畢設(shè)論文-10101044-晏洋翻譯3-晏洋-10101044

1、 在兔耳窗中剪應力對傷口愈合時血管生成的影響最近的研究表明，壁面剪應力的在血管系統(tǒng)的生理性適應上發(fā)揮著顯著的作 用。本研究針通過探索組織修復過程體內(nèi)微血管形態(tài)和血流動力學變化的發(fā)展來 探索持續(xù)壁面剪應力對傷口愈合的血管生成的影響。在移植入兔耳窗后，從第 0 天到第 23 天讓兔子口服A1 受體阻滯劑哌唑嗪（50mg/ L 的水溶液）用來增加血 管周邊的血流量。用顯微鏡檢查法記錄從第 7 天到第 23 天耳窗內(nèi)的微血管 情況。利用計算機圖像分析系統(tǒng)對耳窗內(nèi)被血管化組織覆蓋的相對面積（） 、 向內(nèi)生長的速率（ mm2/day ）、血管總面積（mm2）以及靜脈中（直徑 20-40 毫米）壁面剪應力水

2、平（ dyne/cm2 ）進行定量分析。從第 7 天到第 19 天用哌唑嗪處理過的動物的相對面積顯著增加。處理組耳窗內(nèi)被血管化組織完全覆蓋的 時間早于對照組。處理組最后血管的總面積增加了 21。處理組剪切應力的時 間過程表現(xiàn)為最初很高（ 相對對照組增加 1.44 倍），隨后逐漸降低而趨向于對 照組水平。這些結(jié)果表明傷口愈合的血管生成可能部分涉及微血管對剪應力自適 應的響應。 簡介血管生成涉及到許多正常生理和病理條件，包括傷口愈合、組織移植、胚胎 形生、炎癥、類風濕關(guān)節(jié)炎和腫瘤形成1。令外科醫(yī)生特別感興趣的是血管生 成是傷口愈合最重要的方面。正常新血管形成對不暴露的的傷口愈合和組織再生 是非常必

3、要的2。因此，血管生成過程往往成為對受損的傷口或組織移植治療 過程中的目標。 某些治療手段是基于加速血液流動能提高愈合能力的共同信念 2-4 。因 為在傷口愈合的血管生成過程中，血流量一直被認為是必不可少的。然而，如何 血流量影響血管新生的過程的生理機制并不被人們所了解。有兩種可能的機制事 可信的：（1）通過增加血流量來提高血管活性物質(zhì)的輸送而促進血管增生；（2） 通過機械傳導，血液在血管內(nèi)皮表面流動而產(chǎn)生的機械力調(diào)節(jié)血管形成。顯然各 種綜合因素在組織修復的血管重塑過程中也很重要。近些年對包括氧、血管生成 細胞因子和血管生成的生長因子在內(nèi)的血管活性物質(zhì)進行了很好地研究。與此相 前由于技術(shù)問題對

4、關(guān)于機械因素在的作用相知甚少。這項研究評估了 機械力在傷口愈合血管生成過程中對微血管重塑的作用。 圖 1 完成兔耳窗的組裝。這個窗子是由一個有著一個中央圓板和三個周邊柱腳的圓盤、一塊蓋板和一個夾環(huán)。一個 10 10 的網(wǎng)格（網(wǎng)格保持不變?yōu)?500 毫米）被疊加在蓋板上。 你 Thoma 最早記錄了流動誘導應力對血管生長的作用 5，許多研究已經(jīng) 證明，脈管系統(tǒng)的功能的形態(tài)是由血流動力學壓力調(diào)控的。在這些流變因素中， 壁面剪應力被認為在對血管系統(tǒng)的生理性適應上發(fā)揮了顯著的作用。當血液在血 管內(nèi)皮壁上流動時，壁面剪應力是剪切血管管腔表面而產(chǎn)生的一種流變的力。一 些研究 6,7 表明在有持續(xù)的流動載荷

5、的情況下，壁面切應力誘導大血管 直徑適應這些力學環(huán)境的變化。它作為一種負反饋在維持壓力恒定在其生理水平 左右。最近對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的研究也發(fā)現(xiàn)，通過施加流體剪應力可以改變 各種細胞的功能和形態(tài)，和基因表達的改變有關(guān)系 8-11 。因此，壁面剪應力 被認為是調(diào)節(jié)血管生長的關(guān)鍵因素之一。 血管生成過程也可能會受到剪應力的影響。在骨骼肌微循環(huán)的研究中已經(jīng)證 明增加流速可誘導血管生成 12-14 ，但并沒有闡明內(nèi)剪應力在血管生成 中的作用。至為了研究剪應力對血管生成的影響，我們觀察了傷口愈合過程中血 管生長的變化時間過程中和剪應力水平。通過給移植好耳窗的兔子飲用 A1-腎上 腺素能受體阻滯劑哌唑嗪

