人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立-大鵬修改第三稿

1、SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY學(xué)士學(xué)位論文THESIS OF BACHELOR論文題目： 人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立 劉欣 5111509102 食品科學(xué)與工程 王大鵬學(xué)生姓名:學(xué)生學(xué)號:專業(yè):指導(dǎo)教師:學(xué)院(系): 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立摘要諾如病毒（norovirus, NoVs）按照其編碼衣殼蛋白 ORF2 序列的不同，可以將其分為 5 個組（GI-GV）；其中 GI， GII, GIV 組病毒可感染人類被稱為人源諾如病毒（human norovirus, HuNoVs）。HuNoVs 是全世

2、界范圍內(nèi)導(dǎo)致非細(xì)菌性腸胃炎的主要病原之一。由于該病毒不能進(jìn)行體外培養(yǎng)和增殖，嚴(yán)重阻礙了對其感染機(jī)制和免疫學(xué)等方面的研究。目前，HuNoVs 的檢測方法主要依賴于反轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）。但是，兩種方法均無法區(qū)分?jǐn)U增模板是來自于游離病毒 RNA，還是完整的病毒顆粒。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，利用唾液（含有 HuNoVs 的受體）可與 HuNoVs 特異性結(jié)合的屬性，初步建立了該病毒感染性評價(jià)的新方法原位捕捉熒光定量 PCR（ISC-RT-qPCR）。本研究通過篩選 A，B，O 血型唾液樣本的親和性，并優(yōu)化三者的最佳比例，完善了以唾液為包被受體的 IS

3、C-RT-qPCR 檢測方法。對其進(jìn)行初步應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，ISC-RT-qPCR 方法可用于自然河水中 HuNoVs 污染的檢測。本研究為 HuNoVs 檢測中包被受體的選擇上提供了新思路，也為其實(shí)際應(yīng)用開辟了新道路。關(guān)鍵詞：人源諾如病毒，檢測方法，ISC-RT-qPCR，HBGAs，唾液人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立THE ESTABLISHMENT OF A NEW METHOD TOEVALUATE THE INFECTION OF HUMAN NOROVIRUSABSTRACTNorovirus (NOVs), according to its different sequence of

4、 open reading frame 2 that encodes capsid protein, can be divided into 5 genogroups. Among those norovirus, genogroup I, genogroup II and genogroup IV can infect human which are called human norovirus (HuNoVs). Human norovirus are one of the main pathogens causing acute non-bacterial gastroenteritis

5、 all over the world. Immunological knowledge of HuNoVs such as virus infection mechanism and host specificity, is seriously limited due to its inability to be cultured and proliferation in vitro. Current detection methods of HuNoVs mainly focused on RT-PCR (reverse-transcription PCR) and RT-qPCR (re

6、al-time quantitative reverse transcription-PCR). However, both of the two methods cannot make sure the amplification templates come from the free viral RNA or from complete virus particles, that is cannot distinguish between infectious and non-infectious particles. On the basis of preliminary work,

7、my research focused on using the feature of saliva (containing thereceptors of HuNoVs) to capture HuNoVs, and initially establishing a new method to detectHuNoVs-ISC-RT-qPCR (itu capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR). Inthis study, I screen the strongest affinity saliva samples

8、 of A, B, O blood type antigens, and optimize the best ratio of the three to improve the new ISC-RT-qPCR detecting method usingsaliva-coated receptor. Finally in a preliminary exploration of the application discovery,ISC-RT-qPCR detecting method can be used to detect HuNoVsurface water (artificial p

9、ollutedby HuNoVs). This experiment not only further improves ISC-RT-qPCR method offering a new choice for coated receptor to detect HuNoVs, but also opens the way for its practical applicationexploration.Key words: human norovirus, detecting method, ISC-RT-qPCR, HBGAs，saliva人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立目錄第一章 緒論

10、11.11.21.31.41.5諾如病毒簡介1人源諾如病毒流行病學(xué)特征1人源諾如病毒感染性研究現(xiàn)狀2諾如病毒檢測方法現(xiàn)狀3實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x4第二章 唾液樣品的收集和處理52.1采集唾液52.1.1 唾液樣本采集對象52.1.2 唾液樣本采集方法5處理唾液5本章小結(jié)52.22.3第三章 唾液包被的原位捕捉熒光定量 PCR（ISC-RT-qPCR）方法的建立與評估63.1 唾液包被 ISC-RT-qPCR 檢測方法可行性驗(yàn)證63.1.13.1.23.1.3實(shí)驗(yàn)材料6實(shí)驗(yàn)方法6結(jié)果與分析83.2 ISC-RT-qPCR 新方法篩選最佳臨床病毒樣本93.2.1 GI 組病毒的篩選93.2.2 GII 組

11、病毒的篩選103.2.3 小結(jié)103.3 篩選親和性最強(qiáng)的唾液樣本103.3.13.3.23.3.3用 GI 組病毒樣本（3010）篩選唾液樣本10用 GII 組病毒樣本（3009）篩選唾液樣本11小結(jié)123.4 采用親和性最強(qiáng)的唾液樣本調(diào)節(jié)最適比133.4.1 尋找 3010（GI）的唾液最適比133.4.2 尋找 3009（GII）的唾液最適比133.4.3 小結(jié)143.5 本章小結(jié)14第四章 人工污染 HuNoVs 樣本的檢測154.1河水取樣154.1.1 取樣地點(diǎn)154.1.2 取樣方法15檢測運(yùn)用154.24.2.14.2.24.2.3人工污染15檢測病毒15結(jié)果及分析154.3本

