胰酶消化貼壁細(xì)胞ppt課件

.,貼壁細(xì)胞的消化處理及注意事項(xiàng),.,貼壁細(xì)胞:在體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支持物表面才能生長的細(xì)胞。如CHO細(xì)胞。消化：使經(jīng)過分散的組織或貼壁的培養(yǎng)物相互或與介質(zhì)解離，形成單細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)的操作。,.,貼壁細(xì)胞的消化,貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長成致密單層后，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，擴(kuò)增、傳代。貼壁較緊的細(xì)胞如Hela，HepG2，CHO等，則需要以細(xì)胞消化液消化后，才能脫落和分散，擴(kuò)瓶。常用的消化液為胰蛋白酶，EDTA等,.,主要消化方式,一、酶消化法(胰酶Trypsin)二、離子螯合劑(EDTA),.,一、酶消化法(胰酶Trypsin),1)胰酶消化原理:胰酶是一種蛋白酶。通過在特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞膜上和培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，使兩者分離。這時(shí)細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。細(xì)胞消化用胰蛋白酶常用的工作濃度為0.25，pH為7.2-7.4之間。,.,2)酶消化法操作過程：（以下操作均必須嚴(yán)格按無菌操作的要求進(jìn)行）,將長成致密單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原來的培養(yǎng)液棄去；加入0.25胰酶溶液，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多（依培養(yǎng)器皿的大小而定），以使充分浸潤；,.,一般消化時(shí)間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶底由半透明（細(xì)胞單層連接成片）轉(zhuǎn)為點(diǎn)狀透明（出現(xiàn)細(xì)小空隙）時(shí)，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。,.,圖示：,CHO貼壁細(xì)胞,.,經(jīng)過48小時(shí)培養(yǎng)成為致密單層,.,加入0.25%胰酶后細(xì)胞逐漸皺縮變圓，細(xì)胞間隙增大不再致密,.,細(xì)胞明顯皺縮變小，細(xì)胞間隙增大不再致密，部分細(xì)胞維持正常形態(tài)，部分細(xì)胞皺縮變圓。,.,細(xì)胞基本皺縮變圓此時(shí)細(xì)胞吹打可下,.,細(xì)胞完全皺縮變圓此時(shí)應(yīng)棄去胰酶，加入培養(yǎng)基后輕搖可將細(xì)胞從細(xì)胞瓶壁上洗下，將細(xì)胞懸液用吸管吹散后傳代,.,有經(jīng)驗(yàn)后，可肉眼對(duì)光觀察貼壁半透明的細(xì)胞層，判斷消化程度。如消化過頭，會(huì)見到許多細(xì)胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失,甚至造成細(xì)胞破碎。也可以在倒數(shù)第二、三步時(shí)棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續(xù)作用至最后一步的消化程度，這樣略有點(diǎn)過也影響不大,.,注意事項(xiàng),1在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。2.在使用胰酶細(xì)胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細(xì)菌污染。,.,3.胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時(shí)間不宜過長，否則細(xì)胞鋪板后生長狀況會(huì)較差。消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。4.在37時(shí),胰酶活性最強(qiáng)。,.,5.溶液中的Ca2+、Mg2+和血清中的非特異性胰蛋白酶抑制劑會(huì)降低胰酶活力消化過頭，所以加入有血清培養(yǎng)基可以終止反應(yīng),.,常見問題:用胰蛋白酶消化后，細(xì)胞還是成團(tuán)，原因可能是什么？,消化時(shí)間不夠；吹打力度不夠；胰酶消化液濃度不夠；胰酶本身問題；細(xì)胞密度過高;,.,二、離子螯合劑：（EDTA）,1)EDTA消化原理:EDTA是一種螯合劑，因?yàn)榧?xì)胞表面很多和培養(yǎng)皿結(jié)合的蛋白都帶有Ca2+,或者M(jìn)g2+，而EDTA就是螯合Ca2+,或者M(jìn)g2+的，從而加速細(xì)胞和培養(yǎng)皿的脫離。,.,2)EDTA消化液使用注意事項(xiàng),1.常用濃度在0.02%左右。2.在弱堿性條件下才易溶,配制時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度。3.EDTA能顯著影響PH值,且不會(huì)被終和,所以消化下來的細(xì)胞要拿PBS洗一遍,.,適用范圍,因?yàn)镋DTA不破壞細(xì)胞表面分子，僅與Ca2+,Mg2+螯合。所以適用于需檢測細(xì)胞表面分子的細(xì)胞消化。,.,細(xì)胞的保存,.,細(xì)胞凍存:細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196液氮中低溫保存，使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞復(fù)蘇：將凍存的細(xì)胞解凍，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)。,.,要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解以下幾個(gè)問題：冷凍速率復(fù)溫速率冷凍保護(hù)劑冷凍保存溫度,.,1、冷凍速率冷凍速率是指降溫的速度，是活細(xì)胞能否被冷凍到一個(gè)能永久保存的溫度的一個(gè)主要因素。冷凍速率太快或太慢都會(huì)造成細(xì)胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。,.,2、復(fù)溫速率復(fù)溫速率是指細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)溫度升高的速度。冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，復(fù)溫速率不當(dāng)也會(huì)降低冷凍存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好，37水浴中，12分鐘內(nèi)要完成復(fù)溫。,.,3、冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常被加到一定的溶液中進(jìn)行配制，作為冷凍保護(hù)液。常用的冷凍保護(hù)劑：,.,4、冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指能長久保存細(xì)胞的一個(gè)深低溫度。在這樣的溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢或停止，但經(jīng)長期保存和復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（196）是目前最佳冷凍保存溫度,.,：是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。的濃度必須=10%,大于這個(gè)濃度即使在低溫對(duì)細(xì)胞也有毒性作用。有些細(xì)胞不能用DMSO，可用甘油。,.,細(xì)胞凍存程序,1細(xì)胞凍存前24-48小時(shí)傳代培養(yǎng)，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期2經(jīng)胰酶消化后，加入適量培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液3加入新生牛血清4加入經(jīng)過除菌過濾的5混勻,.,6將懸液加入滅菌凍管中，1-2ml/支，嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱7置4度冰箱中，30分鐘后轉(zhuǎn)入-20度冰箱中，30分鐘后轉(zhuǎn)入液氮口，小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中保存8.復(fù)蘇一支細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力及有無污染,.,細(xì)胞復(fù)蘇程序,取出貯存細(xì)胞，37水浴中快速融化直接用完全生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用1020ml完全生長培養(yǎng)基.24小時(shí)細(xì)胞貼