公開課 分解纖維素的微生物的分離

1、JLSSY BYH,纖維素與纖維素酶,1.纖維素,纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。,一、基礎(chǔ)知識,植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。,土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。,纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。,在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。,人類可應(yīng)用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄

2、物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。,2.纖維素酶 纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。,C1酶：外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個葡萄糖 分子，產(chǎn)生纖維二糖 CX酶：內(nèi)切酶，使纖維素?cái)嗔殉善瑪唷?葡萄糖苷酶：將纖維二糖分解成葡萄糖。,取二支20mL的試管,實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn),各加入一張濾紙條,各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液11ml和10ml,甲 乙,在乙試管中加入1mL纖維素酶,兩支試管固定在錐形瓶中，放在 140r/min

3、的搖床上振蕩1h,結(jié)果：乙試管的濾紙條消失,討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？,提示： 本實(shí)驗(yàn)的自變量是纖維素酶的有無，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的pH。,實(shí)驗(yàn)分析：P27的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對照的？,剛果紅染色法,剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。,（二）纖維素分解菌的篩選,當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成

4、，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。,二、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì),請你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。,分布環(huán)境,1、土壤取樣：,富含纖維素的環(huán)境中,操作步驟,生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。,原因,實(shí)例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。,討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？,將濾紙埋在土壤中

5、能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。,2、選擇培養(yǎng),增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。,目的：,制備選擇培養(yǎng)基：,操作：,將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)12天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。,培養(yǎng)基成分分析,提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。,A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？,是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）,B、這個培養(yǎng)基對

6、微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？,有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。,C、你能否設(shè)計(jì)一個對照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用,說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。,在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。,為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？,將細(xì)菌涂布在只有 尿素

7、做氮源的選擇 培養(yǎng)基上,將細(xì)菌涂布在只有 纖維素粉做碳源的 選擇培養(yǎng)基上,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,篩選菌株,選擇培養(yǎng),思考：本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？,本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。,按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101107倍。,3.梯度稀釋,4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng) 基上,（1）制備鑒別培養(yǎng)基:,（2）涂布平板： 將稀釋度為104106的菌懸液各取

8、0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)。,鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基,(水溶性羧甲基纖維素鈉),方法一：先 ，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。 方法二：在 時就加入剛果紅。,培養(yǎng)微生物,倒平板,5.剛果紅染色法,挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。,這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？,顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用,操作繁瑣 剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜,操作簡便不存在菌落混雜問題,1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。,在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng) 中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素 分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基 的堿性增強(qiáng)，pH升高。在培 養(yǎng)基中加入酚紅指

9、示劑，如 果pH升高指示劑會變紅,剛果紅可以與纖維素形成 紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被 纖維素酶催化分解后紅色 復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基 上就會出現(xiàn)以纖維素分解 菌為中心的透明圈,觀察菌落周圍是否有著色的 環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌,觀察菌落周圍是否出現(xiàn) 透明圈來篩選纖維素分解菌,脲酶檢測法,剛果紅染色法,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去

10、，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！,在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C 370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。,6、純化培養(yǎng),四、結(jié)果分析與評價,1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。 2.分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。,為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_ _實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有_ 發(fā)酵和_ 發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素