12、章小結(jié)16第五章 結(jié)論17人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立參考文獻(xiàn)19謝辭24人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立第一章 緒論據(jù)京華時(shí)報(bào)最道：2015 年 5 月中旬，北京市朝陽區(qū)花家地實(shí)驗(yàn)小學(xué)的學(xué)生陸續(xù)出現(xiàn)惡心、腹瀉、嘔吐等癥狀。經(jīng)北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心確認(rèn)，患病學(xué)生是受諾如病毒感染。近年來，國內(nèi)外諾如病毒暴發(fā)案例屢見不鮮，常出現(xiàn)在中小學(xué)、幼兒園、游輪等人員密集且封閉或半封閉的地方。但是，對于諾如病毒的暴發(fā)目前仍無法進(jìn)行預(yù)警和控制。建立高效的諾如病毒檢測體系是解決該問題的重要手段。1.1 諾如病毒簡介諾如病毒（norovirus, NoVs）最初從 1968 年在美國 Ohio 州 N

13、orwalk 市一所小學(xué)暴發(fā)的冬季嘔吐疾病研究中分離出來的1，曾被命名為諾瓦克病毒（Norwalk virus，NV）。NoVs是一種單鏈正股 RNA 病毒，無包膜，屬于嵌杯病毒科諾如病毒屬2，病毒粒子直徑 2738 nm3，基因組全長約 7.7 kb，由 3 個開放閱讀區(qū)（open reading frames, ORF）組成。其中， ORF1 區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2 區(qū)編碼主要衣殼蛋白 VP1；ORF3 編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白 VP2。4根據(jù)其編碼衣殼蛋白 ORF2 序列的不同，可將其分為 5 個基因組（genogroups）5，即GI-GV。不同 NoVs 在基因和抗原性方面差別很大。2

14、, 6-9 其中 GIII 是牛源，GV 是鼠源諾如病毒；GI，GII，GIV（GII/11 是豬源）都能感染人10，被稱為人源諾如病毒（human norovirus, HuNoVs）。在衣殼蛋白編碼序列多樣性的基礎(chǔ)上， GI 族有 8 個基因簇，GII 族有 17 個基因簇；GIV 族有 1 個基因簇。4 Fankhauser 等研究顯示11：GII 族是 HuNoVs 誘發(fā)食物中毒案例的主要基因型，占 73%；GI 族 HuNoVs 占 26%，其余案例的病原屬于 GIV 族。其中，GII.4 所導(dǎo)致的諾如病毒暴發(fā)和擴(kuò)散案例最為常見。Kroneman 等的調(diào)查發(fā)現(xiàn)12，GII.4 在過去

15、的10 年里在美國、歐洲、大洋洲已經(jīng)成為流行毒株，占所有諾如病毒暴發(fā)案例的 70%80%。所以，本實(shí)驗(yàn)以 GI 和 GII 組 HuNoVs 為主要研究對象。1.2 人源諾如病毒流行病學(xué)特征HuNoVs 是造成非細(xì)菌性腸胃炎的主要原因之一。13 由于 HuNoVs 感染劑量很低（感染量約 18 個病毒粒子）14，所以極易擴(kuò)散感染。易感人群暴露于被 HuNoVs 污染的環(huán)境后，1524 h 會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、肌痛、惡心、發(fā)燒等臨床癥狀，可一直持續(xù)到 2472 h15。各個年齡階段人群都可感染 HuNoVs，常發(fā)生在人口聚集的場合，如學(xué)校、養(yǎng)老院、醫(yī)院、餐廳，甚至宴會等11。HuNoVs 主要通過

16、受污染的食物、水，或者通過人與人之間的接觸傳染。13,16-19流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HuNoVs 的感染與季節(jié)有關(guān)，暴發(fā)峰值出現(xiàn)在冬季，而夏季則發(fā)病率最低。20 雖然 HuNoVs 感染性強(qiáng)、發(fā)病率高，但是該病毒沒有體外增值模式或細(xì)胞系，目前并沒有成熟的疫苗或者抗病毒藥物用于預(yù)防或治療。El-Kamary 等已經(jīng)制得了NV (GI.1)的疫苗21，雖已通過臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該疫苗的性能22，但其并未投入商業(yè)生產(chǎn)且 GI.1毒株為非流行毒株。與細(xì)菌不同，病毒是嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生，故污染食物的病毒不會在加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存過程中增殖。研究表明23，HuNoVs 對于熱、消毒劑和 pH 的抗逆性較強(qiáng)，且穩(wěn)定地存在于

