響應面法優(yōu)化豆粕中大豆異黃酮的提取工藝研究

1、響應面法優(yōu)化豆粕中大豆異黃酮的提取工藝研究阮洪生，葛文中，秦學功，安紅波 黑龍江八一農墾大學生命科技學院 （大慶 163319）摘要：以豆粕為原料，以染料木素含量為指標通過單因素實驗初步得到提取工藝條件，再根據(jù)boxbenhnken的中心組合實驗設計原則，在單因素實驗的基礎上采用3因素3水平的響應面分析法，建立了大豆異黃酮含量與各影響因子的回歸方程，并得到以大豆異黃酮含量為響應值的響應面圖和等高線圖，進而得出豆粕中大豆異黃酮的最佳提取工藝條件：溫度78.94、乙醇濃度59.28 、乙醇用量為20.85：1、每次提取2h，提取2次。在此條件下，染料木素的理論提取量為12.03g/g。關鍵詞：響應

2、面法；大豆異黃酮；提取工藝大豆異黃酮是存在于大豆中的生物活性成分，主要來源于豆科植物的莢豆類，其含量最高為0.1%0.5%。目前發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，分為游離型苷元和結合型糖苷兩類1，其藥效物質為游離型的染料木素、大豆苷元和黃豆黃素?，F(xiàn)代藥理學研究表明，除具有抗氧化作用外，大豆異黃酮還可作為雌性激素治療的替代品，用于改善婦女更年期綜合癥，并具有降低血液膽固醇、防止骨質疏松及抑制癌細胞生長的作用2。此外，大豆異黃酮還具有防止心血管疾病、抗菌等多種功能，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)36。本實驗立足于我國資源優(yōu)勢，采用脫脂后的豆粕為原料提取其中的大豆異黃酮成分，適應保健食品和醫(yī)藥工業(yè)的需要，為

3、大豆的綜合利用開辟新的途徑。本實驗采用脫脂后的豆粕為原料，乙醇水溶液為溶劑，染料木素的含量為指標，根據(jù)影響有效成分提取因素，實驗中采用響應面分析法(response surface analysis)進行設計，該法利用多元二次回歸方程擬合因素與指標之間的函數(shù)關系，通過對象迎面的等值線分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。1 材料與方法1.1 原料與試劑95%乙醇，哈爾濱新春化工廠；豆粕，哈爾濱吉慶豆業(yè)有限公司；染料木素（含量測定用，純度大于99%），成都思科華生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。1.2 儀器與設備tu1800紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、恒溫水溶鍋（上海精密科學儀器有限

4、公司）、ld5a離心機（長沙英泰儀器有限公司）。1.3大豆異黃酮含量測定方法 參考文獻方法7采用染料木素為對照品的紫外分光光度法。在260nm處測得吸光度，以對照品微克x為橫坐標，以測得的吸光度值y為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程，y=0.026+3.748x, r=0.9998。1.4 單因素實驗 選取溫度、溶劑濃度、乙醇用量3個可能影響提取效果的因素做單因素實驗，以確定相關因素及各因素的合適范圍。1.5 響應面實驗 根據(jù)單因素實驗結果，選擇對大豆異黃酮提取效果有影響的因素，實驗中采用響應面分析法進行設計, 做溫度、溶劑濃度、乙醇用量的3因素3水平共17個實驗點(5個中心點)的響應面分析實

5、驗,運用sas rsreg(response surface regression)程序對17個實驗點的響應值進行回歸分析?；痦椖浚捍髴c市科研課題豆粕中大豆異黃酮的提取與精制工藝研究（sgg2005-034）。作者簡介：阮洪生（1973-），男，碩士，講師，主要從事中藥學的教學和科研工作。2 結果與分析2.1 單因素實驗2.1.1最佳乙醇濃度的確定稱取5克豆粕，提取溫度80，乙醇用量201，提取2次，每次2h，分別以50%、60%、70%、80%、95%的乙醇濃度進行提取，按照1.3含量測定條件測定其染料木素含量，結果見表1。表1 不同乙醇濃度的提取情況table1 effects of e