6、來刺激誘發(fā)剪切應力。而兔耳窗為觀察和量化傷口愈合 血管生成提供了一個很好的手段。 材料和方法兔耳窗的植入這個窗口由一個圓盤（有一個中央圓板和三個周邊柱腳）、一塊蓋板、和一 個夾環(huán)。它和使用在顯微鏡法觀察微循環(huán)的窗子是一樣的15 。在蓋板上 疊加一塊網(wǎng)格，把中央部分成 100 小格（每邊長 500 毫米），用來準確定量記錄 微血管（圖 1）。十四只體重為3.2-3.5 公斤的雄性日本白兔在用40 毫克/公斤肌肉注 射達到全身麻醉和 8 利多卡因噴霧局部麻醉后分別植入耳窗。耳朵遠端部分 用一個專門設(shè)計的打孔器穿過軟骨和皮膚打出四個孔?？椎某叽绾臀恢靡云ヅ鋱A 盤和周邊柱腳為基準。小心地收縮圍繞在中心

7、孔附近的耳朵兩側(cè)表皮是保證留下 的皮下血管完好無損。把圓盤的三個外圍柱腳插入到耳朵靠中心外的小孔來定位 窗子，同時中心圓板蓋住中心大孔。通過夾環(huán)將蓋板固定在柱腳上。通過設(shè)計圓 盤，在中心圓板和蓋板之間留下厚度為 50 微米、直徑為 6 毫米的間隙。此空間 形成的空腔可以讓從角質(zhì)層血管處新生的微血管在此生長，同時腔內(nèi)充滿生理鹽 水。把動物飼養(yǎng)在一間溫控室內(nèi)，并用商業(yè)的兔飼料飼養(yǎng)。 哌唑嗪處理從第 0 天（手術(shù)后）到第 23 天給六只兔子提供哌唑嗪鹽酸鹽溶液（輝瑞公 司生產(chǎn),50 毫克/升）供其自由飲用。 同一時間內(nèi)給 8 只兔子（對照組）提供蒸 餾水。等離子藥物的濃度是通過兔血液樣品的熒光光譜法

8、測定。 顯微鏡檢查術(shù)后從第 7 天到第 23 天，每 2 天用一個耦合到 CCD 彩色攝像機（Snoy DXC- 107 A）的立體聲變焦顯微鏡（Olympus SZH 10）來觀察耳窗內(nèi)微血管。耳窗內(nèi) 組織的透照是在一個 150 瓦的鹵素投影燈（飛利浦）協(xié)助下完成的。這樣的投影 燈允許攝影的快門速度達到 1/10 000 秒。必須要有如此高的快門速度，這樣紅 血細胞速度可以通過使用雙窗口法來測量。因為這種方法需要運動的紅細胞和周 圍的等離子體之間具有良好的對比度。時間和顯微圖像通過錄像機（索尼 SLVFX5 ）記錄，而幀計數(shù)（用于視頻定時器）用來做進一步的分析。因為兔子 被固定在一個動物容器

9、內(nèi)，所以所有的兔耳窗觀察都是在未麻醉的情況下進行的。 傷口愈合時血管生成的測量在一臺個人電腦（Apple Macintosh Quadra系統(tǒng)來定量測量 840 AV）采用計算機圖像分析愈合的肉芽組織生長速率。用視頻顯微鏡系統(tǒng)記錄下每個小格內(nèi)微血管和 組織的圖像。錄制的視頻圖像用圖形軟件（ AdobePhotoshop ，Ver.2.5 ） 顯示。在錄制的視頻中，血管的向內(nèi)生長主要出現(xiàn)在明確定義的“血管前方”的血 管芽處（圖 2） 。追蹤“血管前方”的前緣，同時由視頻圖像作出關(guān)于被血管 化組織占領(lǐng)的周邊區(qū)域的圖形函數(shù)。通過圖像分析軟件的測量函數(shù)（Image 1.44 ， 美國國立衛(wèi)生研究院）由