17、不同環(huán)境；王大鵬等利用 ISC-RT-qPCR 方法評估的 HuNoVs 滅活條件為：16 ppm濃度的氯處理 20s，72加熱 4 min 或者 1 J/cm2 紫外線輻射；且病毒對酒精耐受。24 由此可見，HuNoVs 具有較強(qiáng)的抗逆性。第 1 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立1.3 人源諾如病毒感染性研究現(xiàn)狀由于 HuNoVs 不能體外繁殖，缺乏組織培養(yǎng)系統(tǒng)和動物模型25，故人們對其發(fā)病機(jī)理及其生物學(xué)信息，如生存、復(fù)制和基因表達(dá)等了解甚少。目前很多牛源、豬源、鼠源的諾如病毒也被證實(shí)與腸胃炎有關(guān)。5,26,27 鼠源諾如病毒（murine norovirus, MNV）是

18、唯一一種能在體 行細(xì)胞培養(yǎng)和小動物體內(nèi)增殖的諾如病毒28；由于其與 HuNoVs 的相似性，MNV 被廣泛視為最能替代 HuNoVs 的諾如病毒。29 這為我們了解諾如病毒在組織培養(yǎng)內(nèi)的復(fù)制機(jī)制和宿主體內(nèi)的發(fā)病機(jī)理提供了幫助。但是，MNV 畢竟是鼠源，不能直接全方面揭示HuNoVs 對人的感染性30。除了尋找與 HuNoVs 相似的動物杯狀病毒進(jìn)行類比研究，探求其致病機(jī)理，也有研究另辟蹊徑，利用昆蟲細(xì)胞表達(dá) ORF2 時(shí)，VP1 可以自動折疊成類病毒顆粒（virus-like particles, VLPs）來研究病毒受體。31 VLPs 是模仿真實(shí)病毒組織和構(gòu)象的多重蛋白結(jié)構(gòu)，它不含有病毒的

19、基因組32，在形態(tài)學(xué)和免疫性上與真實(shí)病毒難以區(qū)分33,34。它可以用于產(chǎn)生更安全、便宜的疫苗。VLPs 提供了更多渠道讓我們有效地認(rèn)識諾如病毒，研究病毒和宿主的特異性結(jié)合。例如，通過重組諾瓦克類病毒粒子（recombinant Norwalk virus-like particles，rNV VLPs) 與培養(yǎng)的 Caco-2 細(xì)胞（人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞）進(jìn)行結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞的研究揭示了諾如病毒衣殼蛋白的 C 末端區(qū)可能與細(xì)胞特異性結(jié)合有關(guān)，rNV VLPs 與細(xì)胞的結(jié)合具有飽和性和特異性，且其可能識別腸細(xì)胞上的某種受體。352000 年，Ruvon-Clou

20、et N 等研究發(fā)現(xiàn)36，兔癥病毒（Rabbit Hemorrhagic DiseaseVirus）作為一種杯狀病毒，能與兔上皮細(xì)胞上 H 型的兩種組織血型寡糖結(jié)合。為了尋找HuNoVs 在細(xì)胞上的受體，Marionneau S 等將該結(jié)果類推到同屬的 HuNoVs 上37，以 rNV VLPs 證實(shí) NV 可與小腸上皮細(xì)胞和分泌型唾液中的人體組織血型抗原（histo-blood groupantigens, HBGAs）結(jié)合，但不與泌型唾液結(jié)合，即 NV 與小腸上皮細(xì)胞的結(jié)合與分泌型、泌型有關(guān)。HBGAs 主要包括 ABH（ABO）抗原和 Lewis 抗原，是帶有多糖鏈末端結(jié)構(gòu)的碳水化合物，

21、廣泛存在于唾液、腸液等體液中和組織中。38 這些抗原由 5 種均為二糖的前體物質(zhì)在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過逐步加上單糖形成的。首先，合成 H 抗原（即 O 抗原），再在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下在 H 抗原上加入 A，B 表面抗原決定簇，形成 A，B 抗原。如果 FUT2 (fucosyltransferase 2) 基因編碼區(qū)有部分核苷酸位點(diǎn)發(fā)生自然突變，導(dǎo)致相關(guān)酶失活，則這些個體被稱為“泌型”（non-secretor），反之則為“分泌型”（secretor）。 FUT3(fucosyltransferase 3) 參與 Lewis 抗原合成，如缺乏該酶活性則表現(xiàn)為 Lewis，反之則為陽性。39

22、諸多研究發(fā)現(xiàn)：HuNoV 的感染性可能與人體內(nèi)的組織血型抗原有關(guān)，與個體的遺傳因素有關(guān)。HBGAs 可能是 NV 感染的受體40。在 1977 年 NV 臨床感染實(shí)驗(yàn)中，Parrino 等發(fā)現(xiàn)部分人群對該病毒具有耐受的現(xiàn)象41。后來，Hutson 等以 rNV VLPs 證明了人對 NV 的易感性與 ABO 組織血型有關(guān)的猜想42。他們首次證實(shí)宿主的遺傳性與 NV 的感染風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，O 型血的人群更容易感染 NV，而 B 型血的人感染 NV 的風(fēng)險(xiǎn)較低。基于前期研究，Huang 等將病毒與受體相互作用的研究擴(kuò)大到 8 種 HuNoVs40，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除了分泌型抗原表位外，A, B

