LAMP技術(shù)ppt課件

LAMP技術(shù),1,1LAMP引物的設(shè)計LAMP引物的設(shè)計主要是針對靶基因的六個不同的區(qū)域，基于靶基因3端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5端的Bl、B2和B3區(qū)等6個不同的位點設(shè)計4種引物。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3端的F2c區(qū)域互補F1C區(qū)與靶基因5端的Flc區(qū)域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補。BIP引物：下游內(nèi)部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3端的B2c區(qū)域互補，B1C域與靶基因5端的Blc區(qū)域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補。,2,2擴增原理6065是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。擴增分兩個階段。第1階段為起始階段，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合（如圖B所示），在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈（如圖C所示）。FIP上的F1c與此單鏈上的Fl為互補結(jié)構(gòu)。自我堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如圖C所示）。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3末端的Fl區(qū)段為起點以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第2階段是擴增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3末端的B1區(qū)段為起點，以自身為模板。進行DNA合成延伸及鏈置換形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動新一輪擴增。且產(chǎn)物DNA長度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動鏈置換合成，周而復(fù)始。擴增的最后產(chǎn)物是具有不同個數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物。且產(chǎn)物DNA為擴增靶序列的交替反向重復(fù)序列。,3,3LAMP的特點LAMP與以往的核酸擴增方法相比具有如下優(yōu)點：(1)操作簡單，LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，對于中小醫(yī)院只需要水浴鍋即可，產(chǎn)物檢測用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度即可判斷。對于RNA的擴增只需要在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶就可同步進行(RTLAMP)，不需要特殊的試劑及儀器。(2)快速高效，因為不需要預(yù)先的雙鏈DNA熱變性避免了溫度循環(huán)而造成的時間損失核酸擴增在lh內(nèi)均可完成，添加環(huán)狀引物后時間可以節(jié)省12，多數(shù)情況在20。30rain均可檢測到擴增產(chǎn)物。且產(chǎn)物可以擴增至109倍，達0.5mgmL應(yīng)用專門的濁度儀可以達到實時定量檢測。(3)高特異性，由于是針對靶序列6個區(qū)域設(shè)計的4種特異性引物。6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增。故其特異性極高。(4)高靈敏度，對于病毒擴增模板可達幾個拷貝，比PCR高出數(shù)量級的差異。,4,缺點：由于LAMP擴增是鏈置換合成，靶序列長度最好在300bp以內(nèi)。500bp則較難擴增。故不能進行長鏈DNA的擴增。由于靈敏度高。極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作，以及在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統(tǒng)的PCR方法。,5,4引物設(shè)計實例LAMP引物設(shè)計的在線網(wǎng)站(http:/primerexplorer.jp/e/)，只要導(dǎo)入靶基因就能自動生成成組引物。以某一微生物的鞭毛基因為例講解一下LAMP相物設(shè)計的過程：首先，單擊瀏覽按鈕選擇靶基因序列文件，靶序列默認(rèn)的是小于22kbp。支持三個類型的文件，普通文本格式（僅含序列）,FASTA格式和GenBank格式文件。第二，從下面三個選項中選擇定參數(shù)設(shè)定（引物設(shè)計條件）條件。基于GC含量的自動判斷,起始的參數(shù)是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，則選取AT豐度高的區(qū),如果GC含量高于60%，則選取GC豐度高的區(qū),其它情況是標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定狀態(tài)。設(shè)計合適的引物是進行LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵，通過考慮堿基組成，GC含量，二級結(jié)構(gòu)的形成，Tm值等因素可以通過PimerExplore)(一種專門設(shè)計LAMP引物的軟件)來設(shè)計LAMP反應(yīng)的引物。,6,在進行LAMEP引物設(shè)計的時候有以下幾個關(guān)鍵點需要考慮：1.引物之間的距離F2區(qū)段的5端到B2區(qū)段的5端(LAMP反應(yīng)擴增的區(qū)域)之間的距離建議是120180bp。F3區(qū)段的3端到F2區(qū)段的5端之間的距離是020bp(同理B2和B3之間的距離是020bp)。F2區(qū)段的5端到F1區(qū)段的5f端(形成環(huán)的部分)之間的距離是4060bp。2.引物的Trn值引物的Tm值采用近鄰分析法(thenearest-neighbormethod)來計算，這種方法是目前認(rèn)為計算值最接近真實值的一種方法。計算Tm值的時候會受到鹽濃度(saltconcentration),寡核苷酸的濃度等實驗條件的影響，所以最好是在確定的實驗條件下來計算Tm值。,7,例如：寡核苷酸的濃度為0.1mol，鈉離子的濃度是50mM,鎂離子的濃度4mM等。Tm(退火溫度=h*1000/S+Rln(C/4)-273.15+16.6logNa+式中，Tm為退火溫度，；為摩爾氣體常數(shù)，1.987ca1/rnol；H為焓變；s為熵變；C為寡聚核苷酸的濃度；Na+為鈉離子濃度。對于GC含量正常或是GC含量富集的引物Tm值為6065，而對于AT富集的引物Tm值為5560。在設(shè)計引物的時候，F(xiàn)1c和B1c的Tm值大概是65(6466),F2,B2,B31的Tm值大概是60(5961)。3.引物末端的穩(wěn)定性引物的末端作為DNA合成的起點必須有一定的穩(wěn)定性，自由能改變值(G)是指反應(yīng)物的自由能與產(chǎn)物的自由能之差，反應(yīng)朝著自由能減小的方向運行口引物和目的基因之間的退火反應(yīng)是一個動態(tài)平衡的反應(yīng)，自由能改變值(G)越小，引物與模板之間的退火反應(yīng)越容易發(fā)生。一般在進行引物設(shè)計的時候，F(xiàn)2/B2F3/B3的3端和F1c/B1c的5端的自由能改變值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5端擴增以后相當(dāng)于F1的3端，所以它的穩(wěn)定性很重要。4GC含量引物在設(shè)計的時候使其GC含量介于40%65%之間，但是當(dāng)引物的GC含量介于50%60%時，引物的質(zhì)量相對好一些。5.二級結(jié)構(gòu)引物在設(shè)計的時候要防止形成二級結(jié)構(gòu)，這一點是十分重要的，特別是內(nèi)引物。,8,第二代DNA測序技術(shù),9,Sanger雙脫氧鏈終止法,Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。,10,利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進行檢測。DNA的復(fù)制需要：DNA聚合酶，雙鏈DNA模板，帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脫氧核糖的3位置缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為-32P標(biāo)記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5-引物端和以ddC殘基為3端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來。類似