10、圖像平均灰度值計算被血管化肉芽組織覆蓋的傷口窗的 相對面積。結(jié)果表示為修復組織占傷口窗的百分比形式。血管向內(nèi)生長速度（平 方毫米/天）還可以從相對面積的曲線的斜率來計算。 測定總血管床的投影面積來定量分析的微血管系統(tǒng)的數(shù)量。第 23 天的時候 整個窗子內(nèi)的微循環(huán)圖像被數(shù)字化。這時窗室完全被微血管所覆蓋（圖 3A） 。 通過參照很容易在毛細管中檢測到的移動細胞對該血管區(qū)域進行準確跟蹤（圖 3B）。他們的存在是在換錄像機磁帶的時候確定流動的毛細血管。從追蹤到的圖 像中減去原始圖像（圖 3C） 。通過一個LUT（查找表）來確定二進制閾值電平進而轉(zhuǎn)換軟件的閾值函數(shù)。圖像的閾值轉(zhuǎn)換產(chǎn)生二值圖像，即在黑色

11、背景中顯示 白色血管（圖 3D）。白（血管）的灰度級值（ I）為 255 和黑色（背景）的灰度 值為 0 。耳窗內(nèi)血管覆蓋的總面積（A 平方毫米）通過轉(zhuǎn)換得到的二進制圖像 的平均灰度值（GL）由公式 A=28.3GL/255計算得到。這里 28.3（mm2）是觀察到的整個窗口面積（直徑 6mm）。 圖 2虛線標記“血管前方”，即血管化的肉芽組織和死角之間的邊界。 圖 3用于分析微血管的圖像處理過程。（A）一個耳窗的原始數(shù)字化圖像（B）血管區(qū)域被涂成白色（C） 經(jīng)過涂抹的圖像已經(jīng)從被跟蹤的圖像中減去（D）最終的二值圖像。 壁面剪應力的測量在第 9 、13 和 21 天分別測量血流速度和各個小靜脈

12、的直徑來計算在血管壁 剪切應力的大小。直徑為 20-40 毫米的小靜脈被選為測量的對象。由光度圖像處 理和測量系統(tǒng)（ C5003 Hamamatsu Photonics）通過雙窗口法 16 來測量紅細 胞在個小靜脈內(nèi)的速率。這個方法是通過離線交叉相關(guān)技術(shù)測得紅血細胞在向上 流動和向動位置的過渡期（圖 4） 。用圖像分析軟件測定血管直徑。各個 血管的剪切應力（t）是通過血流速度（v）和血管半徑（r）所計算的而來的， 即公式 t =4f/r3= 4v/r這里 f 血流，是血液粘度。血液粘度根據(jù)報道的數(shù)據(jù)（=310-2 達因.秒/ 平方厘米）17。在所有小靜脈內(nèi)測量出的剪應力的平均值被作為術(shù)后每天的

13、代 表值。哌唑嗪對血管內(nèi)皮細胞生長的的影響用兩種不同的濃度的哌唑嗪在細胞培養(yǎng)物中生長的內(nèi)皮細胞。臍靜脈內(nèi)皮細 胞與被膠原酶處理的人被隔臍靜脈分開。細胞培養(yǎng)在含有 15胎牛血清、 100毫克 / 毫升的內(nèi)皮細胞生長補充劑、 50 毫克/毫升的肝素、2mM 谷氨酰胺以及 100 U / ml 的青霉素和 100 毫克/毫升鏈霉素的 199 培養(yǎng)基上。內(nèi)皮細胞以 1104 細胞/平方厘米的濃度接種在 24 孔培養(yǎng)皿（ 2.0 平方厘米/孔）上同時加入哌唑 嗪培養(yǎng)基（ 15 和 150 納克/毫升），并在控制范圍內(nèi)培養(yǎng)和。用熒光光譜法測定 口服給藥后的兔子血液樣品血漿藥物濃度，再根據(jù)血漿藥物濃度確定哌