23、和 Lewis 組織血型抗原都與 HuNoVs 的結(jié)合有關(guān)，由此推測不同的 HuNoVs 可能識別腸上皮細(xì)胞中不同的 HBGAs，并將其作為感染的受體。志愿者感染NV 的研究43直接證明了在病毒的易感性上，HBGAs 直接作為受體與之識別。之后，陸續(xù)開展了對于多種諾如病毒與不同 HBGAs 受體結(jié)合機(jī)理研究。44-47研究發(fā)現(xiàn)，諾如病毒的 VP1 主要有兩個區(qū)域（doma）。主要組成二十面體外殼的區(qū)域被稱為殼區(qū)（S domain），延伸到殼外形成錨的突出區(qū)域被稱為突出區(qū)（P domain）33。P domain 直接與宿主接觸并誘發(fā)免疫應(yīng)答48，也能參與二聚體的交互作用，從而輔助增強(qiáng)衣殼蛋白的

24、穩(wěn)定性49。P domain 可水解成 P 多肽（P polypeptide），這可能是諾如病毒在宿主第 2 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立體內(nèi)復(fù)制、免疫應(yīng)答的重要一步50。不同基因組（genogroups）的諾如病毒 P domain 末端P2 區(qū)的多樣性導(dǎo)致其與 HBGAs 結(jié)合的部位存在差異51。雖然 HuNoVs 可將 HBGAs 作為侵染細(xì)胞的受體，但是該病毒仍無法體外培養(yǎng)。協(xié)助HuNoVs 復(fù)制的功能性輔助受體在細(xì)胞培養(yǎng)中已經(jīng)不存在，可能是其中的一個原因。52 盡管不同的 HuNoVs 在 HBGAs 識別中高度多樣化，但在遺傳密切相關(guān)的毒株（stra）之間，只

25、有在 HuNoVs-HBGAs 結(jié)合界面上共享的 HBGAs 抗原存在少量不同的結(jié)構(gòu)蛋白。例如， 作為暴發(fā)案例最多的 GII.4 HuNoVs，能識別所有 ABO 型中的分泌型的唾液（約占總?cè)丝诘?0%），但 GII.3 族的代表毒株 MxV 僅識別唾液中的 A, B 抗原，對于 O 分泌型只有輕微的結(jié)合力52。1.4 諾如病毒檢測方法現(xiàn)狀1972 年 Kapikian 先生利用免疫電鏡（immunoelectron microscopy, IEM）在 4 年前一次腸胃炎的樣品中發(fā)現(xiàn) Norwalk virus3，至今，IEM 成為諾如病毒的檢測方法之一。該方法一度成為諾如病毒最經(jīng)典的檢測方法

26、。但是，它對操作者的技術(shù)要求高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要從形態(tài)學(xué)在視覺上對病毒粒子進(jìn)行區(qū)分，檢測靈敏度差且只能發(fā)病后 23 天檢測到53，至少106107 病毒粒子/mL 糞便才能被檢出。該方法很少用于檢測食品和環(huán)境中的HuNoVs 污染。54檢測抗原的酶聯(lián)免疫反應(yīng)（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)是基于重組病毒衣殼蛋白（recombinant virus capsid）產(chǎn)生的免疫抗血清的應(yīng)用，只能檢測特定類型或者有相同或相似的諾如病毒株群55。商業(yè)化的 ELISA 試劑盒不能區(qū)分感染性粒子、空外殼蛋白和游離的 HuNoVs 抗原56。ELISA 靈敏度

27、不高，檢測限約為每個反應(yīng) 105 個粒子，不太適合直接檢測食品中和環(huán)境中的微生物污染54。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，HuNoVs 的分子檢測方法也逐漸發(fā)展起來。1995 年， RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)被用于檢測 HuNoVs57后，該方法便被廣泛用于臨床病毒檢測58。后來在此基礎(chǔ)上，建立了 RT-qPCR (real-time quantitative reverse transcription-PCR)方法并用于 HuNoVs 檢測59。相比于傳統(tǒng) RT-PCR 中的電泳凝膠、測序， RT-qPCR 采用

28、熒光標(biāo)記特定探針，大大縮短了檢測周期并提高了靈敏性和特異性，使定量檢測環(huán)境和食品樣本中的 HuNoVs 成為可能。其中，Taqman 探針的方法使用最廣泛60。在 RT-PCR 和 RT-qPCR 中，都是基于病毒核酸進(jìn)行檢測，只能擴(kuò)增和檢測小片段核酸序列，這個核酸片段可能來自于具有感染性的病毒基因核酸序列，也有可能存在于有缺陷性的、含有完整或部分基因組的病毒粒子，或者含有部分降解的 RNA 的失活的粒子，或者游離的 HuNoVs RNA54。即無法區(qū)別感染性和非感染性的 HuNoVs 粒子。這種檢測結(jié)果，無疑是夸大了 HuNoVs 的污染水平，從而誤導(dǎo)政府部門風(fēng)險(xiǎn)控制的政策實(shí)施。為了檢測到食

