感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化ppt課件.ppt

感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化,1,導入大腸桿菌:氯化鈣轉(zhuǎn)化法electroporation電擊法又叫電穿孔法體外包裝感染法重組DNA導入哺乳動物細胞:DNA-磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導法、原生質(zhì)體融合法酵母菌轉(zhuǎn)化法:完整細胞轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法電擊法,2,大腸桿菌(Escherichiacoli),大腸桿菌(Escherichiacoli)大約含3000kb的環(huán)狀染色體DNA的棒狀細菌。革蘭氏陰性、兼性厭氧。最適生長溫度37，PH7.07.6(一般7.4)，保存加甘油，培養(yǎng)皿密封。大腸桿菌的生長曲線可分為遲緩期(生長滯后期)、對數(shù)生長期(2030min)、穩(wěn)定期(飽和期)，約11092108/mL和衰老期。,3,4,大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4可保存幾個月，而有些菌株在相同條件下只能保存幾天。如在相同條件下，大腸桿菌K12株比大腸桿菌X1776株保存期長。所以菌株首先應劃平板分離單個菌落，經(jīng)擴增后再做抗藥性等鑒定，然后應用或保存。保存一般用對數(shù)生長后期的細菌。根據(jù)不同需要做短期、中期或長期保存。,2.菌株的保存,5,LB瓊脂平板劃線，37，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr)，形成單一菌落后，用石臘紙(parafilm)將平皿四周封嚴(使平皿隔絕空氣)，倒置放入4或-20冰箱中，可保存數(shù)周。E.coli菌株的生存期差別大：有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4能存活幾個月。有些菌株只能活幾天。穿刺瓊脂(stabagar)，室溫，避光可保存數(shù)年。冰凍：單一菌落，液體培養(yǎng)基中擴增后，稀釋后倒入10-50%甘油培養(yǎng)基中，分裝，置-20-70。可經(jīng)過30次凍融，細菌仍然存活。菌LB中過液培養(yǎng)，加入等體積2冰凍培養(yǎng)基。液氮速凍后置-70，可經(jīng)15次凍融，保存5年以上。,具體保存方法：,6,菌株保存液的配制,7,高壓滅菌Phagemid-20Enzyme-20Buffers-20Primer-4Thiodeyivatives-20Ribonucleotides-20Helperphage-4置于20或80，并一個月檢查一次,8,抗生素的配制,9,大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存,在基因工程研究過程中，常常需要將外源DNA與載體DNA連接，重組后，導入大腸桿菌受體細胞中，進行DNA復制，擴增或表達，噬菌體單鏈或雙鏈DNA導入大腸桿菌宿主菌中復制擴增。但很久以前人們就試圖將DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌但都沒有成功。因此長期以來人們一直認為大腸桿菌缺乏天然的轉(zhuǎn)化機理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在轉(zhuǎn)化DNA之前，預先用氯化鈣溶液處理大腸桿菌，能夠人為地誘導這些大腸桿菌細胞呈現(xiàn)感受態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。從而提高重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化頻率。目前對這種機制尚不清楚。,10,感受態(tài)細胞(Compenentcells)：將質(zhì)粒DNA或重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到宿主菌中之前，必須使細菌呈感受狀，即有能力攝取DNA的狀態(tài)。(主要介紹用氯化鈣溶液處理大腸桿菌制備感受態(tài)細胞的方法),取出大腸桿菌HB101菌種管劃LB瓊脂平板，-70保存，37過夜(一般16小時)。取一個菌落接種于35mlLB培養(yǎng)管中，37振培養(yǎng)，過夜(816小時)。取出1mL過液菌加入新鮮配制的LB培養(yǎng)液50mL中(2%接種量)。37振蕩培養(yǎng)，24小時。測定光密度值(約5107個細胞/mL)，OD550達0.30.5。注意：不同的大腸桿菌菌株，每mL培養(yǎng)物中細菌存活數(shù)與光密度值間關系不同。HB101，OD600=0.5（約107個細胞/mL）X1776，OD600=0.2（約107個細胞/mL）,11,細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，1015分鐘。細菌移入預冷的離心管中，44000GSA轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上清，留沉淀置于冰浴中。加0.1mol/LCaCl2(預冷)溶液25mL，將沉淀充分懸浮，置冰浴中2030分鐘。延長CaCl2處理時間，可增加感受態(tài)，所以也可在0過夜。4，40002500rpm轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，留沉淀，置冰浴中。用預冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心輕輕懸浮沉淀，4過夜?？芍苯邮褂?。次日加20%(最終濃度)滅菌預冷甘油。分裝成每Eppendorf管200uL。,新鮮感受態(tài)細胞用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化最好。但新鮮感受態(tài)細胞04貯存不超過3天。長期保存，必須將細胞在-70干冰或液氮氣體部分速凍5分鐘，再置于-80冰箱中保存，一般可保存1年。,12,CaCl2處理4，0.1M低滲CaCl2處理使細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，俗稱“打孔”，使DNA分子能夠進入細胞內(nèi)。