14、唑嗪的濃 度。用庫爾特計數(shù)器在播種后第 1 、3 、5、 7 天對細胞進行計數(shù)，并表示為細 胞密度（細胞/孔） 。統(tǒng)計方差分析（ANOVA）分析是用來確定組內(nèi)或者組間的統(tǒng)計學顯著差異性。 5 的差異被認為是顯著。數(shù)值的表示形式是平均值SEM結(jié)果兩組中的兔子每天喝 200 毫升左右的溶液。哌唑嗪的治療劑量（輝瑞公司） 對高血壓患者為 0.025-0.06 毫克/公斤/天，而在本實驗中，兔子的劑量大約是 3.3 毫克/公斤/天。在各組兔子的體重之間沒有顯著變化。 哌唑嗪的血藥濃度同哌唑嗪處理的兔子在口服給藥 23 天的后哌唑嗪的血藥濃度為 78.57 +-21.5 納克/毫升。根據(jù)制造商的推薦方案

15、（輝瑞公司），在健康成年人口服 2 毫克（治療劑量）藥物后，體內(nèi)哌唑嗪的最大血藥濃度是 21.1 納克/毫升。 血管生成的計量用哌唑嗪處理的動物早在第 7 天就表現(xiàn)出更顯著的血管向內(nèi)生長。這種增加 性的組織生長一直維持到第 19 天（圖 5） 。在植入之后向內(nèi)生長速度明顯加快 直到第 11 天（圖 6）。對照組平均花了 21.30.59 天的時間耳窗內(nèi)才完全覆蓋 血管化的組織。而處理組則需花 17.3 0.33 天。差異非常顯著（P 0.001 ） 。 在哌唑嗪處理組中，耳窗內(nèi)血管床的總面積在第 23 天是明顯更大一些（圖 7）。圖 8 展示了在移植后的第 13 天兩組耳窗的外觀。處理組的動物

16、的微血管系 統(tǒng)生長得更快，并且組成了一張致密的血管網(wǎng)架。 圖 4 雙窗法的原則。一張?zhí)卣餍盘枅D像是由紅細胞隊列通過窗子上游時產(chǎn)生的，（窗口 1 ）并且這樣的圖像在下游部位也很近似的重現(xiàn)了（窗口 2 ）。可以通過使用相關(guān)技術(shù)法來比較兩張圖像計算出延遲的時間（ Dt）。紅細胞速度（v）可由 V L/ Dt ，這里的L 是兩個窗口之間的距離。 圖 5 對照組（n=8）和哌唑嗪處理組（n=6）窗子內(nèi)覆蓋血管化組織的相對面積表示成百分比的形式。對于對照組，P0.05 為顯著性差異。 圖 6從相對面積曲線的斜率計算管化組織向內(nèi)生長率。對于對照組，P0.05 為顯著性差異。 圖 7 在手術(shù)后的第 23 天，

17、整個耳窗內(nèi)血管床的總面積。對于對照組，P0.05 為顯著性差異。小靜脈內(nèi)的壁面剪應力由于選擇了一個確定直徑范圍（20-40 毫米）的血管用于分析，兩組的血管 直徑并沒有顯著不同。由于增加了血流速，哌唑嗪的處理在第 9 天時使小靜脈壁 面剪應力增加了 44 。這剪應力是成正比的。不過從第 9 天到第 13 天，哌唑 嗪組的壁面切應力減小到對照組水平。在第 13 天和第 20 天這兩組之間的差異并 不顯著（圖 9）。 圖 8 術(shù)后第 13 天窗子的宏觀圖像。 （A）代表對照組和（B ）代表用哌唑嗪治療處理的動物組。“血管前方”的前沿被示蹤并且外圍區(qū)域被涂抹。需要注意的是在處理過的動物中，微脈管生長

18、得更快，更密集。 圖 9 在第 9、13、21 天，對照組和哌唑嗪處理組小靜脈內(nèi)壁面剪應力的變化。對于對照組，P0.05 為顯著性差異。 哌唑嗪對內(nèi)皮細胞生長得直接影響沒有在控制培養(yǎng)和含哌唑嗪的培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞生長曲線上觀 察到明顯的差異（圖 10）。圖 10 在 24 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長曲線。結(jié)合細胞的計數(shù)和是否使用哌唑嗪的天數(shù)一起作圖。沒有觀察到顯著性的差異。每個點上n=3。 討論生理機制調(diào)節(jié)血管生成還沒有在上得到充分研究，特別是血液動力學應 力的潛在作用。大部分研究闡明了要研究血管重塑中的流變影響可以利用實 驗操作（例如， AV 分流器、電刺激、血管擴張的實施