6、thanol concentration on the soysaponins of soybean residue乙醇濃度（）ethanol concentration 5060708095染料木素（g/g）6.3912.175.706.389.03從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著乙醇濃度的變化，染料木素的含量有一定的變化，但乙醇濃度60%時，染料木素的含量達到最高值，以60%乙醇提取較好。2.1.2最佳提取溫度的確定稱取5克豆粕，乙醇濃度60%，提取2次，每次2h，乙醇用量201，分別以提取溫度50、60、70、80、90進行提取，按照1.3含量測定條件測定其染料木素含量，結果見表2。表2 不同溫

7、度的提取情況table 2 effects of tempreture on the soysaponins of soybean residue提取溫度（）tempreture 5060708090染料木素（g/g）6.658.149.3911.699.74從表2數(shù)據(jù)可以看出，隨著提取溫度的變化，染料木素的含量也有變化，但提取溫度80時含量最高，故提取溫度確定為80。2.1.3最佳乙醇用量的確定稱取5豆粕，乙醇濃度60%，提取溫度80，分別以5：1、10：1、15：1、20：1、25：1進行提取，提取2次，每次2h，按照1.3含量測定條件測定其染料木素含量，結果見表3。表3不同物料比的提取情

8、況table 3 effects of ratio on the soysaponins of soybean residue乙醇用量（w/v）ratio 1：51：101：151：201：25染料木素（g/g）6.599.0710.6511.819.74從表3數(shù)據(jù)可以看出，隨物料比的變化，染料木素的含量有所變化，但是物料比在1：20時，染料木素的含量最高，故物料比最終確定為1：20。2.2 響應面實驗2.2.1 響應面分析法分析因素的選取及實驗結果本實驗選擇溫度、溶劑濃度、乙醇用量3個因素，做了3因素3水平共17個實驗點(5個中心點)的響應面分析實驗。表4為響應面實驗設計表，實驗數(shù)據(jù)見表5。

9、表4 提取工藝因素水平表table 4 level values of each factor水 平level因 素乙醇濃度（%）ethanol concentration(x1)乙醇用量（ w/v ）ethanol quantity (x2)提取溫度（）temperature (x3) -15015700602080170259017個實驗點可分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共有14個析因點；其二是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計實驗誤差，以染料木素的提取率為響應值，經(jīng)回歸擬合后，確定函數(shù)表達式。表5響應面實驗數(shù)據(jù)方案與結果table 5 expe

10、riment designed and the results實驗號numberx1x2x3r1（g/g）1-1-106.3366721-106.283333-1107.4300041106.040005-10-17.14667610-16.086677-1017.1900081016.5666790-1-16.786671001-110.19000110-116.37667120117.533331300011.720001400011.820001500011.883331600012.016671700012.296672.2.2模型的建立與顯著性檢驗用design expert軟件，對

11、表5中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，選擇對響應值顯著的各項，可得乙醇濃度、提取溫度()及乙醇用量（w/v）與大豆異黃酮的二次多項回歸方程：回歸方程為：y=11.947334-0.390834x1+0.676249x2-0.317918x3-3.199500x12-0.334165x2*x1-2.225334x22+0.109168x3*x1-0.561668x3*x2-2.000332x32對回歸方程進行顯著性檢驗、方差分析及各因素最佳點值分析，結果見表6、表7和表8。表6 回歸模型系數(shù)及其顯著性檢驗表table 6 regression coefficient and significance t

12、est參數(shù)項parameter自由度df回歸系數(shù)coefficient of regression標準誤差set值t valueprtintercept111.9473340.31792037.58.0001x11-0.3908340.251337-1.560.1639x210.6762490.2513372.690.0311x31-0.3179180.251337-1.260.2464x1*x11-3.1995000.346445-9.24f顯著性significance一次項35.6890790.05653.750.0680*二次項389.7334470.891059.19.0001*交互