CaCl2處理使感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進入細胞。在細菌中能發(fā)展為感受態(tài)細胞占極小數(shù)，只有感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定的攝取外來DNA分子。保持感受態(tài)的時間約12天，一般出現(xiàn)在生長對數(shù)期的后期。,兩種假設：,13,5.DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,（1）抗性瓊脂板中抗生素的配制,14,感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80凍存取出后置于冰水中融化。取出分裝到Eppendorf管中，每管100200uL。加入需轉(zhuǎn)化的DNA溶液25ul充分混勻(15ug/mLDNA)。冰水中放置30分鐘。37或42水浴2分鐘。(熱休克)冰浴2min。每管再加入1mLLB培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)1小時。取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或250mLLB則全部鋪板。,（2）轉(zhuǎn)化步驟,15,取100200uL，置于有選擇性標記的瓊脂培養(yǎng)皿上，用無菌玻璃棒涂勻；靜置510分鐘。倒置37培養(yǎng)1218小時(一般過夜)；次日，挑選單菌落，擴增，提取DNA酶切，電泳檢測，篩選重組子。并設下列對照：A不加需轉(zhuǎn)化的DNA溶液（用蒸餾水或LB培養(yǎng)基代替）。B用普通LB瓊脂平板代替有選擇性標記的瓊脂平板。DNA超螺旋轉(zhuǎn)化最好DNA環(huán)狀次之DNA線狀有干擾作用1ugpBR322DNA轉(zhuǎn)化入HB101可得：5106/2107轉(zhuǎn)化子。DNA分子量小比分了量大的轉(zhuǎn)化率高，一般不超過10kb，最高限為15kb。一般1ugDNA可得51071108個轉(zhuǎn)化菌。,16,（3）注意事項,宿主菌取出時應注意菌株名及編號。檢查宿主菌，應無質(zhì)粒污染，無抗菌素抗性。整個操作過程應保持無菌狀態(tài)。LB培養(yǎng)液中不能有抗生素。不同受體菌，培養(yǎng)要求不同。如K802株，OD550=0.5最好，而X1776株，OD550=0.20.3最好。質(zhì)粒的DNA比較小，有助于其轉(zhuǎn)于宿主細胞中的效率。轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒大小成反比。而質(zhì)粒大于15kb時，轉(zhuǎn)化率成為限制因素。同時質(zhì)粒大，復制的拷貝數(shù)低。,17,（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型,超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA。開環(huán)DNA，至少一股DNA上有缺口，一處或多處使DNA鮮旋。線狀DNA瓊脂糖(Agrose)電泳可將這三種構(gòu)型的DNA分開，Agrose電泳中cccDNA位置最前。,18,二、閱讀微生物的基因型符號,在描述一個微生物的品系時，最重要的事就是區(qū)分它的基因型和表現(xiàn)型。基因型說明它的遺傳決定子，這是看不見的特性；而表現(xiàn)型反映的是可觀察到的特性。1由于一個微生物的基因組中有成百個基因。因此，一般而言，在描述一個品系的基因型時只給出它與野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些與野生型相同的基因。也就是說，在它們名稱后面所給出的是這些品系的基因組中發(fā)生了突變的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突變了的，其他基因組仍然正常。在上下文貫通地具體描述微生物的某個基因(如trp)時，可以用trp+，或者只是簡單地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它時都寫作trp+。有些突變型是缺失突變，就用表示，如lon表示lon基因的缺失突變。,19,2有些細菌中有附加體或者其他特殊的傳導噬菌體。最常見的是性因子F。細菌中有F因子的描述為F+；沒有的為F-。有些F因子上面帶有細菌的某些基因，這樣的F因子寫作F，它所帶基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面帶有細菌的lac和proA，B基因。又如，F(xiàn)lacZ，proA+，B+表示F因子上面帶有l(wèi)ac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突變的基因。3校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花繚亂。因為野生型品系雖然不帶有校正基因，它的基因型卻理所當然地應當寫作sup+，表現(xiàn)型則應該寫為Sup-?？墒?，帶有sup基因的突變型品系的基因型必需寫為sup-或者sup，它的表現(xiàn)型是Sup+。也就是說，字面上的概念與實際上的情況正好倒了一個個兒。因此，在閱讀它時要特別小心，以免搞錯。此外，在談到特殊的校正基因時，它的表現(xiàn)型常用數(shù)字來表示，如Sul；但是，它的基因型卻用字母來表示supD。鑒于這種情況，有人建議對校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符號，只標出突變型品系(Su+)的特殊基因座位符號，如supD和supE等。,20,JM83，F(xiàn)-，ara，(lac-proAB)，rpsL，80d，lacZM15是這樣一個品系：不帶F因子，ara基因座突變(因此不能代謝阿拉伯糖)，lac操縱子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖體的S12亞基突變(因此有鏈霉素抗生)，-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有-互補作用。如果將克隆的pUC質(zhì)粒的重組DNA轉(zhuǎn)化入這個細菌，就可以通過藍/白菌斑來篩選出轉(zhuǎn)化子)。野生的大腸桿菌具有大約4700kbp的DNA分子，上面有約2800個基因。