29、品和環(huán)境中的 HuNoVs，通常都要對病毒進(jìn)行分離和富集，常用的方法有離心、過濾、有機(jī)溶劑萃取、沉淀、免疫磁珠連接分離、酶預(yù)處理，以及新型的連接配體（binding ligands）等54。例如，用磁珠-HBGAs 連接可用于樣品中病毒的捕捉61，及利用豬腸胃黏膜提取物（porcine gastric mucin, PGM）代替 HBGAs 的相似捕捉方法62。雖然用抗體捕捉、富集病毒在理論上是具有可行性的，但要尋找到廣譜的，并能進(jìn)行商業(yè)用途的抗體，還需要進(jìn)一步摸索。近年，Tulane virus (TV)被用作 HuNoVs 的替代病毒。與其它常見替代病毒（MNV、Felinecaliciv

30、irus 等）相比，TV 是真正的腸道致病微生物，可識別人體的 HBGAs63。王大鵬等以B 型血人的唾液（含 HBGAs）作為吸附相，結(jié)合 Taqman 探針 RT-qPCR 方法，建立了原位捕捉定量 PCR（itu capture RT-qPCR，ISC-RT-qPCR）。以熱、氯、UV 或酒精處理對 TV進(jìn)行部分或全部滅活， 利用 TCID50 （ the 50% tissue culture infectious dose ）方法對第 3 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立ISC-RT-qPCR 方法進(jìn)行對比評估64，結(jié)果顯示：兩種方法均可對 TV 感染性進(jìn)行評價(jià)，且I

31、SC-RT-qPCR 方法具有靈敏、簡便、檢測周期短等優(yōu)勢。以在此基礎(chǔ)上，王大鵬等又以 PGM（含有 A, H1 和 Lewis b HBGAs）作為 HuNoVs 的受體，結(jié)合 RT-qPCR，建立了直接檢測HuNoVs 的 ISC-RT-qPCR 方法24。他們以 ISC-RT-qPCR 方法對 HuNoVs 的滅活條件進(jìn)行了評估。與傳統(tǒng)的 RT-qPCR 相比，ISC-RT-qPCR 在區(qū)分 HuNoVs 的感染性上又邁出了一大步；該方法無需提取病毒的核酸且可規(guī)?；僮?，極大地節(jié)省了人力，降低了檢測成本，縮短了檢測周期。PGM 雖然含有 A 型、H1 型（O 型）和 Lewis b 的

32、HBGAs，均與人的 HBGAs 相似，能與 GI 和 GII 族的 HuNoVs 結(jié)合65。但由于豬缺乏 B 型的 HBGAs，故該方法的 HuNoVs 檢測譜偏窄；如 Snow Mountain virus (SMV，GI.2)44對 B 型血人群易感，該方法則會出現(xiàn)漏檢。這對于基因型多變的 HuNoVs 檢測便提出了挑戰(zhàn)。1.5 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x人體的 HBGAs 廣泛存在于唾液、腸液等分泌液中。38 本實(shí)驗(yàn)在已初步建立ISC-RT-qPCR 的研究基礎(chǔ)上，直接以不同血清型人群的唾液進(jìn)行包被，以期建立唾液包被的 ISC-RT-qPCR 新方法，并對新方法進(jìn)行應(yīng)用探索。相比于 PGM 包被，

33、該方法以唾液包被可擴(kuò)大 HuNoVs 檢測譜。該方法不需要提取病毒 RNA，可以規(guī)?；绦蚧瘷z測，大大降低人工成本。本研究建立并完善基于新型病毒受體的 ISC-RT-qPCR 方法，為其在 HuNoVs 檢測中包被受體的選擇上提供了新思路，也為其在實(shí)際檢測運(yùn)用中作出了新的嘗試。該方法提高HuNoVs 檢測準(zhǔn)確率，縮短檢測周期，為防控該病毒及其導(dǎo)致食品安全支撐。同時(shí)，也為其在實(shí)際應(yīng)用中的探索開辟了道路。的暴發(fā)提供技術(shù)第 4 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立第二章 唾液樣品的收集和處理2.1 采集唾液2.1.1 唾液樣本采集對象唾液采集對象：中國國籍 2030 歲年輕人，身體健康

34、、無長期和短期疾病。男女比例為1:1。A，B，O 血型為主要的分類依據(jù)。按照表 2-1 對志愿者進(jìn)行信息統(tǒng)計(jì)。表 2-1 唾液采集志愿者信息登記表志愿者編號姓名性別血型民族年齡隨機(jī)采集每種血型人的唾液樣本各 6 份，共計(jì) 18 份。其中 A 型血人唾液為 16 號，B 型血人唾液為 712 號，O 型血人唾液為 1318 號。2.1.2 唾液樣本采集方法用蒸餾水漱口，吐凈，約 5 min 后準(zhǔn)備收集唾液。唾液收集采用自然取樣法66，主要步驟為：身體前傾，低頭，舌抵住上顎，短時(shí)間后，唾液便于下唇自然留下。用 50 mL 離心管收集流出的唾液 78 mL，并盡快進(jìn)行后續(xù)處理。2.2 處理唾液參考文

35、獻(xiàn)64中的方法，將收集的唾液進(jìn)行分裝后，沸水浴 5 min，10000g（Eppendorf 5424，Eppendorf, Germany）離心 5 min。吸取上清液，分裝小份后，-20 oC 下冷凍保存，備用。2.3 本章小結(jié)實(shí)驗(yàn)的唾液樣本采集對象均為 2030 歲的中國籍身體健康的在校生。其中男女比例相當(dāng)。共采集了 18 份唾液樣本，A 型、B 型和 O 型血人唾液樣本各 6 份。采集后立即對唾液進(jìn)行煮沸處理，并置于-20 oC 下冷凍保存。第 5 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立第三章 唾液包被的原位捕捉熒光定量 PCR（ISC-RT-qPCR）方法的建立與評估3.