13、項31.7562170.01741.160.3908回歸和997.1787430.964921.370.0003*失擬項33.3400001.110022.390.0058*純誤差40.2000000.0500誤差和73.5375490.505364注：*：p0.10；*：p0.05；*：p0.01；f0.01（9，7）=6.72。note: *：p0.10；*：p0.05；*：pf0.01（9，7）=6.72，因此因變量與全體自變量之間的線性關系是高度顯著的，回歸方程的決定系數(shù)r2=0.9649,說明模型能解釋96.49%響應值的變化，因而回歸方程的擬合程度很好。模型預測最大響應值為12.0

14、35808。由sas分析結果可算出各因素的最佳取值，如表8。表8各因素最佳點值分析結果table 8 analysis result of the different factor因素factor編碼coding理論值（g/g）value乙醇濃度（%）-0.07178659.28214乙醇用量（倍）0.17063220.85316提取溫度（）-0.10538178.946192.2.3模型的驗證 為了驗證豆粕中大豆異黃酮提取模型方程的適用性，在最佳的溫度、乙醇濃度、物料比的實驗水平上，重復實驗5次。從實測值看出，模型預測值與實測值吻合極好。說明用此模型指導實踐應具有非常好的效果。2.2.4 響

15、應因素水平的優(yōu)化 由回歸方程所作的響應曲面圖及其等高線圖，見圖1-圖3。通過該組圖即可對任何兩因素交互影響豆粕中大豆異黃酮提取的效應進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平范圍。圖1圖1乙醇用量與乙醇濃度對大豆異黃酮得率影響的響應面及等高線圖figure 1.three-dimensional plot and corresponding contour plot of soybean isoflavones yield at ratio of solvent to material and ethanol concentration 圖2圖2提取溫度與乙醇濃度對大豆異黃酮得率影響的響應面及等高

16、線圖figure 2.three-dimensional plot and corresponding contour plot of soybean isoflavones yield at extraction temperature and ethanol concentration 圖3圖3提取溫度與乙醇用量對大豆異黃酮得率影響的響應面及等高線圖figure 3.three-dimensional plot and corresponding contour plot of soybean isoflavones yield at extraction temperature and

17、ratio of solvent to material3 小結實驗中以染料木素含量為指標，將響應面分析法應用于豆粕中大豆異黃酮的提取工藝上，通過對實驗結果的分析比較，確定最佳工藝條件為：乙醇濃度為59.28%、提取溫度78.94、物料比20.85（w/v），在此條件下大豆異黃酮的理論含量可達12.03（g/g）。由此可見，利用乙醇提取豆粕中大豆異黃酮是一個比較理想的方法，同時實踐也證明采用響應面分析法對豆粕中大豆異黃酮的提取工藝進行優(yōu)化是非常有效的。參 考 文 獻1 崔洪斌.大豆生物活性物質的開發(fā)與應用m.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.2 song t t， gendirch s，mur

18、phy p a. estrogenic activity of glycitein，a soy isoflavonej.j. agric food chem.，1999，47：1607-1610.3 唐傳核，彭志英.抗過敏以及低過敏食品的研究進展j.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，26(4)：44-50.4 tetsu akiyama，junko ishida，et al.genistein， a specifi inhibitor of tyrosine-specific protein kinasesj.the journal of biological chemistry.1987，262（1

19、2）：5592-5595.5 韓祖斌，林華，鄧思清，等.異黃酮類植物雌性激素依拉芳對骨代謝的作用j.中國骨質疏松雜志.1999，5(3)：47.6 李曉霞，王宏雁，金華麗，等.大豆異黃酮、大豆皂甙的提取工藝研究j.中國油脂，2002，27（6）：41-44.7張玉梅，孫學斌，高旭年，等.紫外分光光度法測定大豆總異黃酮的含量j.中國食品衛(wèi)生雜志，2000，12（4）：7-8.study on extracting technology of soybean isoflavonesfrom soybean residue with rsaruan hongsheng, ge wenzhong, q

20、in xungong, an hongbo（life science and technology college, hlj august first land reclamation university , (da qing 163319)abstract：using soybean residue as a raw material. the craft was searched with the concentrate of genistein by single factor tests primarily, then according to the box-benhnken center united experimental design principles based on the single factor tests