數(shù)據(jù)分析網(wǎng)路分析,各研究方法的目的,高通量測(cè)序：活性污泥樣本中細(xì)菌群落的組成NMDS和ANOSIM：活性污泥中細(xì)菌群落構(gòu)成的顯著的地理性差異16srRNA基因檢測(cè)技術(shù)：細(xì)菌多樣性網(wǎng)路分析：10個(gè)污水廠中細(xì)菌的共生模式,DNA提取,50ml樣本，4000rpm（4）離心15min將懸浮液倒出，每個(gè)樣本的三倍顆粒量（大約0.3g）用來DNA提取0.8%瓊脂糖凝膠電泳：原DNA分析土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒(人工指令):相同樣本中抽取的三份DNA進(jìn)行結(jié)合和提純生物光度計(jì)：分析提取DNA的質(zhì)量,PCR擴(kuò)增,細(xì)菌的16SrRNA基因擴(kuò)增：引物533R（5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3）引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）533R：Roche454“A”焦磷酸序列適配物，唯一的10個(gè)堿基對(duì)序列27F：Roche454“B”反應(yīng)體系（50l）：10l5PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus），0.2mMdNTP，0.4M的每個(gè)正向和反向引物，2.0UTaKaRaPrimeSTARHSDNA聚合酶，100200ngDNA模板循環(huán)條件：95C初始變性5min，94C進(jìn)行24個(gè)變性周期30s，55C退火30s，72C擴(kuò)展30s，72C擴(kuò)展5minPCR產(chǎn)物：2%瓊脂糖凝膠檢查，DNA凝膠提取試劑盒提純,焦磷酸測(cè)序,擴(kuò)增子庫：三個(gè)獨(dú)立PCR產(chǎn)物的混合物目的：使?jié)撛诘膱?chǎng)PCR誤差最小化不同污泥樣本的擴(kuò)增子混合目的：實(shí)現(xiàn)同等質(zhì)量濃度合并后的樣本被送到上海的Majorbio公司進(jìn)行基于Roche454FLX鈦平臺(tái)的焦磷酸測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)已經(jīng)存入NCBIshort-reads歸檔數(shù)據(jù)庫(加入數(shù)字：SRX450095）,序列分析,獲得的序列數(shù)據(jù)使用Mothur1.30然后454SOP進(jìn)行處理在進(jìn)一步分析中排除：不包含精確匹配到引物的序列，含有任何模棱兩可的讀數(shù)和/或者擁有平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)少于27且少于200個(gè)核苷酸(除了引物/堿基對(duì)序列區(qū)域)的序列how?兩兩母體的距離用Mothur計(jì)算，在3%的距離使用更進(jìn)一步的臨界方法，獲得的數(shù)據(jù)集中到OTUs序列被隨意二次抽樣,所獲得的序列的最小值進(jìn)行alpha和beta多樣性分析,數(shù)據(jù)分析,二次抽樣的序列被用來分析alpha的多樣性，包括使用Mothur中的summary.single指令進(jìn)行Chao1和Goods的覆蓋率估計(jì)NMDS分析使用Rvegan（版本：2.15.0）來研究細(xì)菌群落組成的相似性。0.2的應(yīng)力水平對(duì)于NMDS情景是可以被接受的。相似性分析被用來檢測(cè)不同群落的細(xì)菌群落組成的差異性（如西北和東部群落），相似度分析用來識(shí)別OTUs，OTUs指定西北或者東部樣本。