當這些基因中有突然變異發(fā)生時，基因產(chǎn)物隨之變化，并且有可能給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化。這種能夠觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型(Phenotype)，而把基因的構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型(Genotype)。,試舉一例來說明上述概念：,21,通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型只有在基因發(fā)生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化時才被表示。但是需要特別的表示時，則在野生的基因型上加“+”，在變異的基因型上加“-”以示區(qū)別。表示方法是用基因產(chǎn)物或其作用的名稱的三個斜體字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因變導致相同的作用結(jié)果，則加上一個大寫字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某個基因或者是某領域缺失時，在基因型前向加上“”表示，如“從lac到proAB基因缺失時表示為(lac-proAB)。野生的大腸桿菌本來還有具有F因子等的質(zhì)粒DNA，并且感染噬菌體。把被野生的大腸桿菌感染的噬菌體特稱為原噬菌體(Prophage)，例如e14。一般當這些質(zhì)?；蛟删w缺失或變異時也用“()”或“/”等加以區(qū)別表示。,22,表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個字母大寫)。一般通過變異而獲得了能夠觀察到的抗藥性或者活性表達等特征時，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地當成為藥物敏感性或者活性喪失時，用“-”表示(Ampicillin敏感性：Amp-)。基因型表現(xiàn)容易混淆，使用時注意。*基因工程中經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于K-12菌株，最近也常使用由B株及C株來源的大腸桿菌。*大腸桿菌B株原來就為lon-，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因(Ambersuppressorfree)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。,23,supE(suppressor)抑制基因supE變異時，即使存在終止密碼UAG，此處也會插入谷氨酰胺(Glutamine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。supF(suppressor)抑制基因supF變異時，即使存在終止密碼子UAG，此處也會插入酪氨酸(Tyrosine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。,停止密碼回復,24,recA(recombination)重組相同的DNA重組活性缺失由于導入DNA與宿主DNA的重組受到阻害，可以保持插入DNA的穩(wěn)定性。與recA13宿主菌相比，recA1宿主菌能夠使插入DNA穩(wěn)定存在。recB，C(recombination)重組內(nèi)切核酸酶V變異。抑制重組并能影響放射線損傷的修復。traD(transmissibility)遺傳穩(wěn)定性在質(zhì)粒F因子內(nèi)部，與大腸桿菌的結(jié)合有關。TraD變異后，F(xiàn)因子自身的傳遞能力顯著下降。,重組機能缺失,25,dam(DNAadeninemethylase)DNA腺嘌呤甲基化酶宿主菌來源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失dcm(DNAcytsinemethylase)DNA胞嘧啶甲基化酶宿主菌來源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失hsdR(hostspecificitydefective)宿主特異性缺陷宿主菌來源的I型限制酶Ecok(或EcoB)的切斷部位蛋白變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EcoK切斷，可以進行克隆hsdM(hostspecificitydefective)宿主菌來源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的甲基化酶部位蛋白變異hsdS（hostspecificitydefective）宿主菌來源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的識別部位蛋白變變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EocK切斷，可以進行克隆,對插入DNA具有直接作用因子的缺失,26,endA(endonuclease)內(nèi)切核酸酶宿主菌來源的非特異性內(nèi)切核酸酶I活性缺失，可以提高純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。NcrA(methylcytsinerestriction)mCG序列的甲基化活性缺失。mcrB，C(methylcytsinerestriction)GmC序列的甲基化活性缺失。mrr(methylationrequiringrestricion)mA以及mC序列的甲基化活性缺失。,27,rpsL(ribosomalproteinsmallsubunit)由30S核糖體蛋白變異而獲得鏈霉素(Steptomycine)抗性(Strr)。gyrA(gyrase)由DNA回旋酶亞基A的變異而獲得的萘啶酮酸(Nalidxicacid)抗性(Nalr)。Tn5(transposon)轉(zhuǎn)座子變異，獲得卡那霉素(Kanamycine)抗性(Kmr)。Tn10(transposon)轉(zhuǎn)座子變異，獲得四環(huán)素（Tetracycline）抗性（Tetr）。,抗藥性的變異,28,lon(longform)分解異型蛋白質(zhì)的ATP依賴型蛋白分解酶活性缺失。大腸桿菌B株原來就為lon-?？梢种破浔磉_的融合蛋白質(zhì)的分解。omp(outermembraneprotein)外膜蛋白