36、1 唾液包被 ISC-RT-qPCR 檢測方法可行性驗(yàn)證3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料（1）試劑經(jīng)純化的豬腸胃黏膜提取物（porcine gastric mucin, PGM）（Sigma，St. Louis，MI；cat. no. M-1778）；牛血清蛋白（Albumin from bovine serum, BSA）（上海翊圣生物，cat.no.36101ES25）；0.05 mol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液（pH=9.6）；磷酸緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS），pH=7.2；含 1% BSA 的磷酸緩沖溶液：將 1.0 g BSA 溶于 100 mL 的

37、磷酸緩沖溶液（pH=7.2）；臨床病毒樣本（GI 組和 GII 組）：由北京市疾病預(yù)防控制中心高志勇博士提供。（2）實(shí)驗(yàn)器材One Step Prime Script TM RT-qPCR kit（TaKaRa，code no. RR064A）；酶標(biāo)條（Nunc Immuno Module）(VWR，Brisbane，CA)；聚烯烴膜（polyplefealing tape）（VWR，West Chester，PA，USA）；37 oC 恒溫培養(yǎng)箱（HPP260，Memmert，Germany）；微型離心機(jī)（Mini-6K，珠海醫(yī)學(xué)儀器）；熒光定量 PCR 儀器（Eppendorf Maste

38、rcycler epgradientS，Eppendorf，Germany）。3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行 PGM 包被，作為陽性對照；24 唾液包被作為實(shí)驗(yàn)組；且在陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組中設(shè)置（1）HBGAs 包被酶標(biāo)板對照組，即不加入臨床病毒樣本。各組之間實(shí)驗(yàn)條件均相同。將PGM 用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液稀釋為 1.0 mg/mL，于酶標(biāo)條中每孔中加入 100 L，作為陽性對照組。暫取 1 號（A 型），7 號（B 型），13 號（O 型）唾液樣本按照 A:B:O=1:1:1 比例，用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液稀釋 1000 倍，并在酶標(biāo)條中每孔加入 100 L，為實(shí)驗(yàn)組。加入含

39、HBGAs 包被液的酶標(biāo)板置于 4 oC 下包被過夜。（2） 封閉酶標(biāo)板取出酶標(biāo)板，將包被液倒盡，每孔加入 120 L 含 1% BSA 的 PBS，置于 37 oC 恒溫培養(yǎng)箱中，封閉 1 h。（3） 加入臨床病毒樣本取出酶標(biāo)板，用 180 L PBS（pH=7.2）對酶標(biāo)板清洗三遍，倒盡液體。隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室的一個臨床病毒樣本 3010 (GI)，用 PBS 進(jìn)行梯度稀釋：10x，100x，1000x。除對照組外，每孔均加入 100 L 稀釋的病毒樣本酶標(biāo)板加樣順序如下圖 3-1 所示：對照組（NC）加入 100 L PBS。第 6 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立NC：n

40、egative control/對照；Saliva：唾液組圖 3-1 驗(yàn)證唾液包被 ISC-RT-qPCR 檢測方法可行性酶標(biāo)板加樣示意圖加樣完畢后，將酶標(biāo)條放入 37 oC 恒溫培養(yǎng)箱中孵育 30 min。（4）使具有感染毒粒子高溫裂解，釋放病毒 RNA取出酶標(biāo)板，用 180 L PBS（pH=7.2）對每孔均清洗三遍，盡可能倒盡液體。于每孔中加入 8.5 L DEPC 處理的 dH2O，并用聚烯烴膜封蓋。先于 95 oC 孵育 5 min， 4 oC 下冷卻。酶標(biāo)條短暫離心，至管壁上無水珠附著即可。（5）RT-qPCR 反應(yīng)液配制RT-qPCR 反應(yīng)采用試劑盒說明書推薦的 25.0 L 反

41、應(yīng)體系。反應(yīng)體系如表 3-1 所示。表 3-1 RT-qPCR 反應(yīng)體系試劑使用量2x One Step RT-PCR Buffer III TaKaRa Ex Taq HS (5 U/L) PrimeScript RT Enzyme Mix II PCR Forward Primer (10 M) PCR Reverse Primer (10 M) TaqMan Probe (10 M)Total12.5 L0.5 L0.5 L0.5 L0.5 L 1 L*216.5 L整個反應(yīng)液配制需在冰上進(jìn)行，且應(yīng)在無核酸區(qū)進(jìn)行操作，謹(jǐn)防體系污染。GI，GII 族諾如病毒檢測所采用的上下游引物及探針序列

