轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的概念和區(qū)別

1、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的區(qū)別 轉(zhuǎn)染的定義是“將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（質(zhì)粒和線性雙鏈DNA），反義寡核苷酸及RNAi（RNA interference）?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究（基因表達(dá)調(diào)控，基因功能，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物篩選研究）和基因治療研究。基因轉(zhuǎn)染需要一定的轉(zhuǎn)染試劑將帶有目的基因的載體運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。早期的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率很低，且對很多細(xì)胞株無效，因此不能滿足很多科研工作的需要。目前，最常用的轉(zhuǎn)染試劑是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，它們在克服細(xì)胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透過細(xì)胞膜。其中，陽離子脂質(zhì)體在體外基因轉(zhuǎn)染

2、中有很高的效率，然而在體內(nèi)，它迅速被血清清除，在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，這將導(dǎo)致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其應(yīng)用。由于陽離子脂質(zhì)體的局限性，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑日益受到重視。 轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。由外來DNA引起生物體遺

3、傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。噬菌體常常可感染細(xì)菌并將其DNA注入細(xì)菌體內(nèi)，也可引起細(xì)菌遺傳性狀的改變。通過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。 基因工程:有目的的通過分子克隆技術(shù)，人為的操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過程。載體:能在連接酶的作用下和外源DNA片段連接并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。轉(zhuǎn)化:指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。感染:以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬

4、菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。轉(zhuǎn)導(dǎo):指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過程，有時也指在真核細(xì)胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA的過程。轉(zhuǎn)染:指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程?；蜣D(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染的定義是“將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能”。其中，核酸包括DNA（質(zhì)粒和線性雙鏈DNA），反義寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究（基因表達(dá)調(diào)控，基因功能，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物篩選研究）和基因治療研究?；蜣D(zhuǎn)染需要一定的轉(zhuǎn)染試劑將帶有目的基因的載體運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。早期的磷酸鈣轉(zhuǎn)染

5、法轉(zhuǎn)染效率很低，且對很多細(xì)胞株無效，因此不能滿足很多科研工作的需要。目前，最常用的轉(zhuǎn)染試劑是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，它們在克服細(xì)胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透過細(xì)胞膜。其中，陽離子脂質(zhì)體在體外基因轉(zhuǎn)染中有很高的效率，然而在體內(nèi)，它迅速被血清清除，在肺組織內(nèi)累積，誘發(fā)強(qiáng)烈的抗炎反應(yīng)，這將導(dǎo)致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其應(yīng)永。由于陽離子脂質(zhì)體的局限性，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑日益受到重視轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染的概念轉(zhuǎn)染(transfection)指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。轉(zhuǎn)染方法的分類對外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響細(xì)胞正常生理活動，低毒性，容易使

6、用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子.根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可劃分為化學(xué)轉(zhuǎn)染法和物理轉(zhuǎn)染法兩大類.化學(xué)轉(zhuǎn)染法1.DEAE-葡聚糖法DEAE葡聚是最早應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地用用于瞬時表達(dá)的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。2.磷酸鈣法磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細(xì)胞

7、內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA 免受降解.3.人工脂質(zhì)體法人工脂質(zhì)體法采用陽離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質(zhì).此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時適用于瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA 轉(zhuǎn)入動物和人的體內(nèi)用于基因治療.人工合成的陽離子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA 復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，至于DNA 是如何穿過核膜的，其機(jī)理目前還不十分清楚.。物理方法1.顯微注射顯微注射雖然費(fèi)力，但是非常有

8、效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。2.電穿孔這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物園生智體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時間有關(guān)系。3.基因槍法基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體內(nèi)的細(xì)胞。基因?qū)爰?xì)胞的常用方法目的基因序列與載體連接后，要導(dǎo)入細(xì)胞中才能繁殖擴(kuò)增，再經(jīng)過篩選，才能獲得重組DNA分子克隆，不同的載體在不同的宿主細(xì)胞中繁殖，導(dǎo)入細(xì)胞的方法也不相同。一、轉(zhuǎn)化由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化，早在1

9、943年，Avery等就發(fā)現(xiàn)有毒肺炎雙球菌的DNA與無毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺炎雙球菌后代的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。但DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。例如大腸桿菌經(jīng)冰冷CaCl2的處理，就成為感受態(tài)細(xì)菌，當(dāng)加入重組質(zhì)粒并突然由4轉(zhuǎn)入42作短時間處理，質(zhì)粒DNA就能進(jìn)入細(xì)菌；用高電壓脈沖短暫作用于細(xì)菌也能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，這稱為電穿孔（electroporation）轉(zhuǎn)化法。二、感染噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染（infection）。用經(jīng)人工改

10、造的噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖。感染的效率很高，但DNA包裝成噬菌體或病毒的操作較麻煩。三、轉(zhuǎn)染重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2，電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。M13噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌就常用轉(zhuǎn)染的方法。重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞也常用轉(zhuǎn)染方式。最經(jīng)典的是1973年建立的磷酸鈣法，其利用的基本現(xiàn)象是：D

11、NA如以磷酸鈣-DNA共沉淀物形式出現(xiàn)時，培養(yǎng)細(xì)胞攝取DNA的效率會顯著提高。用電穿孔法處理培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞也能提高細(xì)胞攝取DNA能力，但所用外加電場的強(qiáng)度、電脈沖的長度等條件與處理細(xì)菌者都很不相同。用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體（Liposome）可以通過與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，方法簡單而有效，但缺點(diǎn)是有細(xì)胞毒性和血清的不親和性，近年來人們發(fā)現(xiàn)了一種更為有效的轉(zhuǎn)染試劑陽離子聚合物，其克服了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性大，在體內(nèi)易被血清清除等缺點(diǎn)，具有轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單而日益受到重視。G418篩選分析轉(zhuǎn)化的功能和表達(dá)需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞染色體。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，部分能夠通過

12、細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80%的進(jìn)入 核內(nèi)的外源DNA得到瞬時表達(dá)。極少數(shù)情況下，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的*結(jié)構(gòu)最終整合進(jìn)細(xì)胞染色體。細(xì)胞 基因組自由部分表達(dá)，所以整合并不一定意味著表達(dá)，只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會表達(dá)，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達(dá)的量也是不同的。由于攝 取、整合、表達(dá)外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列 （neo抗性基因）攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、

13、慶大霉素、卡那霉素相似，它 通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞，也包括原生動物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用 的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效 表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有418的選擇性培養(yǎng)基中生長。418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛 應(yīng)用。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)讓時不加其它抗生素。其實G418本身

14、有很好 的殺菌效果，在用G418進(jìn)行篩選的過程中很少會發(fā)生污染。但有一點(diǎn)，其實我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實驗手冊中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時所 用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對細(xì)胞膜有影響，可能此時加抗生素對細(xì)胞損傷較大。因為慶大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙 類藥物，其藥理作用完全一樣。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實驗室之間的交流，在實際 操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。Protocal1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10m

15、l，過濾消毒，4度保存。2.細(xì)胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時左右開始加藥。3.制備篩選培養(yǎng)基：在100g/ml1000g/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度，比如先做個100g/ml、400g/ml、800g /ml、1000g/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。4.加G418篩選： 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。6.確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不 大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個梯度的G418的量在10天前就看不到活