Mantel測(cè)試采用在R2.15.0環(huán)境下的vegan并通過999個(gè)排列數(shù)字實(shí)施：研究細(xì)菌群落組成的差異性和樣本所處地理距離之間存在的聯(lián)系Heatmap通過Rgplots執(zhí)行：比較在每個(gè)樣本中最充沛的屬的細(xì)菌群落,網(wǎng)路分析,建立一個(gè)相關(guān)母體：通過計(jì)算細(xì)菌屬間所有可能的成對(duì)秩的等級(jí)相關(guān)來設(shè)想網(wǎng)路界面的相關(guān)性只考慮那些發(fā)生在所有樣本中關(guān)系比例總共超過1%的至少3個(gè)樣本的屬充分同時(shí)發(fā)生的事件：秩的相關(guān)系數(shù)不僅0.6（或者-0.6），而且統(tǒng)計(jì)上顯著的（P0.05）穩(wěn)定的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)分析使用RHmisc。在描述從充分屬的成對(duì)比較中識(shí)別的穩(wěn)定相關(guān)性的相關(guān)網(wǎng)路中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示一種屬，每一條線表示一種強(qiáng)烈和顯著的相關(guān)性在觀察網(wǎng)路之后使用Gephi進(jìn)行計(jì)算,圖表分析1,1、各樣品的覆蓋率為90以上，表明足夠測(cè)序深度,圖表分析2,每個(gè)活性污泥的細(xì)菌群落分配在分類單元為門的分類結(jié)果,圖表分析3,每個(gè)樣品中的前10豐富屬被選定（所有的10個(gè)樣品共37個(gè)屬），與其他樣品中它們的豐富度使用熱圖分析進(jìn)行比較。有三個(gè)屬至少在7個(gè)樣品中都是大量的（1%），包括Haliscomenobacter、暖繩菌屬、TM7_genus_IS，在37個(gè)豐富屬中，發(fā)現(xiàn)了如Iamia、Ilumatobacter、分枝桿菌等好氧菌。同時(shí)，大量的厭氧菌諸如Ignavibacterium，Anaerolinea和Caldilinea也被發(fā)現(xiàn)。一些屬，包括GP4、GP6和OD1_genus_IS，沒有得到很好的觀察，并且不能明確地分為需氧或厭氧細(xì)菌。,分析圖表4,細(xì)菌群落組合物與采樣的地理位置密切相關(guān)ANOSIM：確定在不同的地理位置收集的樣品細(xì)菌群落組成是否存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如東部和西北部（R=1，P0.4說明網(wǎng)路具有模塊化,顯著和穩(wěn)定的內(nèi)部正相關(guān)和門的相互聯(lián)系。酸桿菌門的成員（屬Gp3，Gp4，Gp6，Gp7,Gp16，Gp17）,共現(xiàn)頻率為2.94，比隨機(jī)聯(lián)系下預(yù)測(cè)的更高,正如從觀察到的共生事件和理論隨意性共生事件計(jì)算的一樣。正相關(guān)由圖4a中橙色厚邊緣直觀地顯示。此外,對(duì)于門的相關(guān)性，-變形菌的成員往往與放線菌和壁厚菌門的成員共現(xiàn)。圖4b演示了一些細(xì)菌屬之間的負(fù)相關(guān)。一個(gè)獨(dú)立門的負(fù)相關(guān)在桿菌門的Haliscomenobacter和Ferruginibacter之中被發(fā)現(xiàn),結(jié)論,從中國西北和東部收集的活性污泥樣本中的細(xì)菌群落組成顯然不同核心屬與活性污泥的地理位置及處理方法無關(guān)網(wǎng)路分析：從61細(xì)菌屬鑒定，總共165對(duì)顯著和穩(wěn)定的相關(guān)性（正相關(guān)和負(fù)相關(guān)），2個(gè)網(wǎng)路化模塊具有模塊化結(jié)構(gòu),THANKS,無錫,蘭州,馬鞍山,蘇州,石家莊,烏魯木齊,合肥,南京,*process,測(cè)序從反向引物（533R）開始，原序列的反向互補(bǔ)序列被轉(zhuǎn)換。剩下的序列用Mothur采用NAST（接近調(diào)整空間終端）算法與細(xì)菌SILVA16SrRNA基因模型進(jìn)行比對(duì)，因?yàn)檫@個(gè)模型已經(jīng)提供變化區(qū)域的質(zhì)量比對(duì)。Mothur中“pre.cluster”指令被用來消除那些有可能由于焦磷酸測(cè)序引起誤差的序列。PCR嵌合體使用chimera.uchime指令實(shí)現(xiàn)用默認(rèn)參數(shù)的Mothur軟件進(jìn)行檢查和消除。剩下的序列被送到網(wǎng)上工具RDP分類，來獲得分類信息