1.基因變異與遺傳病

1、基因與遺傳病,目錄/CONTENTS,基因,01,基因變異與遺傳病,02,基因檢測技術(shù),03,01,基因,遺傳物質(zhì)是親代和子代之間傳遞遺傳信息的物質(zhì),人類的遺傳物質(zhì)是DNA（Deoxyribose Nucleic Acid，脫氧核糖核酸）,染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體。,遺傳物質(zhì)（基因）,基因在染色體上成對存在，一個(gè)在來自父親的染色體，另一個(gè)在來自母親的染色體 同源染色體：大小、形態(tài)相同，結(jié)構(gòu)基本相似一條來自父方，一條來自母方。 等位基因：位于一對同源染色體的相同位置上，控制相對性狀。,父親,母親,染色體,染色體形態(tài),根據(jù)著絲粒在染色體位置 中央著絲粒染色體， 亞中著絲粒染色體， 近端著絲粒染色

2、體。,根據(jù)染色體的長度和著絲粒的位置，分為A-G和性染色體8組 人類正常染色體表示方法：46,XY 和 46,XX,染色體分組,染色體命名,g. 1p36.2 區(qū)和帶的命名原則 長、短臂分別命名區(qū)，各區(qū)分別命名帶； 從著絲粒向遠(yuǎn)端依次以數(shù)字編號，靠近著絲粒的兩個(gè)帶分別為長、短臂的1區(qū)1帶； 做為界標(biāo)的帶為遠(yuǎn)端區(qū)第1帶。 1號染色體短臂3區(qū)6帶2亞帶,染色體與DNA,每一條染色體含有一個(gè)DNA分子。,每個(gè)DNA分子中含有成千上萬個(gè)按特定順序排列的脫氧核苷酸（A、T、G、C）序列，其中編碼蛋白質(zhì)的片段稱為基因。,DNA的分子組成,基本元素：C、H、O、N、P 基本單位：脫氧核苷酸（磷酸+脫氧核糖+

3、含氮堿基） 分為四種： 腺嘌呤脫氧核苷酸（A） 胸腺嘧啶脫氧核苷酸（T） 胞嘧啶脫氧核苷酸（C） 鳥嘌呤脫氧核苷酸（G）,堿基互補(bǔ)配對原則,DNA與基因,基因：具有遺傳效應(yīng)的DNA片段 ( 能直接或間接調(diào)控蛋白質(zhì)合成的堿基序列 ),染色體 DNA 基因,ATCG 46條染色體 22對常染色體，1對性染色體（XX/XY） 000-25,000對基因 30億個(gè)堿基對（單套染色體） 預(yù)估約180000個(gè)外顯子 基因是遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能單位,基因的結(jié)構(gòu),能轉(zhuǎn)錄并在mRNA中的序列稱為外顯子（exon） 能轉(zhuǎn)錄不在mRNA中的序列稱為內(nèi)含子(intron) 結(jié)構(gòu)基因都由若干個(gè)外顯子和內(nèi)含子組成 GT-

4、AG法則：每個(gè)內(nèi)含子的5端開始的兩個(gè)核苷酸都是GT，3端末尾的兩個(gè)核苷酸都是AG,啟動(dòng)子：位于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游100bp范圍內(nèi)，是RNA聚合酶的結(jié)合部位，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過程。 增強(qiáng)子：啟動(dòng)子上游或下游的一段DNA序列，無明顯方向性，有組織特異性，增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率。 終止子：由一段回文序列以及特定序列（PolyA）組成，回文序列為轉(zhuǎn)錄終止信號，PolyA為附加信號。,基因的結(jié)構(gòu),遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。 在某些病毒中的RNA自我復(fù)制（如煙草花葉病毒等） 在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA（某些致癌病毒） 這是基因發(fā)揮其功能的過

5、程。此過程出現(xiàn)問題則會(huì)引起遺傳性疾病。-遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容,遺傳信息的傳遞-中心法則,遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué),表觀遺傳： 在DNA或RNA序列不發(fā)生變化的基礎(chǔ)上，通過基因修飾、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA與其他分子的相互作用，基因表達(dá)狀態(tài)的可遺傳性的改變,表觀遺傳研究意義,疾病的研究,從DNA或RNA序列上尋找病因,片面的手段,序列之外的調(diào)控基因的信息 （表觀遺傳學(xué)）,全面的手段,表觀遺傳學(xué)的分子機(jī)制,DNA甲基化 RNA干擾 組蛋白修飾 染色質(zhì)改型 (ChIPRIP端粒端粒酶),DNA甲基化,研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式。主要是基因組DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基間的共價(jià)結(jié)合，胞嘧