42、，參考 Tsutomu Kageyama 的序列59，如表 3-2 所示。表 3-2 人源諾如病毒 GI，GII 族引物及 TaqMan 探針序列序列 (53)基因組引物或探針GICOG1F COG1R RING1(a)-TPRING1(b)-TPCGYTGGATGCGNTTYCATGA CTTAGACGCCATCATCATTYACFAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-TAMRAFAM-AGATCGCGGTCTCCTGTCCA-TAMRAPrimerProbeGIICOG2FCOG2R RING2-TPCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG TCGACGCCATCTT

43、CATTCACAFAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRAPrimerProbe將酶標(biāo)條貼膜揭下，加入配置好的 RT-qPCR 試劑各 16.5 L，并混合均勻。再用膜重新封蓋，短暫離心，至管壁上無水珠附著，并消除酶標(biāo)孔中氣泡。第 7 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立（6）RT-qPCR 檢測將酶標(biāo)條放入熒光定量 PCR 儀中，根據(jù)熒光基團(tuán)的激發(fā)光波長，選用 FAM 通道，反應(yīng)條件如表 3-3 所示。表 3-3 RT-qPCR 反應(yīng)條件反應(yīng)步驟反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間42 oC95 oC94 oC53 oC60 oCStage1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10 min30 sStag

44、e2PCR 反應(yīng)15 s15 s30 s40 cycles3.1.3 結(jié)果與分析（1）RT-qPCR 結(jié)果分析RT-qPCR 結(jié)果如圖 3-2a 和圖 3-2b 所示：1000950900850800750700650600550500450400350300250200150100500-50-10010x100x1000xNC0123456 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40Cycle圖 3-2a PGM 包被的 ISC-RT-q

45、PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1000950900850800750700650600550500450400350300250200150100500-50-10010x100x1000xNC0 1234567 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40Cycle圖 3-2b 唾液包被的 ISC-RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖第 8 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立圖 3-2a 顯示：PGM 所包被的 RT-qPCR 結(jié)果中，對 3010（G

46、I）檢驗(yàn)呈陽性。與已有報(bào)道的實(shí)驗(yàn)事實(shí)相符，證明該實(shí)驗(yàn)條件下可運(yùn)用 ISC-RT-qPCR 方法檢測 HuNoVs。圖 3-2b 顯示：唾液包被的 ISC-RT-qPCR 方法與 PGM 結(jié)果一致，也呈陽性。證明唾液包被的 ISC-RT-qPCR 方法對檢測 HuNoVs 具有可行性。且臨床病毒樣本 3010（GI）進(jìn)行 10x. 100x, 1000x 梯度稀釋均有陽性結(jié)果。（2）ISC-RT-qPCR 方法分析本實(shí)驗(yàn)在 HBGAs 與病毒粒子特異性結(jié)合基礎(chǔ)上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)過程中 PBS 的不斷洗脫，使不具有感染性的病毒粒子及病毒樣本中游離的核酸（在 PCR 中容易造成假陽性結(jié)果）和病毒樣本中部分干

47、擾物質(zhì)均被洗脫出去，從而減少對后續(xù) RT-qPCR 過程的干擾，使結(jié)果更貼近病毒的真實(shí)感染性。高溫可使與 HBGAs 結(jié)合的病毒粒子衣殼蛋白破裂釋放核酸；再加入 RT-qPCR 試劑后，便可進(jìn)行特異性擴(kuò)增反應(yīng)。本方法中，HBGAs 與病毒并不是百分合，可能存在未結(jié)合或結(jié)合力很弱，在實(shí)驗(yàn)中被洗脫掉，從而對病毒的定量檢測造成了影響，導(dǎo)致測定的病毒量偏低。但在本檢測實(shí)驗(yàn) 中，對于所有的檢測樣本而言，這屬于系統(tǒng)誤差，不影響樣品間檢測效果的比對。但如果要 全面評估此方法，核算其檢測效率及該方法檢測到的病毒量與樣本中病毒的真實(shí)含量的差異，需將此方法與傳統(tǒng)通用檢測方法作評估時(shí)，這就變成必須考慮的因素之一。3

48、.2 ISC-RT-qPCR 新方法篩選最佳臨床病毒樣本采用來自北京市疾病預(yù)防控制中心采集的諾如病毒暴發(fā)案例中患者的腹瀉樣本作為實(shí)驗(yàn)的臨床病毒樣本。其中 GI 組臨床樣本有 3010 和 1036 兩個編號樣本；GII 組臨床樣本較多，有 1021，1029，2021，3009，3014，3035，3143，3148 共 8 個編號樣本。針對已有病毒樣本，采用初步建立的唾液包被的 ISC-RT-qPCR 方法進(jìn)行篩選，篩選出相對檢測效果最好的 GI 和 GII 組病毒樣本。3.2.1 GI 組病毒的篩選（1）實(shí)驗(yàn)方法選用 1 號（A 型），7 號（B 型），13 號（O 型）志愿者唾液按照 A

49、:B:O=1:1:1 進(jìn)行 1000倍稀釋，對酶標(biāo)板進(jìn)行包被，4oC 下放置過夜。PBS 清洗后，用含 1% BSA 的 PBS 封閉 1 h，再加入 20 倍稀釋的 GI 族病毒 1036 和 3010。對照組不加入病毒，只加入等量的 PBS即可。每組平行三次。37 oC 孵育 30 min，PBS 洗滌三次后，加入 8.5 L 不含RNA 酶的dH2O，高溫裂解釋放病毒核酸。最后加入 RT-qPCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量 PCR 操作，根據(jù)熒光基團(tuán)的激發(fā)光波長，檢測 FAM 通道下的熒光量。（2）結(jié)果與分析通過 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的 Ct 值的比較，來判定 1036 和 3010