19、）改變血流動力學的條件 導致血流量也同時改變18。我們還使用了血管擴張劑哌唑嗪來改變外周血流。 結(jié)果表明，在兔耳室傷口愈合過程中的血管生成肯定受1 -腎上腺素能受體阻 滯劑哌唑嗪的影響。 用哌唑嗪處理的治療方案是基于先前的研究得出的 1214 。雖然由哌唑 嗪引起的微循環(huán)變化的原因被認為主要是由于血流量增加從而改變血流動力學 19 ，但除了血流動力學變化的其它影響因子也被許被注意。第一，哌唑嗪對 血管增生有直接的化學作用。在含有哌唑嗪的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的生長曲 線表明（圖 10），這個不能直接促進血管內(nèi)皮細胞的增殖。以往的研究也表明哌 唑嗪對平滑肌的生長沒有直接影響 13 。第二，經(jīng)過哌

20、唑嗪處理并沒有產(chǎn)生顯著的系統(tǒng)性的變化。我們的實驗中，兩 組之間的耗水量和體重沒有顯著的差異性。Price 和 Skalak 13 的研究表明， 在哌唑嗪作用下的慢性血管擴張所產(chǎn)生的大鼠平均動脈壓并沒有顯著性變化。到 目前為止我們沒有找到任何可以明確影響血管新生的可檢測的系統(tǒng)性變化。 傷口窗內(nèi)氧分壓的變化是第三首要考慮的因素，因為組織缺氧被假設(shè)成是對 血管重塑產(chǎn)生刺激的因素。氧輸送（ QO2 ）由公式 QO2 =KQHb S 計算得出的。 其中Q 是體積流率， Hb 是一個微血管內(nèi)的血紅蛋白濃度，S 是部分氧合血紅 蛋白數(shù)，k 為血紅蛋白的氧氣結(jié)合能力20。假設(shè)哌唑嗪處理組的組織氧結(jié)合沒 有減少

21、是合理的，因為在早期階段血流量是增加的。哌唑嗪的血管生成活性可能 是由于血流量增加或者是血管壁上加速的微血管血流動力學上的刺激作用而引 起的。顯然，對血管重建能產(chǎn)生刺激的潛在因素可能交互在我們的實驗模型中。在 各種刺激中，我們選擇性地探討一個機械因素，壁面剪應力。因為最近的研究表 明內(nèi)皮壁上的剪應力在血管重塑中起著顯著的作用。培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞對剪應力回 應有著顯著的不同。剪應力能夠通過誘導內(nèi)皮細胞膜的變形和細胞骨架的重新排 列來把應力轉(zhuǎn)移到的內(nèi)皮細胞可能發(fā)生機械傳導的不同區(qū)域。感覺傳導系統(tǒng)中， 在心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮突出的作用的關(guān)鍵受體（例如，G 蛋白偶聯(lián)受體） 通常也參與其中。因此，傳送的

22、應力引起了以形態(tài)和功能的反應 21 。這些包 括第二信使的快速激活，如 NO 的產(chǎn)生、細胞生長因子的產(chǎn)生、多個基因的表達。這些基因可以提供一個范圍廣泛的細胞活動，包括促進鄰近的平滑肌細胞有絲分 裂活性，單核細胞發(fā)現(xiàn)和搬運炎癥細胞 18 。這些最近的研究表明，壁 面剪應力是一個包括血管生成在內(nèi)的自適血管生長的調(diào)節(jié)因子 7 。在一些 體內(nèi)的研究表明，由反復電神經(jīng)刺激或慢性哌唑嗪給藥處理而引起的周邊血流量 的持續(xù)增加可以刺激毛細血管生成并且增加毛細血管密度。而降低外周血流量則 引起小動脈的大小和數(shù)量的減少19。這些結(jié)果表明，剪應力也可以在肌肉血管 生成中發(fā)揮重要的生理作用，但在體內(nèi)實際的應力水平目前還不能被測量到。 這個研究的意義重大，因為它同時研究血管生長和剪切應力的變化。由哌唑 嗪處理而升高的剪應力逐漸降低到對照組水平。這種血流動力學的變化伴隨著血 管的加速生長和血管床的增大。一些學者提出有一個假設(shè)能夠始終解釋這種血流 動力學和形態(tài)學的時間過程，那就是血管對流量持續(xù)變化的回應與對恒定的剪應 力的回應是一致的 6 ，22 ，23 。根據(jù)斯托克斯公式，毛細管網(wǎng)內(nèi)的剪切應 力（）在理論上由下列公式得出： =fRcr/2nl