6、啶由此被修飾為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC),DNA甲基化,發(fā)生時(shí)間： DNA復(fù)制之后、轉(zhuǎn)錄之前 主要形式,原核生物： CCA/TGG和GATC常被甲基化,真核生物：甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,DNA甲基化的功能,細(xì)胞開閉基因表達(dá)的一種方式，基因表達(dá)水平一般與其甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。 例： DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則可能使基因過度表達(dá)，進(jìn)而引起腫瘤或癌癥的發(fā)生。如促腫瘤生長因子IGF2基因過度表達(dá)會(huì)引發(fā)大腸癌。,02,基因變異與遺傳病,數(shù)目異常,結(jié)構(gòu)異常,整倍性改變,非整倍性改變,單倍體 二倍體 四倍體,亞二倍體型 超二倍體型 單體型、三體型,缺失、重復(fù)

7、、易位、倒位、插入、移位、轉(zhuǎn)位、環(huán)狀染色體、等臂染色體、雙著絲粒染色體,染色體,染色體水平變異,單堿基變異類型,同義突變|synonymous 由于密碼子的簡并性 突變不造成氨基酸的改變 錯(cuò)義突變|missense 突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化 無義突變|nonsense 突變?yōu)榻K止密碼子 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止 剪接突變|splicing 影響了正常的RNA剪接,常染色體遺傳疾病 性連鎖遺傳疾病 線粒體遺傳病,單基因疾病的分類,人類單基因疾病性狀相關(guān)的基因位于不同的遺傳載體上 染色體上的基因按孟德爾遺傳模式傳遞,致病基因和突變情況各異（多個(gè)致病基因，多個(gè)突變位點(diǎn)） 基因型與表型的關(guān)系表現(xiàn)出復(fù)雜性（顯隱性

8、關(guān)系的相對性，環(huán)境的影響） 發(fā)病的分子機(jī)制復(fù)雜多樣（信號通路，補(bǔ)償機(jī)制）,按基因位置分類,線粒體遺傳,母系遺傳,閾值效應(yīng),單基因遺傳病現(xiàn)狀 部分高發(fā)疾病危害大,表1 幾種高發(fā)的單基因遺傳病 1-3,1/books 2Xu, et al. J Clin Pathol 2004,57:517-22. 3Xiong, et al. Clin Genet 2010, 78:139-48,03,基因檢測方法簡介,03,基因檢測技術(shù),遺傳病體外診斷技術(shù)的發(fā)展過程,1.首先獲得需要測序的目的片段，然后以目的片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，除PCR必須的要素外，加入一定量

9、的帶熒光標(biāo)記的ddNTP。,2.ddNTP 被加到正在合成的鏈上，由于它的3-OH已被氧化，下一個(gè)dNTP的5-磷酸基團(tuán)不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。,3.在引物等延伸反應(yīng)過程中，ddNTP在不同位置摻入，產(chǎn)生了一系列不同長度的新的DNA片段。,4.通過毛細(xì)管電泳分離DNA片段，激光激發(fā)熒光，具有熒光標(biāo)記的DNA片段在檢測窗口被檢測。,一代測序技術(shù)原理（Sanger）,二代測序技術(shù)原理1,建庫：全基因組測序文庫構(gòu)建過程,建庫：目標(biāo)區(qū)域捕獲（全外及panel）過程,二代測序技術(shù)原理2,上機(jī)測序,二代測序技術(shù)原理3,三代測序技術(shù)原理-Pacbio,DNA甲基化的檢測,概括起來可分為三類：,基

10、因組整體水平的甲基化檢測 基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測 新甲基化位點(diǎn)的尋找,MS-MLPA檢測技術(shù)-特異位點(diǎn),甲基化目標(biāo)序列,第一種情況：目標(biāo)序列沒有甲基化 連接 + 酶切 不擴(kuò)增,未甲基化目標(biāo)序列,1. 變性雜交,檢測探針能夠進(jìn)行連接但連接產(chǎn)物被酶切,3. 不能進(jìn)行擴(kuò)增,2. 連接并用識別甲基化的限制性內(nèi)切酶酶切,1. 變性雜交,2.連接并用識別甲基化的限制性內(nèi)切酶酶切,檢測探針能夠進(jìn)行連接且連接產(chǎn)物不會(huì)被酶切,3. 能夠進(jìn)行擴(kuò)增,第二種情況： 目標(biāo)序列甲基化 連接+不酶切 能夠擴(kuò)增,變性 樣品DNA在98度下加熱10分鐘。. 2. 雜交 往變性后的樣品中加入 SALSA 探針混合液和MLPA 緩沖液?；旌象w系在95度下加熱1分鐘后在60度下溫浴雜交16個(gè)小時(shí)。 連接（分兩部分進(jìn)行 常規(guī)連接 在雜交產(chǎn)物中加入連接酶混合液在54度下溫浴連接15分鐘 。98度加熱5分鐘使連接酶失活。 甲基化檢測連接 在雜交產(chǎn)物中加入連接酶混合液和HhaI酶（識別非甲基化的GCGC）,在49度下溫浴連接30分鐘 。 98度加熱5分鐘使連接酶失活。 4. PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 執(zhí)行P