50、 檢測效果。2021Ct 值36.981.5730.120.25-33.990.1230.760.23病毒樣本編號30093014303531433148Ct 值22.120.0928.020.8229.681.0029.510.1136.510.51*：所有病毒樣本均采用三平行，計(jì)算得出平均 Ct 值。表中未標(biāo)注樣本均屬于 GII 組。通過表 3-3 的結(jié)果可知，3010 的 Ct 值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 1036。Ct 值越小，說明與唾液結(jié)合的病毒粒子越多，即臨床病毒樣本中的病毒含量越高。故由此推斷，臨床病毒樣本 3010 的病毒滴度較高，檢測效果較好。因此選擇 3010 作為GI 組代表病毒，作為后

51、續(xù)研究基礎(chǔ)。第 9 頁 共 24 頁人源諾如病毒感染性評價(jià)新方法的建立3.2.2 GII 組病毒的篩選（1）實(shí)驗(yàn)方法選用 1 號（A 型），7 號（B 型），13 號（O 型）志愿者唾液按照 A:B:O=1:1:1 進(jìn)行 1000倍稀釋，對酶標(biāo)板進(jìn)行包被，4 oC 下放置過夜。PBS 清洗后，用含 1% BSA 的 PBS 封閉 1 h，再加入實(shí)驗(yàn)室已有 8 個 GII 族臨床病毒樣本的 100 倍稀釋液。對照組不加入病毒，只加入等量 PBS 即可。每組平行三次。37 oC 孵育 30 min 之后，PBS 洗滌三次后，再加入 8.5 L 含 DEPC 的 dH2O，高溫裂解釋放出核酸釋。最后

52、加入 RT-qPCR 反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR 操作，根據(jù)熒光基團(tuán)的激發(fā)光波長，檢測 HEX 通道下的熒光量。（2）結(jié)果與分析GII 組 8 個臨床病毒樣本的 RT-qPCR 檢測結(jié)果如表 3-3 所示。通過 Ct 值的比較可以得出：3009 的 Ct 值最小，即該病毒樣本中病毒滴度最高，檢測效果最好，故選用 3009 作為后續(xù)研究中 GII 組的代表病毒。8 個 GII 組臨床病毒樣本中，雖然 1021 號并未檢測出陽性結(jié)果，但并不能斷定其不是GII 組病毒。造成無陽性結(jié)果的原因，有可能是在保存病毒樣本過程中，反復(fù)凍融導(dǎo)致 1021 號的病毒粒子失去了感染活性，從而無法檢出。基于此原因，

53、決定在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將臨床病毒樣本進(jìn)行小管分裝后，取一小管儲存于 4 oC 冰箱待用，避免反復(fù)凍融。3.2.3 小結(jié)根據(jù) HuNoVs 的流行病學(xué)特征：大部分臨床病例由 GII 組引發(fā)，GI 組感染率相對較低， 并且 GII 組中的 GII.4 逐漸成為主導(dǎo)的 HuNoVs。67-70 實(shí)驗(yàn)室的 GII 組臨床樣本也多余 GI 組。通過建立的 ISC-RT-qPCR 方法，采用 A:B:O=1:1:1 進(jìn)行包被，分別對實(shí)驗(yàn)室已有的 GI 組和 GII 組臨床病毒樣本進(jìn)行篩選，通過對最后 RT-qPCR 中Ct 值的比較，找出 Ct 值最低， 即病毒滴度最高，檢測效果最好的代表病毒樣本 3010（G

54、I）和 3009（GII），以進(jìn)行后續(xù)研究。3.3 篩選親和性最強(qiáng)的唾液樣本運(yùn)用已經(jīng)篩出的臨床病毒樣本3010（GI），3009（GII）來反篩收集的 A，B，O 型人的唾液樣本，找出每種血型中親和性最強(qiáng)的唾液樣本。要篩選唾液樣本的親和性，首先應(yīng)該進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，尋找合適的病毒稀釋度。3.3.1 用 GI 組病毒樣本（3010）篩選唾液樣本（1）優(yōu)化 3010（GI）稀釋度為尋找 3010 合適的稀釋度，需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定 3010 各稀釋度下，Ct 值的大致范圍。采用唾液樣本 1 號（A 型），7 號（B 型），13 號（O 型），按照 A:B:O=1：1：1 進(jìn)行 1000倍稀釋，于 4 oC 下包被過夜。病毒樣本 3010 進(jìn)行 5 個梯度稀釋：100x，1000x，10Kx，100Kx，1Mx。同時(shí)以添加等量 PBS 溶液組為對照組。每個梯度下平行三次。記錄 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中 Ct 值，求得平均值，如表 3-4 所示。表 3-4 3010（GI）和 3009（GII）各稀釋度下的檢測效果*3010 稀釋度100x1Kx10Kx100Kx1MxCt 值33.510.7035.960.8239.000.7041.820.06-3009 稀釋度50x500x5K